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Biology

एक प्रतिरक्षा घटक के साथ बुनियादी तीन आयामी (3 डी) आंतों के मॉडल प्रणाली

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

Summary

यहां हम एक बुनियादी त्रि-आयामी (3 डी) आंतों की सेल लाइन मॉडल प्रणाली और निश्चित आंतों के समकक्षों के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए एक पैराफिन एम्बेडिंग प्रोटोकॉल के निर्माण का वर्णन करते हैं। चयनित प्रोटीन के धुंधला preclinical दवा स्क्रीनिंग अध्ययन में संभावित उपयोग के लिए एक ही प्रयोग से कई दृश्य मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति देता है.

Abstract

भड़काऊ आंतों के रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए विवो और इन विट्रो आंतों के मॉडल के उपयोग में वृद्धि हुई है, संभावित लाभकारी पदार्थों की औषधीय जांच के लिए, और संभावित हानिकारक खाद्य घटकों पर विषाक्तता अध्ययन के लिए। प्रासंगिकता की, पशु मॉडल को प्रतिस्थापित करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सेल आधारित के विकास के लिए एक वर्तमान मांग है. यहां, सेल लाइनों का उपयोग करके एक बुनियादी, "स्वस्थ ऊतक" त्रि-आयामी (3 डी) आंतों के समकक्ष मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सादगी (मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली) और शारीरिक जटिलता (कैको -2 एंटरोसाइट्स यू 937 मोनोसाइट्स और एल 929 फाइब्रोब्लास्ट के सहायक प्रतिरक्षा घटक के साथ) प्रदान करने के दोहरे लाभ के साथ प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल भी निश्चित आंतों समकक्षों के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग भी शामिल है, जिससे एक ही प्रयोग से कई दृश्य मापदंडों का विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करते हैं। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) सना हुआ खंड जो नियंत्रण उपचार में एक तंग और नियमित मोनोलेयर बनाने वाले काको -2 स्तंभ कोशिकाओं को दिखाते हैं, एक प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में मॉडल की प्रभावकारिता को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक समर्थक भड़काऊ खाद्य घटक के रूप में लस का प्रयोग, वर्गों से विश्लेषण मापदंडों कम monolayer मोटाई, साथ ही साथ बाधा और अंतर्निहित मैट्रिक्स (एच एंड ई) से टुकड़ी शामिल हैं, तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी के रूप में occludin धुंधला (quantifiable सांख्यिकीय रूप से) से दिखाया गया है, और प्रतिरक्षा-सक्रियण U937 कोशिकाओं पलायन के रूप में भेदभाव 14 (CD14) धुंधला और मैक्रोफेज में CD11b से संबंधित भेदभाव के क्लस्टर से सबूत के रूप में. जैसा कि आंतों की सूजन का अनुकरण करने के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड का उपयोग करके दिखाया गया है, अतिरिक्त पैरामीटर जिन्हें मापा जा सकता है, वे हैं बलगम धुंधला हो जाना और साइटोकिन अभिव्यक्ति (जैसे मिडकिन) में वृद्धि हुई है जिसे निर्धारण से पहले माध्यम से निकाला जा सकता है। बुनियादी त्रि-आयामी (3 डी) आंतों के श्लेष्म मॉडल और निश्चित वर्गों को कई दृश्य मात्रात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने की संभावना के साथ भड़काऊ स्थिति और बाधा अखंडता अध्ययन के लिए अनुशंसित किया जा सकता है।

Introduction

आंतों के उपकला बाधा, एक कोशिका-मोटी आंतरिक अस्तर जिसमें विभिन्न प्रकार की उपकला कोशिकाएं होती हैं, शरीर के बाहर और आंतरिक परिवेश 1,2 के बीच पहली शारीरिक रक्षात्मक बाधा या इंटरफ़ेस का गठन करती है। स्तंभ-प्रकार के एंटरोसाइट्स उपकला कोशिकाओं के सबसे प्रचुर प्रकार का गठन करते हैं। ये तंग जंक्शनों (टीजे) सहित कई बाधा घटकों के बीच बातचीत के माध्यम से उपकला बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं, जो बाधाकसने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 1,3. टीजे संरचना में इंट्रासेल्युलर पट्टिका प्रोटीन होते हैं, जैसे ज़ोनुला ऑक्लुडेंस (जेडओ) और सिंगुलिन, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ सहयोग करते हैं, जिसमें ऑक्लुडिन, क्लॉडिन और जंक्शनल आसंजन अणु (जेएएम) शामिल हैं जो जिपर जैसी संरचना बनाते हैं जो पड़ोसी कोशिकाओंको 3,4 से जोड़ते हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन छोटे यौगिकों के निष्क्रिय पैरासेल्युलर प्रसार को नियंत्रित करते हैं और जहरीले बड़े अणुओं को बाहर करते हैं।

संभावित विषाक्त खाद्य यौगिकों और खाद्य संदूषक भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन को उत्तेजित करते हैं जो उपकला पारगम्यता को बाधित करता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करता है और पुरानी आंतों के ऊतकों की सूजन 5,6,7का कारण बनता है। इसके विपरीत, विभिन्न एंटी-ऑक्सीडेंट और एंटी-इंफ्लेमेटरी फाइटोकेमिकल्स को भड़काऊ साइटोकिन अभिव्यक्ति को कम करने और टीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति और असेंबली 4,6,8की बहाली के माध्यम से आंतों के टीजे बाधा अखंडता को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है। इसलिए, लाभकारी और हानिकारक दोनों यौगिकों द्वारा उपकला बाधा अखंडता के विनियमन ने दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता अध्ययन के लिए आंतों की बाधा की नकल करने के उद्देश्य से विवो और इन विट्रो मॉडल दोनों के उपयोग में वृद्धि देखी है। यह विशेष रूप से आंतों के आंत्र रोगों (आईबीडी), नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस और कैंसर के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने में बढ़ती रुचि को देखते हुए प्रासंगिक है, जिसे प्रयोगात्मक मॉडल 8,9,10में अनुकरण किया जा सकता है।

पशु परीक्षण में "3 आर" के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सेल आधारित के विकास की मांग की गई है। इनमें जानवरों के उपयोग के प्रतिस्थापन विकल्प, उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या में कमी और संकट को कम करने वाले तरीकों को अपनाने में शोधन 11,12,13 शामिल हैं। इसके अलावा, मानव और murine मॉडल (कृन्तकों सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रजातियों जा रहा है) के बीच अंतर्निहित आणविक, सेलुलर, और शारीरिक तंत्र मानव प्रतिक्रियाओं12,13 में भविष्यवक्ताओं के रूप में murine मॉडल की प्रभावकारिता के बारे में विवाद के लिए अग्रणी, विशिष्ट हैं. इन विट्रो मानव सेल लाइन मॉडल में के कई फायदे लक्ष्य प्रतिबंधित प्रयोग, प्रत्यक्ष अवलोकन, और निरंतर विश्लेषण13 शामिल हैं.

