Summary
Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.
Abstract
Si è registrato un aumento dell'utilizzo di modelli intestinali in vivo e in vitro per lo studio della fisiopatologia delle malattie infiammatorie intestinali, per lo screening farmacologico di sostanze potenzialmente benefiche e per studi di tossicità su componenti alimentari potenzialmente dannosi. Di rilievo è l'attuale domanda di sviluppo di modelli in vitro basati su cellule per sostituire i modelli animali. Qui, viene presentato un protocollo per un modello di base equivalente intestinale tridimensionale (3D) di "tessuto sano" utilizzando linee cellulari con il duplice vantaggio di fornire sia semplicità sperimentale (sistema standardizzato e facilmente ripetibile) che complessità fisiologica (enterociti Caco-2 con una componente immunitaria di supporto dei monociti U937 e dei fibroblasti L929). Il protocollo include anche l'inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio ottico degli equivalenti intestinali fissi, fornendo così il vantaggio di analizzare più parametri visivi da un singolo esperimento. Le sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) che mostrano le cellule colonnari Caco-2 che formano un monostrato stretto e regolare nei trattamenti di controllo sono utilizzate per verificare l'efficacia del modello come sistema sperimentale. Utilizzando il glutine come componente alimentare pro-infiammatorio, i parametri analizzati dalle sezioni includono la riduzione dello spessore del monostrato, nonché l'interruzione e il distacco dalla matrice sottostante (H & E), la diminuzione dell'espressione proteica della giunzione stretta come mostrato dalla colorazione dell'occludina (quantificabile statisticamente) e l'attivazione immunitaria delle cellule U937 in migrazione come evidenziato dalla colorazione del cluster di differenziazione 14 (CD14) e dalla differenziazione correlata a CD11b in macrofagi. Come dimostrato dall'uso del lipopolisaccaride per simulare l'infiammazione intestinale, ulteriori parametri che possono essere misurati sono l'aumento della colorazione del muco e l'espressione di citochine (come midkine) che possono essere estratte dal terreno prima della fissazione. Il modello tridimensionale di base (3D) della mucosa intestinale e le sezioni fisse possono essere consigliati per studi sullo stato infiammatorio e sull'integrità della barriera con la possibilità di analizzare molteplici parametri visivi quantificabili.
Introduction
La barriera epiteliale intestinale, un rivestimento interno spesso una cellula contenente diversi tipi di cellule epiteliali, costituisce la prima barriera fisica difensiva o interfaccia tra l'ambiente esterno e quello interno del corpo 1,2. Gli enterociti di tipo colonnare costituiscono il tipo più abbondante di cellule epiteliali. Questi sono responsabili del mantenimento dell'integrità della barriera epiteliale attraverso le interazioni tra diversi componenti della barriera, comprese le giunzioni strette (TJ), svolgendo un ruolo significativo nel rafforzamento della barriera 1,3. La struttura TJ è costituita da proteine della placca intracellulare, come zonula occludens (ZO) e cingulin, che cooperano con proteine transmembrana, tra cui occlusine, claudine e molecole di adesione giunzionale (JAM) che formano una struttura a cerniera che collega strettamente le cellule vicine 3,4. Le proteine transmembrana regolano la diffusione paracellulare passiva di piccoli composti ed escludono le grandi molecole tossiche.
I composti alimentari potenzialmente tossici e i contaminanti alimentari stimolano la produzione di citochine infiammatorie che interrompono la permeabilità epiteliale, attivando le cellule immunitarie e causando infiammazione cronica dei tessuti intestinali 5,6,7. Al contrario, è stato riportato che varie sostanze fitochimiche antiossidanti e antinfiammatorie riducono l'espressione delle citochine infiammatorie e migliorano l'integrità della barriera TJ intestinale attraverso il ripristino dell'espressione e dell'assemblaggio della proteina TJ 4,6,8. Pertanto, la regolazione dell'integrità della barriera epiteliale da parte di composti sia benefici che dannosi ha visto un aumento dell'uso di modelli sia in vivo che in vitro volti a mimare la barriera intestinale per lo screening farmaceutico e gli studi di tossicità. Ciò è particolarmente rilevante dato il crescente interesse per la comprensione della fisiopatologia delle malattie intestinali intestinali (IBD), dell'enterocolite necrotizzante e del cancro, che possono essere simulate nei modelli sperimentali 8,9,10.
C'è stata una richiesta per lo sviluppo di modelli in vitro basati su cellule al fine di raggiungere l'obiettivo delle "3R" nella sperimentazione animale. Questi includono alternative sostitutive all'uso di animali, riduzione del numero di animali utilizzati e perfezionamento nell'adozione di metodi che alleviano il disagio 11,12,13. Inoltre, i meccanismi molecolari, cellulari e fisiologici sottostanti tra modelli umani e murini (i roditori sono le specie più utilizzate) sono distintivi, portando a controversie sull'efficacia dei modelli murini come predittori nelle risposte umane12,13. Numerosi vantaggi dei modelli in vitro di linee cellulari umane includono la sperimentazione con target ristretto, l'osservazione diretta e l'analisi continua13.
I monostrati di tipo a cellula singola in colture bidimensionali (2D) sono serviti come potenti modelli. Tuttavia, questi non possono riprodurre con precisione la complessità fisiologica dei tessuti umani 8,13,14. Di conseguenza, i sistemi di coltura 3D vengono sviluppati con miglioramenti sempre crescenti per ricapitolare la complessità fisiologica dei tessuti intestinali sani e malati come strumenti di valutazione del rischio di nuova generazione13,14. Questi modelli includono scaffold 3D Transwell con diverse linee cellulari, colture di organoidi e dispositivi microfluidici (intestino su chip) che utilizzano sia linee cellulari che organoidi (derivati da tessuti sani e malati)8,13,14.
