Summary
ここでは、基本的な3次元(3D)腸細胞株モデルシステムの構築と、固定された腸当等物の光学顕微鏡的評価のためのパラフィン包埋プロトコルについて説明します。選択したタンパク質を染色することで、1回の実験で複数の視覚的パラメータを解析し、前臨床薬物スクリーニング研究に活用することができます。
Abstract
炎症性腸疾患の病態生理学の研究、潜在的に有益な物質の薬理学的スクリーニング、および潜在的に有害な食品成分の毒性研究のために、 in vivo および in vitro 腸モデルの使用が増加しています。関連して、動物モデルに代わる細胞ベースの in vitro モデルの開発が現在求められています。ここでは、細胞株を使用した基本的な「健康な組織」の三次元(3D)腸と同等モデルのプロトコルが、実験のシンプルさ(標準化され、容易に再現可能なシステム)と生理学的複雑さ(U937単球とL929線維芽細胞の支持免疫成分を持つCaco-2腸細胞)の両方を提供するという二重の利点を備えています。このプロトコルには、固定腸当量物の光学顕微鏡評価のためのパラフィン包埋も含まれており、それによって1回の実験から複数の視覚パラメータを分析するという利点を提供します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した切片は、対照処理でCaco-2柱状細胞がタイトで規則的な単層を形成していることを示すもので、実験システムとしてのモデルの有効性を検証するために使用されます。グルテンを炎症誘発性食品成分として使用し、切片から分析したパラメータには、単層の厚さの減少、基礎となるマトリックス(H&E)からの破壊と剥離、オクルージン染色(統計的に定量化可能)から示されるようなタイトジャンクションタンパク質発現の減少、分化クラスター14(CD14)染色とCD11b関連のマクロファージへの分化から証明される遊走U937細胞の免疫活性化が含まれます。リポ多糖類を用いて腸の炎症をシミュレートすることによって示されるように、測定可能な追加のパラメータは、粘液染色の増加および固定前に培地から抽出することができるサイトカイン発現(ミッドカインなど)である。基本的な3次元(3D)腸粘膜モデルと固定切片は、複数の視覚的に定量化可能なパラメータを分析する可能性を備えた炎症状態とバリアの完全性の研究に推奨できます。
Introduction
腸管上皮関門は、異なる種類の上皮細胞を含む1細胞厚の内層であり、身体の外部環境と内部環境との間の最初の物理的防御障壁または界面を構成する1,2。円柱型腸細胞は、上皮細胞の中で最も豊富なタイプを構成します。これらは、タイトジャンクション(TJ)を含むいくつかのバリアコンポーネント間の相互作用を通じて上皮バリアの完全性を維持する役割を担っており、バリアの引き締めに重要な役割を果たしています1,3。TJ構造は、閉塞帯帯(ZO)やシングリンなどの細胞内プラークタンパク質からなり、オクルージン、クローディン、接合接着分子(JAM)などの膜貫通タンパク質と協働して、隣接する細胞を緊密につなぐジッパー状の構造を形成します3,4。膜貫通型タンパク質は、低分子化合物の受動的な傍細胞拡散を調節し、有毒な高分子を排除します。
潜在的に有毒な食品化合物や食品汚染物質は、炎症性サイトカイン産生を刺激し、上皮透過性を破壊し、免疫細胞を活性化し、慢性的な腸組織の炎症を引き起こします5,6,7。対照的に、さまざまな抗酸化および抗炎症性植物化学物質は、TJタンパク質の発現と組み立ての回復を通じて、炎症性サイトカインの発現を減少させ、腸のTJバリアの完全性を高めることが報告されています4,6,8。したがって、有益な化合物と有害な化合物の両方による上皮バリアの完全性の調節により、医薬品スクリーニングおよび毒性試験のための腸管バリアを模倣することを目的としたin vivoおよびin vitroモデルの両方の使用が増加しています。これは、腸管疾患(IBD)、壊死性腸炎、および癌の病態生理学を理解することへの関心が高まっていることを考えると、特に関連性があります8,9,10。
動物実験における「3R」の目的を達成するために、細胞ベースのin vitroモデルの開発が求められています。これらには、動物の使用に代わる代替手段、使用される動物の数の削減、および苦痛を軽減する方法の採用の改良が含まれます11,12,13。さらに、ヒトモデルとマウスモデル(げっ歯類が最も広く使用されている種)の根底にある分子、細胞、および生理学的メカニズムは独特であり、ヒトの応答における予測因子としてのマウスモデルの有効性に関する論争につながっています12,13。in vitroヒト細胞株モデルの多くの利点には、標的制限実験、直接観察、および連続分析が含まれます13。