द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृतियों में एकल-सेल-प्रकार मोनोलेयर ने शक्तिशाली मॉडल के रूप में कार्य किया है। हालांकि, ये मानव ऊतकों 8,13,14 की शारीरिक जटिलता को ठीक से पुन: पेश नहीं कर सकते हैं। नतीजतन, 3 डी संस्कृति प्रणालियों अगली पीढ़ी के जोखिम मूल्यांकन टूलबॉक्स13,14 के रूप में स्वस्थ और रोगग्रस्त आंतों के ऊतकों दोनों की शारीरिक जटिलता recapitulate करने के लिए कभी बढ़ती सुधार के साथ विकसित किया जा रहा है. इन मॉडलों में सेल लाइनों और ऑर्गेनोइड (स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों से व्युत्पन्न)8,13,14का उपयोग करके विविध सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (आंत-ऑन-चिप) के साथ 3 डी ट्रांसवेल मचान शामिल हैं।

वर्तमान अध्ययन में प्रस्तुत 3 डी "स्वस्थ ऊतक" आंतों समकक्ष प्रोटोकॉल शारीरिक जटिलता और प्रयोगात्मक सादगी13 के बीच संतुलन बनाने पर आधारित था. मॉडल एक 3 डी ट्रांसवेल मचान का प्रतिनिधि है, जिसमें तीन सेल लाइनें (एंटरोसाइट्स [गोल्ड-स्टैंडर्ड कोलन एडेनोकार्सिनोमा कैको -2 लाइन] एक सहायक प्रतिरक्षा घटक [यू 937 मोनोसाइट्स और एल 929 फाइब्रोब्लास्ट्स] के साथ) शामिल हैं, जो आंतों के उपकला बाधा अखंडता और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ब्याज के आहार अणुओं की प्रारंभिक जांच के लिए लागू एक मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली का गठन करते हैं। प्रोटोकॉल निश्चित आंतों समकक्षों का उपयोग कर उपकला बाधा अखंडता के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग भी शामिल है. वर्तमान दृष्टिकोण का लाभ यह है कि एम्बेडेड ऊतकों के कई वर्गों को एक ही प्रयोग से कई मापदंडों के लिए दाग करने के लिए बनाया जा सकता है।

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Protocol

1. बुनियादी 3 डी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल की तैयारी

नोट: पूरी प्रक्रिया एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए. सेल इनक्यूबेटर के उपयोग से जुड़े प्रक्रिया के सभी चरण दर्शाते हैं कि संस्कृतियों को 5% सीओ2 युक्त आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है (जब तक कि प्रोटोकॉल में अन्यथा न कहा गया हो)।