Il protocollo intestinale equivalente 3D di "tessuto sano" presentato nel presente studio si basava sul raggiungimento di un equilibrio tra complessità fisiologica e semplicità sperimentale13. Il modello è rappresentativo di uno scaffold 3D Transwell, composto da tre linee cellulari (enterociti [la linea di adenocarcinoma del colon Caco-2] con una componente immunitaria di supporto [monociti U937 e fibroblasti L929]), costituenti un sistema standardizzato e facilmente ripetibile applicabile per lo screening preliminare di molecole dietetiche di interesse per l'integrità della barriera epiteliale intestinale e la risposta immunitaria. Il protocollo include l'inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio dell'integrità della barriera epiteliale utilizzando equivalenti intestinali fissi. Il vantaggio dell'approccio attuale è che numerose sezioni dei tessuti incorporati possono essere colorate per più parametri da un singolo esperimento.
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Protocol
1. Preparazione del modello di base della mucosa intestinale ricostruita in 3D
NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita in una cappa sterile a flusso laminare. Tutte le fasi della procedura che prevedono l'uso dell'incubatore cellulare implicano l'incubazione delle colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 (salvo diversa indicazione nel protocollo).
- Preparazione preliminare delle linee cellulari utilizzate nel sistema modello intestinale
- Seminare cellule di fibroblasti di topo L929 a una concentrazione di 5 x 105 in 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 2 mM di L-glutammina, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (Pen-Strep) in un matraccio F25 e coltivarlo in un'incubatrice 4 giorni prima della costruzione dei modelli intestinali. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno utilizzando una pipetta. Quindi aggiungere terreno fresco (5 ml) e incubare ulteriormente le cellule per 48 ore.
NOTA: Le celle devono essere confluenti all'80% prima di essere utilizzate. - Seminare le cellule di Caco-2 (concentrazione di 2 x 106) in 10 mL di terreno DMEM (con il 10% di FBS e l'1% di Pen-Strep) in un matraccio di cellule F75 e coltivarlo in un incubatore 4 giorni prima della costruzione del modello di mucosa intestinale. Dopo 48 ore, cambiare il terreno come descritto al punto 1.1.1 e incubare ulteriormente per 48 ore fino a una confluenza dell'80%.
NOTA: Le cellule devono essere in fase di proliferazione attiva: né troppo rade né troppo confluenti. Si consiglia una confluenza del 50-60%. Le cellule non devono essere seminate il giorno prima di realizzare il modello perché questo potrebbe rallentare la capacità proliferativa delle cellule, che poi non attecchirebbero perfettamente nel modello 3D ricostruito. - Aggiungere le cellule U937 che crescono in sospensione (concentrazione di 1 x 106) a 10 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenente 2 mM di L-glutammina, 1% piruvato di sodio, 10% FBS e 1% Pen-Strep) in un matraccio F75 2 giorni prima della messa a punto del modello e porre in un incubatore per 48 ore.
- Seminare cellule di fibroblasti di topo L929 a una concentrazione di 5 x 105 in 5 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 2 mM di L-glutammina, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (Pen-Strep) in un matraccio F25 e coltivarlo in un'incubatrice 4 giorni prima della costruzione dei modelli intestinali. Dopo 48 ore, rimuovere il terreno utilizzando una pipetta. Quindi aggiungere terreno fresco (5 ml) e incubare ulteriormente le cellule per 48 ore.
- Preparazione degli inserti per piastre di co-coltura Transwell
- Selezionare una piastra a 24 pozzetti contenente inserti con filtri da 0,4 μm.
NOTA: Il filtro da 0,4 μm è una scelta standard negli studi sul trasporto di farmaci. Le dimensioni del filtro da 3 μm e 8 μm non sono raccomandate per prevenire possibili perdite delle cellule incorporate nel collagene. - Utilizzando una pipetta, idratare i filtri Transwell (d'ora in poi denominati inserti a membrana) con 500 μL di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hanks sotto e sopra l'inserto del filtro.
- Chiudere la piastra a più pozzetti e metterla in un'incubatrice per almeno 2 ore.
NOTA: Gli inserti a membrana possono rimanere nell'HBSS per un massimo di 24 ore. Questa operazione può essere eseguita il giorno prima della costruzione del modello. È importante che gli inserti della membrana siano completamente idratati e che il filtro non si asciughi, in quanto ciò potrebbe rendere più difficile la corretta adesione del campione. - Rimuovere le piastre dall'incubatrice dopo 2 h (o 24 h). Aspirare con cautela l'HBSS da sopra e sotto gli inserti della membrana utilizzando una pipetta e lasciarlo asciugare per 10 minuti.
- Selezionare una piastra a 24 pozzetti contenente inserti con filtri da 0,4 μm.
- Preparazione della lamina propria di collagene priva di cellule del sistema modello intestinale 3D di base (GIORNO 1)
- Preparare una soluzione di collagene privo di cellule in una provetta sterile da 50 mL su ghiaccio contenente i seguenti componenti in DMEM: 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 mM di L-glutammina, 1% bicarbonato di sodio e 1,35 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo 1.