2次元(2D)培養における単細胞型単分子膜は、強力なモデルとして役立っています。しかし、これらはヒト組織の生理学的複雑さを正確に再現することはできない8,13,14。その結果、次世代のリスク評価ツールボックスとして、健康な腸組織と病気の腸組織の両方の生理学的複雑さを再現するために、ますます改善された3D培養システムが開発されています13,14。これらのモデルには、多様な細胞株を備えた3Dトランズウェルスキャフォールド、オルガノイド培養物、細胞株とオルガノイド(健康な組織と病気の組織の両方に由来する)の両方を使用したマイクロ流体デバイス(腸管オンチップ)が含まれます8,13,14。
本研究で提示された3D「健康な組織」腸と同等のプロトコルは、生理学的複雑さと実験の単純さのバランスをとることに基づいていました13。このモデルは、3つの細胞株(腸細胞[ゴールドスタンダードの結腸腺癌Caco-2株]と支持免疫成分[U937単球およびL929線維芽細胞])で構成され、腸上皮バリアの完全性と免疫応答に関心のある食物分子の予備スクリーニングに適用可能な標準化された再現性のあるシステムを構成する3Dトランズウェルスキャフォールドの代表例です。プロトコルは固定腸の等量を使用して上皮障壁の完全性の光学顕微鏡評価のためのパラフィンの埋め込みを含んでいる。本アプローチの利点は、1回の実験で複数のパラメータについて、包埋組織の多数の切片を染色することができることである。
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Protocol
1. 基本的な3D再建腸粘膜モデルの作成
注意: 手順全体は、滅菌層流フードで実行する必要があります。細胞インキュベーターの使用を含む手順のすべてのステップは、培養物が5%CO2 を含む加湿雰囲気中で37°Cでインキュベートされることを意味します(プロトコルに別段の記載がない限り)。
- 腸管モデル系で使用する細胞株の事前調製
- 2 mM L-グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)5 mLの濃度でL929マウス線維芽細胞をF25フラスコに播種し、腸モデルの構築の4日前にインキュベーターで培養します。48時間後、ピペットを使用して培地を取り除きます。次に、新鮮な培地(5 mL)を加え、細胞をさらに48時間インキュベートします。
注:セルは、使用する前に80%コンフルエントである必要があります。 - Caco-2細胞(濃度2 x 106)を10 mLのDMEM培地(10%FBSおよび1%Pen-Strepを含む)のF75細胞フラスコに播種し、腸粘膜モデルを構築する4日前にインキュベーターで培養します。48時間後、ステップ1.1.1の説明に従って培地を交換し、さらに48時間インキュベートしてコンフルエントが80%になります。
注:細胞は活発な増殖期にある必要があります:まばらすぎず、コンフルエントすぎない。50〜60%のコンフルエンスが推奨されます。モデルを作る前日に細胞を播種してはいけないのは、細胞の増殖能力が遅くなり、再構築された3Dモデルに完全に根付かなくなるからです。 - 懸濁液中で増殖するU937細胞(濃度1 x 106)を、モデルセットアップの2日前にF75細胞フラスコに10 mLのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地(2 mM L-グルタミン、1%ピルビン酸ナトリウム、10%FBS、および1%ペン連鎖球菌を含む)に加え、インキュベーターに48時間置きます。
- 2 mM L-グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)5 mLの濃度でL929マウス線維芽細胞をF25フラスコに播種し、腸モデルの構築の4日前にインキュベーターで培養します。48時間後、ピペットを使用して培地を取り除きます。次に、新鮮な培地(5 mL)を加え、細胞をさらに48時間インキュベートします。
- トランズウェル共培養プレートインサートの調製
- 0.4 μmフィルター付きインサートを含む24ウェルプレートをお選びください。
注:0.4 μmフィルターは、薬物輸送研究における標準的な選択肢です。3 μmおよび8 μmのフィルターサイズは、コラーゲン包埋細胞の損失を防ぐために推奨されません。 - ピペットを使用して、トランズウェルフィルター(以下、メンブレンインサートと呼ぶ)を、フィルターインサートの上下に500 μLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)で水和させます。