  1. आंतों के मॉडल प्रणाली में उपयोग की जाने वाली सेल लाइनों की पूर्व तैयारी
    1. बीज L929 माउस fibroblast कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 5 एमएल में 5 x 105 2 मिमी एल ग्लूटामाइन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) युक्त एक F25 फ्लास्क में और एक इनक्यूबेटर में यह संस्कृति आंतों के मॉडल के निर्माण से पहले 4 दिन. 48 घंटे के बाद, एक विंदुक का उपयोग कर माध्यम को हटा दें. फिर ताजा माध्यम (5 एमएल) जोड़ें, और कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए आगे सेते हैं।
      नोट: कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले 80% संगम होना चाहिए।
    2. बीज Caco-2 कोशिकाओं (2 एक्स 106 की एकाग्रता) DMEM माध्यम के 10 एमएल में (10% FBS और 1% पेन-स्ट्रेप के साथ) एक F75 सेल फ्लास्क में और यह एक इनक्यूबेटर में संस्कृति आंतों के श्लेष्म मॉडल के निर्माण से 4 दिन पहले. 48 घंटे के बाद, चरण 1.1.1 में वर्णित माध्यम को बदलें और आगे 48 घंटे के लिए 80% के संगम के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: कोशिकाओं को एक सक्रिय प्रसार चरण में होना चाहिए: न तो विरल और न ही बहुत संगम। 50-60% संगम की सिफारिश की जाती है। मॉडल बनाने से एक दिन पहले कोशिकाओं को बोया नहीं जाना चाहिए क्योंकि यह कोशिकाओं की प्रसार क्षमता को धीमा कर सकता है, जो तब पुनर्निर्मित 3 डी मॉडल में पूरी तरह से जड़ नहीं लेगा।
    3. U937 कोशिकाओं है कि निलंबन (1 एक्स 10 6 की एकाग्रता) रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) माध्यम के 10 एमएल (2 मिमी एल ग्लूटामाइन, 1% सोडियम pyruvate, 10% FBS, और 1% पेन-स्ट्रेप युक्त) मॉडल सेट अप से 2 दिन पहले एक F75 सेल फ्लास्क में, और 48 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में जगह के निलंबन (1 एक्स 106 की एकाग्रता) में बढ़ने जोड़ें.
  2. ट्रांसवेल सह-संस्कृति प्लेट आवेषण की तैयारी
    1. 0.4 माइक्रोन फिल्टर के साथ आवेषण युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली का चयन करें.
      नोट: 0.4 माइक्रोन फिल्टर दवा परिवहन अध्ययन में एक मानक विकल्प है। कोलेजन-एम्बेडेड कोशिकाओं के किसी भी संभावित नुकसान को रोकने के लिए 3 माइक्रोन और 8 माइक्रोन फिल्टर आकार की सिफारिश नहीं की जाती है।
    2. एक विंदुक का प्रयोग, फिल्टर डालने के नीचे और ऊपर हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 500 माइक्रोन के साथ ट्रांसवेल फिल्टर (अब से झिल्ली आवेषण के रूप में संदर्भित) हाइड्रेट.
    3. बहु अच्छी तरह से थाली बंद करें और 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए एक इनक्यूबेटर में जगह है.
      नोट: झिल्ली आवेषण 24 घंटे तक एचबीएसएस में रह सकते हैं। यह ऑपरेशन मॉडल के निर्माण से एक दिन पहले किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि झिल्ली आवेषण पूरी तरह से हाइड्रेटेड हैं और फिल्टर बाहर सूख नहीं करता है, क्योंकि इससे नमूना ठीक से पालन करना कठिन हो सकता है।
    4. 2 घंटे (या 24 घंटे) के बाद इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें. ध्यान से ऊपर से HBSS महाप्राण और झिल्ली आवेषण नीचे एक विंदुक का उपयोग कर और यह 10 मिनट के लिए सूखी करने के लिए छोड़ दें.
  3. मूल 3 डी आंतों के मॉडल सिस्टम (दिन 1) के सेल-मुक्त कोलेजन लैमिना प्रोप्रिया की तैयारी
    1. डीएमईएम में निम्नलिखित घटकों वाले बर्फ पर 50 एमएल बाँझ ट्यूब में एक सेल मुक्त कोलेजन समाधान तैयार करें: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 200 मिमी एल-ग्लूटामाइन, 1% सोडियम बाइकार्बोनेट और 1.35 मिलीग्राम / एमएल टाइप 1 चूहा पूंछ कोलेजन।
      नोट: इन सभी घटकों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए और ठंडा विंदुक युक्तियों के साथ डीएमईएम में जोड़ा जाना चाहिए। टाइप 1 चूहे की पूंछ कोलेजन को अंतिम रूप से जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि यह बढ़ते तापमान और पीएच के साथ पोलीमराइज़ करता है। तैयार किए गए सेल-मुक्त कोलेजन समाधान की मात्रा आवश्यक आंतों के समकक्षों की संख्या पर निर्भर करेगी।
    2. चयनित आंतों के समकक्षों की संख्या के लिए प्रत्येक प्लेट डालने (झिल्ली फिल्टर के ऊपर) के समाधान के 250 माइक्रोन जोड़ें और बहु-अच्छी प्लेट पर ढक्कन रखें। कोलेजन समाधान लामिना का प्रवाह हुड के तहत कमरे के तापमान (आरटी) पर polymerize करने के लिए अनुमति दें.
      नोट: एक और अधिक ठोस चरण के लिए संक्रमण के अलावा, पोलीमराइजेशन भी पीले से गुलाबी रंग में परिवर्तन से स्पष्ट है। पॉलिमराइजेशन आमतौर पर 10-15 मिनट के भीतर पूरा होता है।
  4. तैयारी, सेल गिनती, और फाइब्रोब्लास्ट (L929) और मोनोसाइट (U937) कोशिकाओं को मॉडल सिस्टम (DAY 1) में जोड़ना
    1. इनक्यूबेटर से L929 सेल संस्कृति (चरण 1.1.1) निकालें। एक वैक्यूम पंप का उपयोग करना, माध्यम को महाप्राण करना, इसे बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; सीए और मिलीग्राम के बिना) के 5 एमएल के साथ बदलें, और कोशिकाओं को कुल्ला।
    2. एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर पीबीएस महाप्राण. एक पूर्व तैयार ट्रिप्सिन-EDTA समाधान (पीबीएस में 0.05% ट्रिप्सिन और 0.02% EDTA) के 2 एमएल जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
    3. कोशिकाओं को आसंजन सतह से अलग कर रहे हैं कि क्या स्थापित करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप (उदाहरण के लिए, एक ग्रहण Ts2, Nikon) का प्रयोग करें. यदि यह हो रहा है, तो ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करने और कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए तुरंत डीएमईएम (10% एफबीएस युक्त) के 2 एमएल जोड़ें।
    4. सेल समाधान को एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब और 5 मिन के लिए 645 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। एक वैक्यूम पंप का उपयोग करके, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
      नोट: गोली को परेशान न करने के लिए देखभाल की आवश्यकता है। डीएमईएम के प्रभाव का परीक्षण एल 9 2 9 और यू 9 37 कोशिकाओं पर किया गया था और विकास पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं दिखाया गया था।
    5. गोली करने के लिए DMEM के 1 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को निलंबित.
      नोट: कोशिकाओं को समाधान में सजातीय रूप से निलंबित किया जाना चाहिए।
    6. डीएमईएम में कोशिकाओं के 20 माइक्रोन निकालें और ट्रिपैन नीले समाधान के 20 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण के 20 माइक्रोन निकालें और सेल घनत्व सूक्ष्म रूप से एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर मूल्यांकन करें।
    7. इनक्यूबेटर से U937 सेल संस्कृति (1.1.3 कदम) निकालें. 5 मिनट के लिए 645 x ग्राम पर सेल समाधान अपकेंद्रित्र. एक वैक्यूम पंप का प्रयोग, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण गोली परेशान से बचने के लिए.