NOTA: Tutti questi componenti devono essere mantenuti in ghiaccio e aggiunti al DMEM con puntali per pipette raffreddati. Il collagene della coda di ratto di tipo 1 deve essere aggiunto per ultimo poiché polimerizza con l'aumentare della temperatura e del pH. La quantità di soluzione di collagene libero da cellule preparata dipenderà dal numero di equivalenti intestinali richiesti. - Aggiungere 250 μL di soluzione a ciascun inserto per piastre (sopra il filtro a membrana) per il numero di equivalenti intestinali selezionati e posizionare il coperchio sulla piastra a più pozzetti. Lasciare polimerizzare la soluzione di collagene a temperatura ambiente (RT) sotto la cappa a flusso laminare.
NOTA: A parte il passaggio ad una fase più solida, la polimerizzazione è evidente anche da un cambiamento di colore dal giallo al rosa. La polimerizzazione è solitamente completa entro 10-15 minuti.
- Preparare una soluzione di collagene privo di cellule in una provetta sterile da 50 mL su ghiaccio contenente i seguenti componenti in DMEM: 10% di siero fetale bovino (FBS), 200 mM di L-glutammina, 1% bicarbonato di sodio e 1,35 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo 1.
- Preparazione, conteggio cellulare e aggiunta di cellule di fibroblasti (L929) e monociti (U937) al sistema modello (GIORNO 1)
- Rimuovere la coltura cellulare L929 (fase 1.1.1) dall'incubatore. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il terreno, sostituirlo con 5 mL di soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS; senza Ca e Mg) e risciacquare le cellule.
- Aspirare il PBS utilizzando una pompa a vuoto. Aggiungere 2 mL di una soluzione di tripsina-EDTA pre-preparata (0,05% di tripsina e 0,02% di EDTA in PBS) e porre in un'incubatrice per 3-5 minuti.
- Utilizzare un microscopio invertito (ad esempio, un Eclipse Ts2, Nikon) per stabilire se le cellule si stanno staccando dalla superficie di adesione. In tal caso, aggiungere immediatamente 2 ml di DMEM (contenente il 10% di FBS) per bloccare la reazione della tripsina e sciacquare le cellule.
- Trasferire la soluzione cellulare in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare a 645 x g per 5 min. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il surnatante.
NOTA: È necessario fare attenzione a non disturbare il pellet. L'effetto del DMEM è stato testato sulle cellule L929 e U937 e non ha dimostrato di avere effetti avversi sulla crescita. - Aggiungere 1 mL di DMEM al pellet e sospendere le cellule.
NOTA: Le cellule devono essere sospese in modo omogeneo nella soluzione. - Rimuovere 20 μL di cellule in DMEM e aggiungere 20 μL di soluzione blu di Trypan. Rimuovere 20 μL della miscela e valutare la densità cellulare al microscopio utilizzando una camera di conteggio delle cellule.
- Rimuovere la coltura cellulare U937 (fase 1.1.3) dall'incubatore. Centrifugare la soluzione cellulare a 645 x g per 5 min. Utilizzando una pompa a vuoto, aspirare il surnatante per evitare di disturbare il pellet.
- Sospendi le cellule in 1 mL di RPMI. Come per le celle L929, assicurarsi che le cellule siano sospese in modo omogeneo nella soluzione.
- Allo stesso modo, stabilire la densità cellulare come riportato al punto 1.4.6.
- Preparare una soluzione di collagene come descritto al punto 1.3.1.
NOTA: La quantità di soluzione da preparare deve tenere in considerazione 450 μL per ogni inserto (o modello). - Preparare una soluzione di DMEM contenente un conteggio di 50.000 cellule L929 e 15.000 cellule U937, rispettivamente, in un volume di 50 μL per ciascun modello intestinale equivalente da costruire.
NOTA: il numero di celle è un fattore critico. Troppi di entrambi i tipi di cellule si tradurrebbero in una lamina propria eccessivamente piena di cellule che non sarebbero adeguatamente organizzate. Un numero inferiore di fibroblasti (che generano collagene) si tradurrebbe in una lamina propria meno compatta, mentre un numero troppo basso di monociti ostacolerebbe la risposta immunitaria agli stimoli. A condizione che sia presente il corretto conteggio delle cellule all'interno di ogni aliquota da 50 μL, è possibile preparare un volume totale di 600 μL per i 12 inserti filtranti presenti in ciascuna piastra a 24 pozzetti. - Aggiungere ciascuna aliquota da 50 μL contenente le cellule a 450 μL di soluzione di collagene al punto 1.4.10. Mescolare accuratamente.
- Sovrapporre la lamina propria di collagene priva di cellule prerivestita con 500 μL di soluzione cellulare contenente collagene per ciascun modello.
NOTA: È importante aggiungere rapidamente i volumi a ciascun inserto e, pertanto, è consigliabile limitare il numero di modelli di mucosa intestinale ricostruiti a 12 o meno alla volta. - Chiudere la piastra e metterla in un'incubatrice per 2 ore per consentire alla soluzione di solidificarsi.
- Preparazione, conteggio cellulare e aggiunta di cellule epiteliali Caco-2 al modello intestinale (GIORNO 1)
- Rimuovere la coltura cellulare Caco-2 (passaggio 1.1.2) dall'incubatore. Ripetere le procedure dal punto 1.4.1 utilizzando 10 mL di PBS per il risciacquo preliminare. Quindi aggiungere 5 mL di una soluzione di tripsina-EDTA pre-preparata (0,05% di tripsina e 0,02% di EDTA in PBS privo di Ca e Mg) e porre in un'incubatrice per 5-8 minuti.
- Ripetere i passaggi da 1.4.3 (ma utilizzando 5 mL di DMEM per bloccare la reazione alla tripsina) fino a 1.4.6 per contare le cellule utilizzando la camera di conteggio delle cellule.