- マルチウェルプレートを閉じ、インキュベーターに最低2時間入れます。
注意: メンブレンインサートは、HBSSに最大24時間留置できます。この操作は、モデルを構築する前日に実行できます。メンブレンインサートが完全に水和し、フィルターが乾燥しないことが重要であると、サンプルが適切に付着しにくくなる可能性があります。 - 2時間(または24時間)後にインキュベーターからプレートを取り外します。ピペットを使用してメンブレンインサートの上下からHBSSを注意深く吸引し、10分間乾燥させます。
- 0.4 μmフィルター付きインサートを含む24ウェルプレートをお選びください。
- 基本3D腸管モデルシステムの無細胞コラーゲン固有層の作製(1日目)
- 10%ウシ胎児血清(FBS)、200 mM L-グルタミン、1%重炭酸ナトリウム、1.35 mg/mLタイプ1ラット尾部コラーゲンを含む氷上の50 mL滅菌チューブで無細胞コラーゲン溶液を調製します。
注:これらのコンポーネントはすべて氷上に保管し、冷却したピペットチップでDMEMに追加する必要があります。タイプ1ラットテールコラーゲンは、温度とpHの上昇とともに重合するため、最後に添加する必要があります。調製される無細胞コラーゲン溶液の量は、必要な腸当量の数によって異なります。 - 250 μLの溶液を各プレートインサート(メンブレンフィルターの上)に、選択した腸当量の数だけ添加し、マルチウェルプレートの上に蓋を置きます。コラーゲン溶液を層流フード下で室温(RT)で重合させます。
注:より固相への移行とは別に、重合は黄色からピンクへの色の変化からも明らかです。重合は通常10〜15分以内に完了します。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)、200 mM L-グルタミン、1%重炭酸ナトリウム、1.35 mg/mLタイプ1ラット尾部コラーゲンを含む氷上の50 mL滅菌チューブで無細胞コラーゲン溶液を調製します。
- 線維芽細胞(L929)および単球(U937)細胞のモデルシステムへの調製、細胞計数、および添加(DAY 1)
- L929細胞培養(ステップ1.1.1)をインキュベーターから取り出します。真空ポンプを使用して培地を吸引し、5 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、CaおよびMgを含まない)と交換し、細胞をすすぎます。
- 真空ポンプでPBSを吸引します。調製済みのトリプシン-EDTA溶液(PBS中の0.05%トリプシンおよび0.02%EDTA)2 mLを加え、インキュベーターに3〜5分間入れます。
- 倒立顕微鏡(Eclipse Ts2、Nikonなど)を使用して、細胞が接着面から剥離しているかどうかを確認します。これが発生した場合は、直ちに2 mLのDMEM(10%FBSを含む)を添加してトリプシン反応をブロックし、細胞をすすぎます。
- 細胞溶液を滅菌済みの15 mLチューブに移し、645 x g で5分間遠心分離します。真空ポンプを用いて、上澄み液を吸引する。
注意: ペレットを乱さないように注意する必要があります。DMEMの効果はL929およびU937細胞で試験され、増殖に悪影響を及ぼすことは示されませんでした。 - 1 mLのDMEMをペレットに加え、細胞を懸濁します。
注:細胞は溶液中で均一に懸濁されている必要があります。 - DMEMで20 μLの細胞を除去し、20 μLのトリパンブルー溶液を加えます。20 μLの混合物を除去し、細胞計数チャンバーを使用して細胞密度を顕微鏡で評価します。
- U937細胞培養(ステップ1.1.3)をインキュベーターから取り出します。細胞溶液を645 x g で5分間遠心分離します。真空ポンプを使用して、ペレットを乱さないように上澄み液を吸引します。
- 細胞を1 mLのRPMIに懸濁します。L929細胞と同様に、細胞が溶液中に均一に懸濁されていることを確認してください。
- 同様に、ステップ 1.4.6 で報告したようにセル密度を確立します。
- ステップ1.3.1の説明に従ってコラーゲン溶液を調製します。
注:作製する溶液の量は、各インサート(またはモデル)で450 μLを考慮する必要があります。 - 構築する腸当量モデルごとに、それぞれ50,000個のL929細胞と15,000個のU937細胞を50μLの容量で含むDMEM溶液を調製します。