    8. RPMI के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें। L929 कोशिकाओं के साथ, सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समाधान में सजातीय रूप से निलंबित कर दिया गया है।
    9. इसी प्रकार, चरण 1.4.6 में बताए अनुसार कोशिका घनत्व स्थापित करें।
    10. चरण 1.3.1 में वर्णित के रूप में एक कोलेजन समाधान तैयार करें।
      नोट: किए जाने वाले समाधान की मात्रा को प्रत्येक डालने (या मॉडल) के लिए 450 माइक्रोन को ध्यान में रखना चाहिए।
    11. प्रत्येक आंतों के समकक्ष मॉडल के लिए 50 माइक्रोन की मात्रा में क्रमशः 50,000 एल 929 कोशिकाओं और 15,000 यू 937 कोशिकाओं की गिनती शामिल करने के लिए डीएमईएम का एक समाधान तैयार करें।
      नोट: कोशिकाओं की संख्या एक महत्वपूर्ण कारक है। दोनों प्रकार के सेल प्रकारों में से बहुत से एक लैमिना प्रोप्रिया के परिणामस्वरूप कोशिकाओं से भरा हुआ होगा जो पर्याप्त रूप से व्यवस्थित नहीं होगा। फाइब्रोब्लास्ट्स की एक अवर संख्या (जो कोलेजन उत्पन्न करती है) के परिणामस्वरूप कम कॉम्पैक्ट लैमिना प्रोप्रिया होगा, जबकि बहुत कम मोनोसाइट्स उत्तेजनाओं के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित करेंगे। बशर्ते कोशिकाओं की सही गिनती प्रत्येक 50 माइक्रोन विभाज्य के भीतर मौजूद हो - प्रत्येक 24 अच्छी तरह से प्लेट में मौजूद 12 फिल्टर आवेषण के लिए 600 माइक्रोन की कुल मात्रा तैयार की जा सकती है।
    12. चरण 1.4.10 में कोलेजन समाधान के 450 माइक्रोन में कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक 50 माइक्रोन विभाज्य जोड़ें। अच्छी तरह मिलाओ।
    13. प्रत्येक मॉडल के लिए कोलेजन युक्त सेल समाधान के 500 माइक्रोन के साथ पूर्व-लेपित सेल-मुक्त कोलेजन लैमिना प्रोप्रिया को ओवरले करें।
      नोट: प्रत्येक डालने के लिए वॉल्यूम को तेजी से जोड़ना महत्वपूर्ण है, और इस तरह, एक समय में पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल की संख्या को 12 या उससे कम तक सीमित करना उचित है।
    14. प्लेट बंद करें और इसे 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखें ताकि समाधान सेट हो सके।
  5. तैयारी, सेल गिनती, और आंतों के मॉडल के लिए उपकला Caco-2 कोशिकाओं के अलावा (दिन 1)
    1. इनक्यूबेटर से Caco-2 सेल संस्कृति (1.1.2 कदम) निकालें. प्रारंभिक rinsing के लिए पीबीएस के 10 एमएल का उपयोग कर कदम 1.4.1 से प्रक्रियाओं को दोहराएँ. फिर एक पूर्व तैयार ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (सीए- और एमजी-मुक्त पीबीएस में 0.05% ट्रिप्सिन और 0.02% ईडीटीए) के 5 एमएल जोड़ें और 5-8 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
    2. सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए 1.4.6 के माध्यम से 1.4.3 (लेकिन ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करने के लिए डीएमईएम के 5 एमएल का उपयोग) कदम दोहराएँ.
    3. 50 माइक्रोन में 150,000 कैको -2 कोशिकाओं की गिनती शामिल करने के लिए डीएमईएम का एक समाधान तैयार करें।
      नोट: उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या एक महत्वपूर्ण बिंदु है। 150,000 से अधिक कोशिकाओं के परिणामस्वरूप एक कॉम्पैक्ट अव्यवस्थित उपकला परत हो सकती है, जबकि बहुत कम (100,000 से कम) के साथ, कोशिकाएं बढ़ने के लिए संघर्ष करती हैं और तहखाने की झिल्ली को पर्याप्त रूप से कवर नहीं करती हैं जिससे एक असंतत आंतों की उपकला परत बनती है। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से निलंबित कर रहे हैं. समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए 200 माइक्रोन विंदुक की नोक का उपयोग किया जा सकता है। यह देखते हुए कि किसी भी समय 12 मॉडल का निर्माण किया जा सकता है, एक 600 माइक्रोन सेल समाधान तैयार किया जा सकता है।
    4. चरण 1.4.14 में आवश्यक 2 घंटे के बाद, प्रत्येक तहखाने झिल्ली के बीच में डीएमईएम में निलंबित काको-2 कोशिकाओं के 50 माइक्रोन जोड़ें। मल्टी-वेल प्लेट का ढक्कन बंद कर दें।
    5. 10 मिनट के लिए बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के तहत सेते हैं. फिर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में स्थानांतरण.
    6. 10% FBS और 1% पेन/स्ट्रेप युक्त DMEM समाधान तैयार करें।
      नोट: प्रति मॉडल 1 एमएल वॉल्यूम का उपयोग करने के लिए पर्याप्त समाधान तैयार करें।
    7. पुनर्निर्मित मॉडल के ऊपर माध्यम के 500 माइक्रोन और फिल्टर के नीचे 500 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: कोशिकाओं को अलग करने या तनाव देने से बचने के लिए फिल्टर के ऊपर माध्यम जोड़ते समय देखभाल की आवश्यकता होती है।
    8. मल्टी-वेल प्लेट सिस्टम को बंद करें और इसे इनक्यूबेटर में रखें।
  6. मॉडल की तैयारी/गठन और उपयोग (दिन 2 से दिन 6)
    1. दिन 2: ध्यान से एक विंदुक का उपयोग कर पुनर्निर्माण मॉडल के ऊपर और फिल्टर के नीचे दोनों से समाधान निकालें. क्रमशः फिल्टर के ऊपर और नीचे ताजा डीएमईएम (10% एफबीएस और 1% पेन / स्ट्रेप) के ताजा 500 माइक्रोन के साथ बदलें।
    2. दिन 3: चरण 1.6.1 में ऊपर के रूप में दोहराएँ.
    3. दिन 4: चरण 1.6.1 में ऊपर के रूप में दोहराएँ.
      नोट: यह आंतों का मॉडल एक स्थिर सेलुलर मॉडल है; इसलिए, अणुओं की रिहाई और कोशिकाओं की वृद्धि और उत्तेजना के पक्ष में, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि माध्यम हर दिन बदल जाए।
    4. दिन 5: इस बिंदु पर, मॉडल पूरी तरह से गठित/विकसित है। आगे के अध्ययन के लिए इन मॉडलों का उपयोग करें।
      नोट: मॉडल का उपयोग करने का सबसे अच्छा समय 5 दिनों का है। यद्यपि कोशिकाओं को लंबे समय तक इनक्यूबेटर में बनाए रखा जा सकता है, जितना अधिक समय गुजरता है, उतनी ही अधिक संभावना है कि उपकला कोशिकाएं अनियंत्रित तरीके से बढ़ सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक असंगठित और कॉम्पैक्ट परत होती है जिसका उपयोग करना मुश्किल होता है।
    5. 5 दिनों में, मॉडल को या तो विषाक्त (लस या लिपोपॉलेसेकेराइड [एलपीएस]) या ब्याज के लाभकारी घटकों (पॉलीफेनोल्स) के साथ इनक्यूबेट करें। DMEM माध्यम में निलंबित पुनर्निर्माण मॉडल के ऊपरी हिस्से के लिए इन जोड़ें.
      नोट: ब्याज के प्रत्येक घटक की उपयुक्त एकाग्रता की गणना की जानी चाहिए और डीएमईएम माध्यम में निलंबित कर दिया जाना चाहिए। प्रयोगात्मक मॉडल की तुलना के लिए केवल DMEM माध्यम युक्त गैर इलाज नियंत्रण स्थापित किया जाना चाहिए.
    6. एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए नियंत्रण और प्रयोगात्मक मॉडल सेते हैं.
    7. दिन 6: एक विंदुक के साथ फिल्टर के ऊपर और नीचे माध्यम निकालें।
      नोट: माध्यम को बाद में एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) -प्रकार परीक्षणों के लिए भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई को मापने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इस प्रयोजन के लिए, माध्यम बाँझ शीशियों में जोड़ा जाना चाहिए और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए.

2. पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल के पैराफिन एम्बेडिंग

नोट: पूरी प्रक्रिया एक रासायनिक धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए। प्रत्येक चरण और संबंधित समय आवंटन का सख्ती से पालन किया जाना चाहिए। इस कारण से, सभी अभिकर्मकों को समय से पहले तैयार करना महत्वपूर्ण है।

  1. पैराफिन मशीन को 58 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें ताकि यह उपयोग के लिए तैयार हो।
  2. एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली में सरौता का उपयोग कर साफ कुओं के लिए झिल्ली आवेषण स्थानांतरण.
  3. फिल्टर के ऊपर पीबीएस में 37% बफर फॉर्मेलिन के 500 माइक्रोन और फिल्टर के तहत 1 एमएल जोड़ें। ढक्कन बंद करें और इसे आरटी पर 2 घंटे के लिए रासायनिक धूआं हुड के नीचे छोड़ दें।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, 4% बफर फॉर्मेलिन का उपयोग आरटी में 1 घंटे के लिए किया जा सकता है।
  4. फॉर्मेलिन निकालें और फिल्टर के ऊपर और नीचे दोनों जगह एचबीएसएस समाधान जोड़ें। फिर HBSS को हटा दें।
  5. झिल्ली डालने से लामिना प्रोप्रिया को अलग करें।
    नोट: आंतों के श्लेष्म की कोशिकाएं आमतौर पर झिल्ली डालने से बहुत आसानी से अलग हो जाती हैं क्योंकि वे बाद वाले से जुड़ी नहीं होती हैं। इसके अतिरिक्त, दो नमूना डिब्बे (एपिकल और बेसल) 3 डी संरचना को बनाए रखते हुए जुड़े रहते हैं। यदि, किसी कारण से, वे आसानी से अलग नहीं होते हैं, तो झिल्ली डालने से आंतों के श्लेष्म को हटाने के लिए एक बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना महत्वपूर्ण होगा। झिल्ली डालने को काटा जा सकता है, इस प्रकार इसे प्लास्टिक से अलग किया जा सकता है। स्केलपेल के साथ नमूने को छूने के लिए कभी नहीं सावधान रहें। कोलेजन-एम्बेडेड कोशिकाओं से झिल्ली डालने को हटाने का मकसद यह है कि यह फिल्टर बाद के निर्धारण या पैराफिन एम्बेडिंग चरणों में अलग हो सकता है, आंतों के श्लेष्म मॉडल के बीच तुलना को असमान रूप से प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, एम्बेडेड अनुभाग के भीतर झिल्ली आवेषण में एक अलग स्थिरता होती है जो सेक्शनिंग में हस्तक्षेप कर सकती है।
  6. रासायनिक धूआं हुड के तहत 100 एमएल बीकर रखें, प्रत्येक सही ढंग से जांच के तहत एक पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल प्रणाली को शामिल करने के लिए लेबल किया गया है। प्रत्येक बीकर के लिए 35% ETOH के 25 एमएल जोड़ें और फिर पुनर्निर्माण आंतों mucosa जोड़ें. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. 50% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ 35% इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. 70% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ 50% इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 80% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ 70% इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. 95% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ 80% इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. 100% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ 95% इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. 100% इथेनॉल के एक और 25 एमएल परिवर्तन के साथ 100% इथेनॉल बदलें और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  13. धूआं हुड के तहत 100 एमएल बीकर रखें, प्रत्येक सही ढंग से जांच के तहत एक मॉडल को शामिल करने के लिए लेबल किया गया है। 10-20 मिनट के लिए xylene या एक हिस्टोलॉजिकल क्लियरिंग एजेंट के 50 एमएल जोड़ें।
    नोट: हिस्टो-क्लियर (हिस्टोलॉजिकल क्लियरिंग एजेंट) की सिफारिश की जाती है क्योंकि एजेंट एसिडोफिलिक दाग की स्पष्टता और जीवंतता को बढ़ाता है। समाशोधन समय एक पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म नमूने से दूसरे में भिन्न हो सकता है और हर 2-3 मिनट में उपस्थिति में पारदर्शिता के लिए जांच की जानी चाहिए।
  14. जैसे ही नमूने पारदर्शी होते हैं, उन्हें एक धातु ऊतक कैसेट धारक में रखें जो तब 45 मिनट के लिए गर्म मशीन के अंदर तरल पैराफिन में डूब जाता है।
  15. पैराफिन बदलें और एक और 45 मिनट के लिए गर्म मशीन के अंदर नमूने छोड़ दें।
  16. ऊतक कैसेट धारक निकालें और ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें। जब ठंडा नमूना ब्लॉक धातु धारक से अलग हो जाते हैं, तो इन्हें कमरे के तापमान पर और ठंडा किया जा सकता है।
  17. आरटी पर ब्लॉक स्टोर करें।
    नोट: यदि उद्देश्य तुरंत वर्गों को तैयार करना है, तो ब्लॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है ताकि उपयोग किए जाने पर वे अच्छी तरह से ठंडा हो जाएं।
  18. एक माइक्रोटोम का उपयोग कर 4 माइक्रोन वर्गों काटें।
  19. स्लाइड पर कटौती वर्गों प्लेस और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में उन्हें सूखी.
  20. स्लाइड उपयोग के लिए तैयार हैं। एच एंड ई हिस्टोलॉजिकल धुंधला या प्रतिरक्षा-हिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया धुंधला (एंटीजन-एंटीबॉडी प्रकार) प्रदर्शन करने तक उन्हें आरटी पर स्टोर करें।
    1. प्रतिरक्षा-हिस्टोकेमिकल धुंधला के लिए, ब्याज के एंटीबॉडी का चयन करें (या तो टीजे प्रोटीन के अध्ययन के लिए जैसे कि ऑक्लुडिन या मोनोसाइट सक्रियण, प्रवास और भेदभाव के लिए) और वाणिज्यिक किट का उपयोग करके अभिव्यक्ति (धुंधला के माध्यम से) का पता लगाएं।
    2. इसी तरह, Alcian नीले और आवधिक एसिड शिफ (पीएएस) धुंधला किट का उपयोग बलगम उपाय.
    3. माइक्रोस्कोप से लिए गए माइक्रोग्राफ पर सकारात्मक पिक्सल के प्रतिशत की गणना करके, ब्याज के सना हुआ टीजे प्रोटीन, जैसे कि ऑक्लुडिन।
    4. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ2 सॉफ्टवेयर [वेन रासबैंड, संस्करण 2.9.0 / 1.53t]) का उपयोग करके कोशिकाओं के चित्रों का विश्लेषण करें।
      1. पिक्सेल का विश्लेषण करने के लिए, डिजिटल छवियों को 300 पिक्सेल/इंच तक संसाधित करें और उन्हें 8 बिट्स में परिवर्तित करें। फिर, ब्याज की प्रोटीन के धुंधला हो जाना का विश्लेषण करने के लिए रंग Deconvolution प्लगइन द्वारा बाइनरी छवियों की प्रक्रिया, इस मामले में, occludin के स्थायी लाल धुंधला.
      2. चयनित चित्र को एक टिफ़ के रूप में सहेजें और इसे ग्राफिक्स संपादक (जैसे, Adobe PhotoshopCC [संस्करण 20.0.4]) के साथ कलाकृतियों को खत्म करने के लिए "क्लीन-अप" प्रक्रिया के अधीन करें।
      3. इसके बाद, आवेदन के साथ ब्याज के सभी क्षेत्रों को मापने ImageJ2 के कण का विश्लेषण , और पिक्सेल की संख्या के रूप में डेटा की रिपोर्ट.
        नोट: प्रत्येक प्रयोग प्रत्येक प्रतिकृति के लिए विश्लेषण किए गए तीन आंतरिक प्रतिकृति क्षेत्रों के साथ तीन प्रतियों में किया जाना चाहिए। बलगम की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पिक्सेल को मापने का एक ही सिद्धांत क्रमशः बैंगनी-मैजेंटा-सना हुआ तटस्थ श्लेष्म और चमकीले नीले रंग के दाग वाले अम्लीय बलगम से ली गई छवियों पर लागू किया जा सकता है।

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Representative Results

पहला महत्वपूर्ण पहलू प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए बुनियादी 3 डी आंतों के बराबर म्यूकोसा की स्वीकार्यता निर्धारित करना है। यह ऊतक विज्ञान और हिस्टोपैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले दाग के साथ किया जाता है, अर्थात् हेमेटोक्सिलिन (दाग परमाणु सामग्री गहरे नीले-बैंगनी रंग) और ईोसिन (गुलाबी रंग के अलग-अलग साइटोप्लाज्मिक सामग्री)। एच एंड ई धुंधला पहले एक अनुपचारित नियंत्रण पर किया जाता है, जो प्रयोगात्मक उपचार के रूप में एक ही परिस्थितियों और समय सीमा के तहत सुसंस्कृत है। कोशिकाओं के पैटर्न, आकार और संरचना की कल्पना करने से, इस आंतों के सेल मॉडल प्रणाली की सफलता कैको -2 कोशिकाओं द्वारा निर्धारित की जाती है जो 5 दिनों के बाद बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) -समृद्ध लैमिना प्रोप्रिया के ऊपर एक तंग और नियमित मोनोलेयर बनाती हैं(चित्रा 1ए)। मॉडल सिस्टम के उदाहरण जिन्हें आगे के विश्लेषण के लिए अस्वीकार्य माना जाएगा, उनमें असंगठित उपकला परतों के साथ अत्यधिक वृद्धि दिखाने वाले लोग शामिल हैं, जैसा कि 10 दिनों के बाद दिखाया गया है (चित्र 1बी)। एक अतिरिक्त उदाहरण एक उपकला परत है जो बहुत मोटी और अव्यवस्थित है (चित्रा 1सी), जो या तो अतिरिक्त काको -2 कोशिकाओं के बीजारोपण या अत्यधिक इनक्यूबेशन के कारण होती है। विकृति(चित्रा 1डी), या तो सीडिंग कोशिकाओं के कारण जो प्रसार के सक्रिय चरण में नहीं थे, या लैमिना प्रोप्रिया की तैयारी में समस्याएं या पैराफिन के साथ निर्धारण के दौरान (कोशिकाएं अलग / बर्बाद हो गईं), एक अस्वीकार्य पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म का एक उदाहरण भी है। इसी तरह अस्वीकार्य उपकला परत गठन (चित्रा 1E) की कमी है, जो लैमिना प्रोप्रिया की तैयारी में बहुत कम काको -2 कोशिकाओं या समस्याओं के बीजारोपण का संकेत है। स्वीकार्य 3 डी आंतों के समकक्षों का उपयोग करना, जिसमें से कई वर्गों उत्पन्न किया जा सकता है, विभिन्न मापदंडों तो एक ही प्रयोग से जांच की जा सकती है.