- Preparare una soluzione di DMEM per contenere un conteggio di 150.000 cellule Caco-2 in 50 μL.
NOTA: Il numero di celle utilizzate è un punto critico. Superare le 150.000 cellule potrebbe portare ad uno strato epiteliale compatto e disorganizzato, mentre con troppo poco (meno di 100.000), le cellule faticano a crescere e non coprono adeguatamente la membrana basale creando uno strato epiteliale intestinale discontinuo. Assicurati che le celle siano effettivamente sospese. La punta di una pipetta da 200 μL può essere utilizzata per garantire una distribuzione omogenea. Dato che è possibile costruire 12 modelli in qualsiasi momento, è possibile preparare una soluzione di celle da 600 μL. - Dopo le 2 ore richieste nel passaggio 1.4.14, aggiungere 50 μL di cellule Caco-2 sospese in DMEM al centro di ciascuna membrana basale. Chiudere il coperchio della piastra a più pozzetti.
- Incubare sotto la cappa sterile a flusso laminare per 10 min. Quindi trasferire nell'incubatrice per 30 min.
- Preparare una soluzione DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di Pen/Strep.
NOTA: Preparare una soluzione sufficiente per utilizzare un volume di 1 mL per modello. - Aggiungere 500 μL di mezzo sopra il modello ricostruito e 500 μL sotto il filtro.
NOTA: È necessario prestare attenzione quando si aggiunge il mezzo sopra il filtro per evitare di staccare o stressare le celle. - Chiudere il sistema di piastre a più pozzetti e posizionarlo nell'incubatrice.
- Preparazione/formazione e utilizzo del modello (dal GIORNO 2 al GIORNO 6)
- GIORNO 2: Rimuovere con cautela la soluzione sia sopra il modello ricostruito che sotto il filtro utilizzando una pipetta. Sostituire con 500 μL di DMEM fresco (10% FBS e 1% Pen/Strep) rispettivamente sopra e sotto il filtro.
- GIORNO 3: Ripetere come sopra nel passaggio 1.6.1.
- GIORNO 4: Ripetere come sopra nel passaggio 1.6.1.
NOTA: Questo modello intestinale è un modello cellulare statico; Pertanto, per favorire il rilascio di molecole e la crescita e la stimolazione delle cellule, è molto importante che il mezzo venga cambiato ogni giorno. - GIORNO 5: A questo punto, il modello è completamente formato/sviluppato. Utilizzare questi modelli per ulteriori studi.
NOTA: Il momento migliore per utilizzare il modello è a 5 giorni. Sebbene le cellule possano essere mantenute in un'incubatrice per periodi più lunghi, più tempo passa, maggiore è la probabilità che le cellule epiteliali possano crescere in modo incontrollato, risultando in uno strato disorganizzato e compatto difficile da utilizzare. - A 5 giorni, incubare i modelli con componenti tossici (glutine o lipopolisaccaride [LPS]) o benefici (polifenoli) di interesse. Aggiungerli alla parte superiore del modello ricostruito sospeso nel supporto DMEM.
NOTA: La concentrazione appropriata di ciascun componente di interesse deve essere calcolata e sospesa in un mezzo DMEM. I controlli non trattati contenenti solo terreno DMEM devono essere impostati per il confronto con i modelli sperimentali. - Incubare i modelli di controllo e sperimentali per 24 ore in un incubatore.
- GIORNO 6: Rimuovere il terreno sopra e sotto il filtro con una pipetta.
NOTA: Il terreno può essere conservato per successivi test di tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) per misurare il rilascio di citochine infiammatorie. A tale scopo, il terreno deve essere aggiunto a fiale sterili e conservato a -20 ° C per ulteriori analisi.
2. Inclusione in paraffina dei modelli di mucosa intestinale ricostruita
NOTA: L'intera procedura deve essere eseguita sotto una cappa chimica. Ogni passaggio e la rispettiva assegnazione del tempo devono essere rigorosamente rispettati. Per questo motivo, è importante che tutti i reagenti siano preparati in anticipo.
- Impostare la macchina per paraffina a 58 °C in modo che sia pronta per l'uso.
- Trasferire gli inserti della membrana nei pozzetti puliti utilizzando una pinza in una piastra sterile da 24 pozzetti.
- Aggiungere 500 μL di formalina tamponata al 37% in PBS sopra il filtro e 1 mL sotto il filtro. Chiudere il coperchio e lasciarlo sotto la cappa chimica per 2 ore a RT.
NOTA: In alternativa, la formalina tamponata al 4% può essere utilizzata a RT per 1 ora. - Rimuovere la formalina e aggiungere la soluzione HBSS sia sopra che sotto il filtro. Quindi rimuovere l'HBSS.
- Staccare la lamina propria dall'inserto della membrana.
NOTA: Le cellule della mucosa intestinale di solito si staccano molto facilmente dall'inserto di membrana in quanto non sono attaccate a quest'ultimo. Inoltre, i due compartimenti del campione (apicale e basale) rimangono attaccati, mantenendo la struttura 3D. Se, per qualche motivo, non vengono facilmente staccati, sarà importante utilizzare una lama per bisturi sterile monouso per rimuovere la mucosa intestinale dall'inserto della membrana. L'inserto a membrana può essere tagliato, staccandolo così dalla plastica. Fare attenzione a non toccare mai il campione con il bisturi. Il motivo per rimuovere l'inserto di membrana dalle cellule incorporate nel collagene è che questo filtro può staccarsi nelle successive fasi di fissazione o di inclusione della paraffina, rendendo sproporzionati i confronti tra i modelli di mucosa intestinale. Inoltre, gli inserti a membrana all'interno della sezione incorporata hanno una consistenza diversa che può interferire con il sezionamento. - Posizionare i becher da 100 ml sotto la cappa di aspirazione chimica, ciascuno correttamente etichettato per includere un sistema modello di mucosa intestinale ricostruito in esame. Aggiungere 25 ml di ETOH al 35% in ciascun becher e quindi aggiungere la mucosa intestinale ricostruita. Incubare per 10 min.
- Sostituire l'etanolo al 35% con 25 ml di etanolo al 50% e incubare per 10 min.
- Sostituire l'etanolo al 50% con 25 ml di etanolo al 70% e incubare per 10 minuti.
- Sostituire l'etanolo al 70% con 25 ml di etanolo all'80% e incubare per 10 minuti.
- Sostituire l'etanolo all'80% con 25 ml di etanolo al 95% e incubare per 10 minuti.
- Sostituire l'etanolo al 95% con 25 ml di etanolo al 100% e incubare per 10 minuti.
- Sostituire l'etanolo al 100% con un altro cambio di etanolo al 100% da 25 ml e incubare per 10 minuti.
- Posizionare becher da 100 ml sotto la cappa aspirante, ciascuno correttamente etichettato per includere un modello in esame. Aggiungere 50 ml di xilene o un agente di pulizia istologica per 10-20 minuti.
NOTA: Si consiglia l'uso di Histo-Clear (agente di pulizia istologica) in quanto migliora la chiarezza e la vivacità delle colorazioni acidofile. Il tempo di pulizia può variare da un campione di mucosa intestinale ricostruito all'altro e deve essere controllato per la trasparenza dell'aspetto ogni 2-3 minuti. - Non appena i campioni sono trasparenti, metterli in un portacassette di tessuto metallico che viene poi immerso in paraffina liquida all'interno della macchina riscaldata per 45 minuti.
- Cambiare la paraffina e lasciare i campioni all'interno della macchina riscaldata per altri 45 minuti.
- Rimuovere il supporto per cassetta di carta e metterlo su ghiaccio a raffreddare. Quando i blocchi di campioni raffreddati si staccano dal supporto metallico, questi possono essere ulteriormente raffreddati a temperatura ambiente.
- Conservare i blocchi su RT.
NOTA: Se l'obiettivo è quello di preparare immediatamente le sezioni, i blocchi possono essere posizionati a 4 ° C in modo che siano ben raffreddati durante l'uso. - Tagliare sezioni di 4 μm utilizzando un microtomo.
- Adagiare le sezioni tagliate su vetrini e asciugarle in forno a 37°C per 24 h.
- Le guide sono pronte per l'uso. Conservarli a RT fino a quando non si esegue la colorazione istologica H&E o la colorazione della reazione immuno-istochimica (tipo antigene-anticorpo).
- Per la colorazione immuno-istochimica, selezionare gli anticorpi di interesse (sia per lo studio delle proteine TJ come l'occludina che per l'attivazione, la migrazione e la differenziazione dei monociti) e rilevare l'espressione (tramite colorazione) utilizzando kit commerciali.
- Allo stesso modo, misurare il muco utilizzando il kit di colorazione Alcian blue e periodic acid-Schiff (PAS).
- Quantificare le proteine TJ colorate di interesse, come l'occlusina, calcolando la percentuale di pixel positivi su micrografie prese dal microscopio.
- Analizzare le immagini delle cellule utilizzando un software di analisi delle immagini (ad esempio, il software ImageJ2 [Wayne Rasband, versione 2.9.0/1.53t]).
- Per eseguire l'analisi dei pixel, elaborare le immagini digitali a 300 pixel/pollice e convertirle in 8 bit. Quindi, elabora le immagini binarie tramite il plug-in Color Deconvolution per analizzare la colorazione della proteina di interesse, in questo caso, la colorazione rossa permanente dell'occlusina.
- Salvare l'immagine selezionata come file tiff e sottoporla a una procedura di "pulizia" per eliminare gli artefatti con un editor grafico (ad esempio, Adobe PhotoshopCC [versione 20.0.4]).
- Successivamente, misurare tutti i campi di interesse con l'applicazione Analyze Particle of ImageJ2 e riportare i dati come numero di pixel.
NOTA: Ogni esperimento deve essere eseguito in triplice copia con tre campi di replica interni analizzati per ogni replica. Per quantificare il muco, lo stesso principio di misurazione dei pixel può essere applicato alle immagini scattate rispettivamente delle mucine neutre colorate di viola-magenta e del muco acido colorato di blu brillante.
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Representative Results
Il primo aspetto importante è quello di determinare l'accettabilità della mucosa intestinale equivalente 3D di base a scopo sperimentale. Questo viene eseguito con il colorante più utilizzato nei laboratori di istologia e istopatologia, ovvero l'ematossilina (colora il materiale nucleare di colore blu-viola intenso) e l'eosina (colora il materiale citoplasmatico di varie tonalità di rosa). La colorazione H&E viene prima eseguita su un controllo non trattato, che viene coltivato nelle stesse condizioni e negli stessi tempi dei trattamenti sperimentali. Dalla visualizzazione del modello, della forma e della struttura delle cellule, il successo di questo sistema di modelli cellulari intestinali è determinato dalle cellule Caco-2 che formano un monostrato stretto e regolare sopra la lamina propria ricca di matrice extracellulare (ECM) dopo 5 giorni (Figura 1A). Esempi di sistemi modello che sarebbero ritenuti inaccettabili per ulteriori analisi includono quelli che mostrano una crescita eccessiva con strati epiteliali disorganizzati, come mostrato dopo 10 giorni (Figura 1B). Un ulteriore esempio è uno strato epiteliale troppo spesso e disorganizzato (Figura 1C), causato dalla semina di cellule Caco-2 in eccesso o da un'eccessiva incubazione. La malformazione (Figura 1D), attribuibile sia a cellule di semina che non erano in una fase attiva di proliferazione, sia a problemi nella preparazione della lamina propria o durante la fissazione con paraffina (cellule si sono staccate/rovinate), è anche un esempio di inaccettabile ricostruzione della mucosa intestinale. Altrettanto inaccettabile è la mancanza di formazione di strati epiteliali (Figura 1E), indicativa della semina di un numero troppo esiguo di cellule Caco-2 o di problemi nella preparazione della lamina propria. Utilizzando equivalenti intestinali 3D accettabili, da cui è possibile generare più sezioni, è quindi possibile studiare vari parametri da un singolo esperimento.