विश्लेषण किए जा सकने वाले विभिन्न मापदंडों में से, प्रो-भड़काऊ इंड्यूसर के जवाब में बाधा अखंडता की कल्पना की जा सकती है, और टीजे प्रोटीन दाग और मात्रा निर्धारित और अनुपचारित नियंत्रण मॉडल सिस्टम की तुलना में। यहां हम सेलुलर अखंडता के साथ-साथ टीजे ऑक्लुडिन प्रोटीन सामग्री(चित्रा 2ए)दोनों पर एक उच्च ग्लूटेन सामग्री7 के साथ एक ड्यूरम गेहूं स्रोत से 40 माइक्रोग्राम/एमएल कुल गेहूं प्रोटीन के प्रो-भड़काऊ प्रभाव का प्रदर्शन करते हैं। एच एंड ई हिस्टोलॉजिकल धुंधला का उपयोग करते हुए, नियंत्रण मॉडल प्रणाली कैको -2 स्तंभ कोशिकाओं को एक तंग और नियमित मोनोलेयर बनाते हुए दिखाती है। इसके विपरीत, लस युक्त प्रोटीन नमूने का प्रभाव मोनोलेयर के विघटन का कारण बनता है, जिसमें अधिक निरर्थक ईोसिन धुंधला हो जाना (चित्रा 2ए)दिखाया गया था। इसके अलावा, उपकला परत की मोटाई मापा जा सकता है और समर्थक भड़काऊ लस (चित्रा 2 ए, बी) के संपर्क में काफी कम किया जा करने के लिए दिखाया गया है. occludin (लाल क्रोमोजेन धुंधला करने के लिए संयुग्मित) के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग करना, occludin प्रोटीन कल्पना और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. 24 घंटे(चित्रा 2ए,सी)के लिए ग्लूटेन प्रोटीन के संपर्क में आने वाले आंतों के श्लेष्म की तुलना में नियंत्रण समूह में महत्वपूर्ण रूप से उच्च ऑक्लुडिन प्रोटीन सामग्री स्पष्ट थी।

आंतों के समकक्षों में एक प्रतिरक्षा घटक (U937 मोनोसाइट्स द्वारा दर्शाया गया) शामिल हैं, जो मोनोसाइट सक्रियण, प्रवास और मैक्रोफेज में भेदभाव पर प्रो-भड़काऊ इंड्यूसर्स के प्रभावों की जांच करने में भी आदर्श हैं। एक बार फिर, एक उच्च लस सामग्री के साथ गेहूं के स्रोत से निकाले गए 40 माइक्रोग्राम/एमएल कुल गेहूं प्रोटीन का उपयोग करके, लामिना प्रोप्रिया में यू 937 मोनोसाइट्स के समर्थक भड़काऊ सक्रियण तेजी से लाल युग्मित सीडी 14 धुंधला हो जाना (चित्रा 3 ए)से स्पष्ट था। मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज पर इस लाल-दाग झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से सक्रियण का पता लगाया जाता है। बढ़ी हुई सीडी 14 प्रोटीन को फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) के साथ भी पाया गया था, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस के तहत हरे रंग का दाग देता है। काको -2 मोनोलेयर के करीब सक्रिय यू 937 कोशिकाओं की उपस्थिति से प्रवासन का सबूत था। जहां मोनोलेयर फट गया था, U937 कोशिकाओं को Caco-2 सेल मोनोलेयर(चित्रा 3A)के भीतर प्रवेश करने के लिए दिखाया गया था। नियंत्रण समूह(चित्रा 3ए)में सीडी 14-सना हुआ मोनोसाइट माइग्रेशन का कोई सबूत नहीं था। मैक्रोफेज में मोनोसाइट्स का भेदभाव मार्कर सीडी 11 बी से पहचाना जा सकता है। कोई सीडी 11 बी धुंधला लाल क्रोमोजेन या एफआईटीसी (चित्रा 3 बी) के साथ नियंत्रण समूह में स्पष्ट था। इसके बजाय, लस के संपर्क में ऊतकों में, सीडी 11 बी मैक्रोफेज ईसीएम समृद्ध लामिना प्रोप्रिया में और टूटे हुए काको -2 मोनोलेयर(चित्रा 3बी)के भीतर दोनों देखे गए।

आंतों की सूजन का अनुकरण करने के लिए एलपीएस का उपयोग करना, यहां हम दिखाते हैं कि क्रमशः अनुपचारित नियंत्रण और एलपीएस उपचार में कैको -2 कोशिकाओं द्वारा उत्पादित अम्लीय म्यूसिन और म्यूकोपॉलीसेकेराइड की जांच के लिए इस मॉडल प्रणाली का उपयोग करना भी संभव है(चित्रा 4ए)। अल्कियन ब्लू और पीएएस धुंधला का उपयोग करते हुए, अम्लीय बलगम चमकीले नीले रंग का होता है, और तटस्थ श्लेष्म क्रमशः बैंगनी-मैजेंटा दाग होते हैं। बलगम धुंधला की सीमा इसी तरह मात्रा निर्धारित की जा सकती है और 1 एनजी/एमएल एलपीएस चुनौती(चित्रा 4बी)के तहत काफी प्रेरित दिखाया गया है। इसके अलावा, निर्धारण से पहले, समर्थक भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन की जांच के लिए माध्यम को हटाया जा सकता है। हालांकि कई उत्सर्जन साइटोकिन्स को मापा जा सकता है, इस विशेष उदाहरण में, मिडकाइन (एमडीके) का चयन किया गया था। MDK एक अंतर्जात भड़काऊ मार्कर प्रतिलेखन कारक, परमाणु कारक kappa-प्रकाश श्रृंखला बढ़ाने सक्रिय बी सेल (एनएफ-बी) मार्ग से प्रेरित है, और भी आंतों की कोशिकाओं15 की सूजन रोगों के साथ जुड़ा हुआ है. एलपीएस चुनौती के तहत, एमडीके नियंत्रण (चित्रा 5) की तुलना में काफी प्रेरित है।