Tra i vari parametri che possono essere analizzati, è possibile visualizzare l'integrità della barriera in risposta agli induttori pro-infiammatori e colorare e quantificare le proteine TJ e confrontarle con i sistemi modello di controllo non trattati. Qui dimostriamo l'effetto pro-infiammatorio di 40 μg/mL di proteine totali del grano da una fonte di grano duro con un alto contenuto di glutine7, sia sull'integrità cellulare che sul contenuto proteico dell'occlusina TJ (Figura 2A). Utilizzando la colorazione istologica H&E, il sistema del modello di controllo mostra le cellule colonnari Caco-2 che formano un monostrato stretto e regolare. Al contrario, è stato dimostrato che l'effetto del campione di proteine contenenti glutine causa la rottura del monostrato, con una colorazione più aspecifica dell'eosina (Figura 2A). Inoltre, lo spessore dello strato epiteliale può essere misurato e si è dimostrato significativamente ridotto dopo l'esposizione al glutine pro-infiammatorio (Figura 2A,B). Utilizzando un anticorpo contro l'occludina (coniugato alla colorazione del cromogeno rosso), la proteina dell'occludina potrebbe essere visualizzata e quantificata. Un contenuto proteico di occlusina significativamente più elevato è risultato evidente nel gruppo di controllo rispetto alla mucosa intestinale esposta alle proteine del glutine per 24 ore (Figura 2A,C).
Gli equivalenti intestinali costituiti da una componente immunitaria (rappresentata dai monociti U937) sono ideali anche per studiare gli effetti degli induttori pro-infiammatori sull'attivazione, la migrazione e la differenziazione dei monociti in macrofagi. Ancora una volta, utilizzando 40 μg/mL di proteine totali del grano estratte da una fonte di grano con un alto contenuto di glutine, l'attivazione pro-infiammatoria dei monociti U937 nella lamina propria è stata evidente dalla colorazione rapida accoppiata al rosso CD14 (Figura 3A). L'attivazione è rilevata dall'aumentata espressione di questa glicoproteina di membrana colorata di rosso su monociti e macrofagi. L'aumento della proteina CD14 è stato rilevato anche con l'isotiocianato di fluoresceina (FITC), che si colora di verde sotto immunofluorescenza. La migrazione è stata evidenziata dalla presenza di cellule U937 attivate vicino al monostrato Caco-2. Nel punto in cui il monostrato si era rotto, è stato dimostrato che le cellule U937 erano entrate all'interno del monostrato di cellule Caco-2 (Figura 3A). Non c'è stata evidenza di migrazione dei monociti colorati con CD14 nel gruppo di controllo (Figura 3A). La differenziazione dei monociti in macrofagi è identificabile dal marcatore CD11b. Nessuna colorazione di CD11b è stata evidente nel gruppo di controllo con cromogeno rosso o FITC (Figura 3B). Invece, nei tessuti esposti al glutine, i macrofagi CD11b sono stati osservati sia nella lamina propria ricca di ECM che all'interno del monostrato Caco-2 rotto (Figura 3B).
Utilizzando LPS per simulare l'infiammazione intestinale, qui mostriamo che è anche possibile utilizzare questo sistema modello per studiare la mucina acida e i mucopolisaccaridi prodotti dalle cellule Caco-2 nel controllo non trattato e nel trattamento LPS, rispettivamente (Figura 4A). Utilizzando il blu Alcian e la colorazione PAS, il muco acido viene colorato di blu brillante e le mucine neutre vengono colorate rispettivamente di viola-magenta. L'entità della colorazione del muco può essere quantificata in modo simile e si è dimostrato che è indotta in modo significativo sotto la sfida LPS di 1 ng/mL (Figura 4B). Inoltre, prima della fissazione, il terreno può essere rimosso per studiare la produzione di citochine pro-infiammatorie. Sebbene sia possibile misurare numerose citochine escretrici, in questo caso particolare è stata selezionata la midkine (MDK). L'MDK è un marcatore infiammatorio endogeno indotto dal fattore di trascrizione, il fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer della via delle cellule B attivate (NF-κB) ed è anche associato a malattie infiammatorie delle cellule intestinali15. Nell'ambito della sfida LPS, l'MDK è indotto in modo significativo rispetto al controllo (Figura 5).
Figura 1: Equivalenti intestinali 3D di controllo non trattati. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) di equivalenti intestinali 3D di controllo non trattati (co-colture Caco-2 /U937/L929) per 24 ore come verifica dell'efficacia del modello di base della mucosa intestinale 3D a scopo sperimentale. (A) Un modello sperimentale accettabile viene confrontato con modelli inaccettabili, mostrando un'eccessiva (B) crescita epiteliale e strati disorganizzati dopo 10 giorni, (C) eccessivo spessore epiteliale e disorganizzazione, (D) malformazione e (E) assenza di strato di cellule epiteliali. La barra della scala in ogni immagine è pari a 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Equivalenti intestinali 3D trattati. (A) Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ed espressione di occludina di equivalenti intestinali 3D (co-colture Caco-2 /U937/L929) esposti per 24 ore a 40 μg/mL di proteine totali da una miscela di grano moderno ad alto contenuto di glutine rispetto al controllo (CTRL). La barra della scala in ogni immagine è uguale a 50 μm. (B) Quantificazione dello spessore delle cellule Caco-2 e (C) colorazione del cromogeno rosso occlusina. Le differenze significative sono state determinate dalla varianza unidirezionale (ANOVA) e rappresentate come *** 0,0001< P < 0,001. I punti neri rappresentano il numero di repliche. Questa figura è stata adattata con il permesso di Truzzi et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione CD14 e CD11B. Colorazione CD14 dei monociti U937 e dei macrofagi differenziati CD11B U937 in equivalenti intestinali 3D (co-colture Caco-2/U937/L929) esposti a nessuna proteina aggiunta (controllo [CTRL]) o 40 μg/mL di proteine totali da una miscela di grano moderno ad alto contenuto di glutine dopo un periodo di 24 ore. Per la colorazione di CD14 e CD11b, il rosso veloce è stato utilizzato come cromogeno e i nuclei sono stati controcolorati con eosina. La barra della scala in ogni immagine è pari a 20 μm. La colorazione di CD14 e CD11b con isotiocianato di fluoresceina (verde) è stata mostrata anche sotto immunofluorescenza. I nuclei sono stati controcolorati con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). La barra della scala in ogni immagine è uguale a 50 μm. Le frecce indicano la presenza di monociti (cellule CD14 positive) e macrofagi (cellule CD11b positive). Questa figura è stata adattata con il permesso di Truzzi et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione dell'ematossilina e dell'eosina (H&E) ed espressione del muco dalla colorazione Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff Stain (PAS). (A) Cellule Caco-2 in equivalenti intestinali basici 3D (co-colture Caco-2 /U937/L929) dopo 24 ore nei sistemi modello di mucosa intestinale equivalenti non trattati e ricostruiti esposti a 1 ng/mL di lipopolisaccaride. La barra della scala in ogni immagine è uguale a 50 μm. (B) La quantificazione dell'espressione del muco è stata determinata dalla varianza unidirezionale (ANOVA) con significatività riportata come **** P < 0,0001. I punti neri rappresentano il numero di repliche. Questa figura è stata adattata con il permesso di Truzzi et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione di Midkine. Espressione di midkine nel mezzo di equivalenti intestinali 3D (co-colture Caco-2 /U937/L929) dopo 24 ore nel controllo non trattato (CTRL) e nei sistemi modello di mucosa intestinale esposti a 1ng/mL di lipopolisaccaride. La quantificazione dell'espressione delle midkine è stata determinata mediante varianza unidirezionale (ANOVA) con significatività riportata come **** P < 0,0001. Questa figura è stata adattata con il permesso di Truzzi et al.16. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Diagramma schematico che rappresenta la costruzione e l'uso sperimentale degli equivalenti intestinali, nonché la fissazione e l'analisi microscopica dei parametri delle sezioni di tessuto. Il diagramma schematico riassume la costruzione degli equivalenti intestinali e dei possibili trattamenti sperimentali che possono essere somministrati a questi modelli. La generazione di più sezioni di tessuto da un singolo esperimento consente l'analisi di numerosi aspetti strutturali e immunitari della mucosa intestinale, come illustrato in Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il sistema modello di mucosa intestinale ricostruito di base qui presentato (Figura 6) combina la complessità fisiologica (colture cellulari 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico contenenti un monostrato di Caco-2 con un supporto della lamina propria ricco di ECM contenente fibroblasti e monociti) con la semplicità sperimentale (utilizzando linee cellulari umane commerciali per produrre un sistema standardizzato e facilmente ripetibile)13. In quanto tale, questo sistema modello è considerato un'alternativa adeguata ai modelli murini volti a valutare l'effetto di potenziali farmaci/componenti alimentari sull'integrità della barriera intestinale. A questo proposito, articoli precedenti confermano l'efficacia dell'attuale modello di coltura cellulare nel testare sia composti potenzialmente benefici (più dipendenza dalla dose) che componenti alimentari dannosi 7,16,17. Inoltre, LPS o reagenti pro-infiammatori alternativi (acido 2,4,6-trinitrobenzensolfonico o destrano solfato di sodio) possono essere aggiunti al presente modello di mucosa intestinale per simulare i sintomi dell'IBD. In tal modo, è potenzialmente possibile studiare l'eziologia delle malattie intestinali sia dal punto di vista strutturale che dall'espressione di citochine, come la MDK pro-infiammatoria, che è un marcatore di IBD15. Questo sistema modello di base ha anche un potenziale di screening farmacologico per la popolazione più ampia. Sebbene il sistema modello sia fisiologicamente più complesso dei modelli 2D13,14, i limiti nella riproduzione della fisiologia umana complessa includono l'assenza sia di un sistema microfluidico (perfusione fluidica di un apporto continuo di nutrienti e rimozione di prodotti di scarto e stimoli meccanici)8,14 che del microbioma (valutazione delle interazioni ospite-microbioma nelle malattie intestinali)8, Ore 14.