Figure 1
चित्रा 1: अनुपचारित नियंत्रण 3 डी आंतों के समकक्ष। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) अनुपचारित नियंत्रण 3 डी आंतों के समकक्ष (कैको -2 / यू 937 / एल 929 सह-संस्कृतियों) के लिए 24 घंटे के लिए प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए बुनियादी 3 डी आंतों के श्लेष्म मॉडल की प्रभावकारिता के सत्यापन के रूप में। (ए) एक स्वीकार्य प्रयोगात्मक मॉडल की तुलना अस्वीकार्य मॉडल से की जाती है, जो 10 दिनों के बाद अत्यधिक (बी) उपकला विकास और अव्यवस्थित परतें, (सी) अत्यधिक उपकला मोटाई और अव्यवस्था, (डी) विकृति, और (ई) कोई उपकला सेल परत नहीं दिखाती है। प्रत्येक छवि में स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 3 डी आंतों के समकक्षों का इलाज किया। (ए) हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला हो जाना, और 3 डी आंतों के समकक्षों (कैको -2 / यू 937 / एल 929 सह-संस्कृतियों) की ऑक्लुडिन अभिव्यक्ति 24 एच से 40 माइक्रोग्राम / एमएल कुल प्रोटीन के लिए उजागर होती है नियंत्रण (सीटीआरएल) की तुलना में आधुनिक गेहूं मिश्रण युक्त एक उच्च लस से कुल प्रोटीन। प्रत्येक छवि में स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होता है। (बी) काको-2 सेल मोटाई और (सी) occludin-लाल क्रोमोजेन धुंधला की मात्रा का ठहराव. महत्वपूर्ण अंतर एक-तरफ़ा विचरण (एनोवा) द्वारा निर्धारित किए गए थे और *** 0.0001< पी < 0.001 के रूप में दर्शाए गए थे। काले बिंदु प्रतिकृतियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा Truzzi एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है.7. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीडी 14 और सीडी 11 बी धुंधला हो जाना। U937 मोनोसाइट्स और CD11B U937 के CD14 धुंधला हो जाना 3D आंतों के समकक्षों (Caco-2/U937/L929 सह-संस्कृतियों) में विभेदित मैक्रोफेज बिना किसी अतिरिक्त प्रोटीन (नियंत्रण [CTRL]) या 40 μg/mL कुल प्रोटीन के संपर्क में आते हैं। सीडी 14 और सीडी 11 बी धुंधला के लिए, तेजी से लाल को क्रोमोजेन के रूप में इस्तेमाल किया गया था और नाभिक को ईोसिन के साथ प्रतिवाद किया गया था। प्रत्येक छवि में स्केल बार 20 माइक्रोन के बराबर होता है। फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (हरा) के साथ सीडी 14 और सीडी 11 बी धुंधला भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस के तहत दिखाया गया था। नाभिक को 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ प्रतिवाद किया गया था। प्रत्येक छवि में स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होता है। तीर मोनोसाइट्स (सीडी 14 सकारात्मक कोशिकाओं) और मैक्रोफेज (सीडी 11 बी सकारात्मक कोशिकाओं) की उपस्थिति का संकेत देते हैं। यह आंकड़ा Truzzi एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है.7. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला, और अल्कियन ब्लू/आवधिक एसिड-शिफ दाग (पीएएस) धुंधला से बलगम अभिव्यक्ति। (ए) मूल 3 डी आंतों समकक्षों (काको-2 / यू 937 / एल 929 सह-संस्कृतियों) में कैको -2 कोशिकाओं को अनुपचारित समकक्ष और 1 एनजी / एमएल लिपोपॉलेसेकेराइड के संपर्क में आंतों के श्लेष्म मॉडल सिस्टम में 24 घंटे के बाद। प्रत्येक छवि में स्केल बार 50 माइक्रोन के बराबर होता है। (बी) बलगम अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव एक तरफा विचरण (एनोवा) द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसका महत्व **** पी < 0.0001 के रूप में रिपोर्ट किया गया था। काले बिंदु प्रतिकृतियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा Truzzi एट अल.16 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: मिडकिन अभिव्यक्ति। अनुपचारित नियंत्रण (CTRL) और आंतों के श्लेष्म मॉडल सिस्टम में 24 घंटे के बाद 3D आंतों के समकक्षों (Caco-2 /U937/L929 सह-संस्कृतियों) के माध्यम में मिडकिन अभिव्यक्ति 1ng/mL लिपोपॉलेसेकेराइड के संपर्क में आती है। मिडकाइन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव एक-तरफ़ा विचरण (एनोवा) द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसका महत्व **** पी < 0.0001 के रूप में रिपोर्ट किया गया था। यह आंकड़ा Truzzi एट अल.16 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: आंतों के समकक्षों के निर्माण और प्रयोगात्मक उपयोग का प्रतिनिधित्व करने वाला योजनाबद्ध आरेख, साथ ही ऊतक वर्गों से मापदंडों के निर्धारण और सूक्ष्म विश्लेषण। योजनाबद्ध आरेख आंतों के समकक्षों के निर्माण और संभावित प्रयोगात्मक उपचारों को बताता है जिन्हें इन मॉडलों को प्रशासित किया जा सकता है। एक ही प्रयोग से कई ऊतक वर्गों की पीढ़ी आंतों के श्लेष्म के कई संरचनात्मक और प्रतिरक्षा पहलुओं के विश्लेषण की अनुमति देती है, जैसा कि चित्र 1, चित्रा 2, चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

बुनियादी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल प्रणाली यहाँ प्रस्तुत (चित्रा 6) प्रयोगात्मक सादगी के साथ शारीरिक जटिलता (अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी सेल संस्कृतियों एक ईसीएम अमीर लामिना propria समर्थन fibroblasts और monocytes युक्त समर्थन के साथ एक Caco-2 monolayer युक्त) को जोड़ती है (वाणिज्यिक मानव सेल लाइनों का उपयोग मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली का उत्पादन करने के लिए)13. जैसे, इस मॉडल प्रणाली को आंतों की बाधा अखंडता पर संभावित औषधीय दवाओं / खाद्य घटकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से म्यूरिन मॉडल के लिए एक उपयुक्त विकल्प माना जाता है। इस संबंध में, पिछले लेख दोनों संभावित लाभकारी यौगिकों (प्लस खुराक निर्भरता) के साथ ही हानिकारक खाद्य घटकों 7,16,17 के परीक्षण में वर्तमान सेल संस्कृति मॉडल की प्रभावकारिता की पुष्टि. इसके अलावा, एलपीएस या वैकल्पिक प्रो-भड़काऊ अभिकर्मकों (2,4,6-ट्रिनिट्रोबेंजीन सल्फोनिक एसिड या डेक्सट्रान सल्फेट सोडियम) को आईबीडी लक्षणों का अनुकरण करने के लिए वर्तमान आंतों के श्लेष्म मॉडल में जोड़ा जा सकता है। ऐसा करने में, संरचनात्मक पहलू से आंतों के रोगों के एटियलजि का अध्ययन करना संभावित रूप से संभव है, साथ ही साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति से, जैसे कि प्रो-इंफ्लेमेटरी एमडीके, जो आईबीडी15 का एक मार्कर है। इस बुनियादी मॉडल प्रणाली में व्यापक आबादी के लिए अंतिम दवा स्क्रीनिंग क्षमता भी है। हालांकि मॉडल प्रणाली शारीरिक रूप से 2 डी मॉडल13,14 की तुलना में अधिक जटिल है, जटिल मानव शरीर क्रिया विज्ञान पुन: पेश करने में सीमाओं में एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली (पोषक तत्वों की निरंतर आपूर्ति के द्रव छिड़काव और अपशिष्ट उत्पादों के साथ-साथ यांत्रिक उत्तेजनाओं को हटाने)8,14 और माइक्रोबायोम (आंतों के रोगों में मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन का मूल्यांकन)8, 14.

उपकला बाधा अखंडता के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग के साथ संयोजन में वर्तमान बुनियादी 3 डी आंतों के श्लेष्म मॉडल का उपयोग करने का लाभ यह है कि कई ऊतक वर्गों को एक ही प्रयोग से बनाया जा सकता है, जिससे कई मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। ट्रांसपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर)3 आंतों की बाधा अखंडता का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है और इसका उपयोग मैक्रोमोलेक्यूलर पारगम्यता अध्ययन 3,18 के साथ-साथ टीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति के पश्चिमी धब्बा मूल्यांकन पर व्यापक रूप से रिपोर्ट किए गए अध्ययनों के साथ संयोजन के रूप में किया गया है।  पश्चिमी धब्बा मूल्यांकन प्रोटीन अभिव्यक्ति में समग्र परिवर्तनों में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, और टीईईआर बाधा अखंडता के मात्रात्मक उपाय के रूप में कार्य करता है। इसके बजाय, सूक्ष्म मूल्यांकन गुणात्मक दृश्य और स्थानीय प्रोटीन परिवर्तन और बातचीत18 के आकलन के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है.

एक प्रतिरक्षा घटक के साथ एक मॉडल का सूक्ष्म मूल्यांकन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दृश्य की अनुमति देता है, जैसे कि मैक्रोफेज में मोनोसाइट्स का भेदभाव और ईसीएम में सक्रिय मोनोसाइट्स का प्रवास, जैसा कि सीडी 14 और सीडी 11 बी धुंधला द्वारा यहां दिखाया गया है। पहचान इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और/या इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से व्यक्तिगत ऊतक वर्गों पर किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 3में सीडी14 और सीडी11बी के लिए दिखाया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक पूरे के रूप में पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म ऊतक के संरचनात्मक दृश्य की अनुमति देता है। इसके अलावा, कोशिकाओं में नाभिक और साइटोप्लाज्म दोनों की पहचान करना संभव है। इसके विपरीत, कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऊतक को समग्र रूप से देखने की अनुमति नहीं देता है (केवल ब्याज के मार्कर और डीएपीआई-सना हुआ नाभिक)। हालाँकि, यह एक बहुत ही साफ छवि प्रदान करता है जहाँ पृष्ठभूमि का रंग समाप्त हो जाता है। इसका लाभ यह है कि यह मार्करों की सकारात्मकता या नकारात्मकता को प्रमाणित करने में अधिक सटीकता की अनुमति देता है और इस तरह, रंग तीव्रता में किसी भी अंतर की गणना (उदाहरण के लिए, एक मार्कर जो एक सेल में दूसरे की तुलना में अधिक व्यक्त किया जाता है)। संभावित रूप से लामिना प्रोप्रिया के भीतर से सीडी 14 मोनोसाइट्स के कैको -2 मोनोलेयर में प्रवास की सीमा का अनुमान विभिन्न समय बिंदुओं पर ली गई कई प्रतिकृति छवियों से भी लगाया जा सकता है। बहरहाल, सीडी 14 और सीडी 11 बी दाग कोशिकाओं दोनों की उपस्थिति से सूजन के सबूत स्पष्ट थे।

20-40 माइक्रोग्राम कुल प्रोटीन की एक सीमा पश्चिमी सोख्ता19 के लिए प्रयोगशालाओं के बहुमत द्वारा प्रयोग किया जाता है. कई अंतराल जंक्शन प्रोटीन (occludin, claudin, zonulin, और ई-caderin) की मात्रा का ठहराव immunohistochemical और / या व्यक्तिगत ऊतक वर्गों पर फ्लोरोसेंट धुंधला द्वारा किया जा सकता है, क्रमशः काफी कम प्रोटीन की आवश्यकता है. समवर्ती रूप से, एक ही प्रयोग से, यौगिकों के जवाब में उपकला परत की अखंडता को एच एंड ई धुंधला के साथ कोशिकाओं के पैटर्न, आकार और संरचना से भी देखा जा सकता है।

बलगम उत्पादन, टीजे प्रोटीन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से उत्पादित प्रोटीन धुंधला करने में उपयोग के लिए एक बुनियादी 3 डी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म की प्रभावकारिता महत्वपूर्ण कदमों पर काबू पाने पर निर्भर है, विशेष रूप से मॉडल प्रणाली के निर्माण में और ऊतक निर्धारण के दौरान।  मॉडल निर्माण के संबंध में, सही संगम का उपयोग करना और क्रमशः कैको -2 कोशिकाओं (प्रोटोकॉल में नोट्स द्वारा इंगित) की सही संख्या को बोना, मौलिक है। बहुत अधिक कोशिकाओं या गलत संगम के परिणामस्वरूप एक मोटी और अव्यवस्थित उपकला परत होगी। इसके बजाय, बहुत कम कोशिकाओं के परिणामस्वरूप या तो कम या उपकला परत गठन की कमी होगी। सीडिंग में समान रूप से मौलिक सही सेल संगम और ईसीएम में L929 और U937 कोशिकाओं की संख्या है, साथ ही तैयारी के दौरान कोलेजन की सही हैंडलिंग भी है। कोलेजन की अतिरिक्त कोशिकाओं या तेजी से पोलीमराइजेशन के परिणामस्वरूप एक कॉम्पैक्ट और विकृत ईसीएम होगा, बदले में ऊपर उपकला कोशिकाओं की संरचना पर प्रभाव पड़ेगा। इसी तरह, बहुत कम कोलेजन बनाने वाली L929 कोशिकाओं के परिणामस्वरूप ECM की गलत स्थिरता होगी, जबकि बहुत कम U937 मोनोसाइट्स प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पक्ष नहीं लेंगे। यह भी महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं का उपयोग 5 दिनों के बाद प्रयोग के लिए किया जाता है, क्योंकि लंबे समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप अत्यधिक कोशिका वृद्धि होती है जिसके परिणामस्वरूप एक कॉम्पैक्ट उपकला परत होती है। इसके अलावा, यह देखते हुए कि वर्तमान डिजाइन में एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली का अभाव है और एक स्थिर आंतों के सेलुलर मॉडल का प्रतिनिधि है, अणुओं की रिहाई और कोशिकाओं की वृद्धि और उत्तेजना के पक्ष में, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि माध्यम को हर दिन बदला जाए। निर्धारण प्रोटोकॉल के बारे में, समाशोधन चरण महत्वपूर्ण है और यह देखते हुए कि ऊतकों को पैराफिन में पारदर्शी बनने के लिए आवश्यक समय भिन्न हो सकता है, प्रत्येक आंतों के श्लेष्म प्रणाली को इस चरण के दौरान बारीकी से देखा जाना चाहिए। निर्धारण प्रक्रिया के दौरान, इन मॉडलों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए उन्हें संभालने में सावधानी बरतनी चाहिए।

अंत में, बशर्ते बुनियादी 3 डी आंतों के समकक्षों के निर्माण और निर्धारण में महत्वपूर्ण बिंदुओं का सख्त पालन किया जाता है, मॉडल दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता अध्ययन में कई मापदंडों के मूल्यांकन के लिए कई ऊतक अनुभाग प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

शोधकर्ता के काम का समर्थन करने वाली फैलोशिप के लिए अम्बर्टो वेरोनेसी फाउंडेशन के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue/PAS kit ScyTek Laboratories, Inc. APS-1, APS-2 kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solution Thermo Fisher 15250061 cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells ATCC ATCC HTB-37 cell line
Citro-Histo-Clear Limonene based Histoline laboratories R0050CITRO reagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO 11965092 cell colture reagent
Embedding Center Histoline laboratories TEC2900 instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO A5256701 cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 12350039 cell colture reagent
Human Midkine ELISA kit Cohesion Biosciences CEK1270 kit ELISA
Inverted microscope Eclipse Ts2, Nikon MFA34100 microscope
L929 mouse fibroblasts ATCC ATCC ®-CCL1 cell line
LC3-II Novus Biologicals NB910-40752SuperNovusPack antibody
L-Glutamine GIBCO A2916801 cell colture reagent
Occludin Novus Biologicals NBP1-87402 antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C Histoline laboratories R0040 PLUS instrument for paraffin embedding
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
rat tail collagen type I GIBCO A1048301 cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) GIBCO 21870076 cell colture reagent
Sodium pyruvate GIBCO 11360070 cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher TF-CACC2FL cell counting instrument
Transwell Costar Corning 3413 plastic for cell colture
Trypsin GIBCO 15090046 cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line ATCC ATCC CRL-1593.2 cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit ScyTek Laboratories, Inc. AMH080 kit for immunohistochemical staining

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Truzzi, F., Dilloo, S., Chang, X., Whittaker, A., D'Amen, E., Dinelli, G. Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component. J. Vis. Exp. (199), e65484, doi:10.3791/65484 (2023).

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