Il vantaggio dell'utilizzo del presente modello di mucosa intestinale 3D di base in combinazione con l'inclusione di paraffina per la valutazione al microscopio ottico dell'integrità della barriera epiteliale è che diverse sezioni di tessuto possono essere realizzate da un singolo esperimento, consentendo così l'analisi di numerosi parametri. La resistenza elettrica transepiteliale (TEER)3 è un metodo comunemente usato per valutare l'integrità della barriera intestinale ed è stato utilizzato in combinazione con studi di permeabilità macromolecolare 3,18, nonché con studi ampiamente riportati sulla valutazione Western blot dell'espressione della proteina TJ. La valutazione del Western blot fornisce informazioni quantitative sui cambiamenti complessivi nell'espressione proteica e il TEER funge da misura quantitativa dell'integrità della barriera. Invece, la valutazione microscopica fornisce uno strumento prezioso per la visualizzazione qualitativa e la valutazione dei cambiamenti e delle interazioni proteiche locali18.
La valutazione microscopica di un modello con una componente immunitaria consente la visualizzazione delle risposte immunitarie, come la differenziazione dei monociti in macrofagi e la migrazione dei monociti attivati nell'ECM, come dimostrato qui dalla colorazione CD14 e CD11b. L'identificazione può essere effettuata tramite immunoistochimica e/o colorazione a immunofluorescenza su singole sezioni di tessuto, come mostrato per CD14 e CD11b nella Figura 3. L'immunoistochimica permette la visualizzazione strutturale del tessuto mucosale intestinale ricostruito nel suo complesso. Inoltre, è possibile identificare sia i nuclei che il citoplasma nelle cellule. Al contrario, l'immunofluorescenza confocale non consente di vedere il tessuto nel suo insieme (solo i marcatori di interesse e i nuclei colorati con DAPI). Tuttavia, fornisce un'immagine molto pulita in cui il colore di sfondo viene eliminato. Il vantaggio di questo è che consente una maggiore precisione nell'evidenziare la positività o la negatività dei marcatori e, di conseguenza, il calcolo di eventuali differenze nell'intensità del colore (ad esempio, un marcatore che è più espresso in una cella che in un'altra). Potenzialmente l'entità della migrazione dei monociti CD14 dall'interno della lamina propria al monostrato di Caco-2 potrebbe anche essere stimata da più immagini replicate scattate in vari punti temporali. Tuttavia, l'evidenza dell'infiammazione era evidente dalla presenza di cellule colorate sia con CD14 che con CD11b.
La maggior parte dei laboratori utilizza un intervallo di 20-40 μg di proteine totali per il western blotting19. La quantificazione di numerose proteine della giunzione gap (occlusina, claudina, zonulina ed E-caderina) può essere eseguita mediante colorazione immunoistochimica e/o fluorescente su singole sezioni di tessuto, che richiedono rispettivamente una quantità significativamente inferiore di proteine. Allo stesso tempo, dallo stesso esperimento, l'integrità dello strato epiteliale in risposta ai composti può anche essere visualizzata dal modello, dalla forma e dalla struttura delle cellule con colorazione H&E.
L'efficacia di una mucosa intestinale di base ricostruita in 3D per l'uso nella colorazione della produzione di muco, delle proteine TJ e delle proteine prodotte dalle risposte immunitarie dipende dal superamento di passaggi critici, in particolare nella costruzione del sistema modello e durante la fissazione dei tessuti. Per quanto riguarda la costruzione del modello, è fondamentale utilizzare la corretta confluenza e seminare rispettivamente il corretto numero di celle Caco-2 (indicato dalle note nel protocollo). Troppe cellule o una confluenza errata si tradurrebbero in uno strato epiteliale spesso e disorganizzato. Invece, un numero troppo esiguo di cellule comporterebbe una ridotta o una mancata formazione di strati epiteliali. Altrettanto fondamentale per la semina è la corretta confluenza cellulare e il numero di cellule L929 e U937 nell'ECM, nonché la corretta manipolazione del collagene durante la preparazione. L'eccesso di cellule o la rapida polimerizzazione del collagene si tradurrebbero in una ECM compatta e malformata, che a sua volta avrebbe un impatto sulla struttura delle cellule epiteliali soprastanti. Allo stesso modo, troppo poche cellule L929 che formano collagene si tradurrebbero in una consistenza errata dell'ECM, mentre troppo pochi monociti U937 non favorirebbero una risposta immunitaria. È anche importante che le cellule vengano utilizzate per la sperimentazione dopo 5 giorni, poiché un'incubazione prolungata comporterebbe un'eccessiva crescita cellulare con conseguente strato epiteliale compatto. Inoltre, dato che il presente disegno manca di un sistema microfluidico ed è rappresentativo di un modello cellulare intestinale statico, per favorire il rilascio di molecole e la crescita e la stimolazione delle cellule, è molto importante che il mezzo venga cambiato ogni giorno. Per quanto riguarda il protocollo di fissazione, la fase di clearing è critica e dato che il tempo necessario affinché i tessuti diventino trasparenti in paraffina può variare, ogni sistema della mucosa intestinale deve essere attentamente osservato durante questa fase. Durante la procedura di fissaggio, è necessario prestare attenzione nel maneggiare questi modelli per evitare di danneggiarli.
In conclusione, a condizione che si presti una stretta aderenza ai punti critici nella costruzione e nella fissazione degli equivalenti intestinali 3D di base, i modelli possono fornire numerose sezioni di tessuto per la valutazione di molteplici parametri negli studi di screening farmaceutico e di tossicità.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Si ringrazia la Fondazione Umberto Veronesi per una borsa di studio a sostegno del lavoro di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
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