注:セルの数は重要な要素です。両方の細胞タイプが多すぎると、適切に組織化されていない細胞で過度に満たされた固有層になります。線維芽細胞(コラーゲンを生成する)の数が少ないと、固有層がコンパクトになりにくくなり、単球が少なすぎると刺激に対する免疫応答が妨げられます。各 50 μL アリコート内に正しい数の細胞が存在する場合、各 24 ウェルプレートに存在する 12 個のフィルターインサートに対して総容量 600 μL を調製できます。 - ステップ1.4.10で、細胞を含む各50μLのアリコートを450μLのコラーゲン溶液に加えます。よく混ぜます。
- プレコートされた無細胞コラーゲン固有層に、各モデルについて500 μLのコラーゲン含有細胞溶液を重ね合わせます。
注:各インサートにボリュームを迅速に追加することが重要であるため、再建された腸粘膜モデルの数を一度に12個以下に制限することをお勧めします。 - プレートを閉じ、インキュベーターに2時間入れて溶液を固まらせます。
- 上皮Caco-2細胞の調製、細胞計数、および腸モデルへの追加(DAY 1)
- Caco-2細胞培養液(ステップ1.1.2)をインキュベーターから取り出します。10 mLのPBSを使用して、手順1.4.1の手順を繰り返して予備すすぎます。次に、事前に調製したトリプシン-EDTA溶液(CaおよびMgフリーPBS中の0.05%トリプシンおよび0.02%EDTA)5 mLを加え、インキュベーターに5〜8分間置きます。
- ステップ 1.4.3 から 1.4.6 まで繰り返して (ただし、トリプシン反応をブロックするために 5 mL の DMEM を使用)、細胞計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。
- 50 μL中に150,000個のCaco-2細胞を含むDMEM溶液を調製します。
注: 使用されるセルの数は重要なポイントです。150,000細胞を超えると、コンパクトで無秩序な上皮層になる可能性がありますが、少なすぎる(100,000未満)と、細胞は成長に苦労し、基底膜を適切に覆わず、不連続な腸上皮層を形成します。セルが効果的に懸濁されていることを確認してください。200 μLピペットのチップを使用して、均一な分布を確保できます。常時12個のモデルを構築できるため、600μLの細胞溶液を調製できます。 - ステップ1.4.14で必要な2時間後、DMEMに懸濁したCaco-2細胞50 μLを各基底膜の中央に加えます。マルチウェルプレートの蓋を閉めます。
- 滅菌層流フードの下で10分間インキュベートします。その後、インキュベーターに30分間移します。
- 10%FBSおよび1%ペン/連鎖球菌を含むDMEM溶液を調製します。
注:モデルごとに 1 mL の容量を使用するのに十分な溶液を調製します。 - 再構成モデルの上に培地を500 μL、フィルターの下に500 μLを加えます。
注意: フィルターの上に培地を追加するときは、細胞が剥がれたりストレスがかかったりしないように注意が必要です。 - マルチウェルプレートシステムを閉じ、インキュベーターに入れます。
- モデルの準備/形成と使用(2日目から6日目)
- 2日目:ピペットを使用して、再構築されたモデルの上とフィルターの下の両方から溶液を慎重に取り除きます。フィルターの上下にそれぞれ、新鮮な 500 μL の新鮮な DMEM(10% FBS および 1% Pen/Strep)と交換します。
- 3日目:上記の手順1.6.1で繰り返します。
- 4日目:上記の手順1.6.1で繰り返します。
注:この腸モデルは静的な細胞モデルです。したがって、分子の放出と細胞の成長と刺激を促進するためには、培地を毎日交換することが非常に重要です。 - 5日目:この時点で、モデルは完全に形成/開発されています。これらのモデルを使用して、さらに調査を行います。
注意: モデルを使用するのに最適な時期は5日です。細胞はインキュベーターで長期間維持できますが、時間が経過するほど、上皮細胞が制御不能に増殖する可能性が高くなり、組織化されていないコンパクトな層になり、使用が困難になります。 - 5 日目に、目的とする毒性成分 (グルテンまたはリポ多糖類 [LPS]) または有益な成分 (ポリフェノール) のいずれかでモデルをインキュベートします。これらを、DMEM培地に吊り下げた再構成モデルの上部に追加します。
注:対象となる各成分の適切な濃度を計算し、DMEM培地に懸濁する必要があります。DMEM培地のみを含む未処理のコントロールは、実験モデルとの比較のために設定する必要があります。 - コントロールモデルと実験モデルをインキュベーターで24時間インキュベートします。
- 6日目:フィルターの上下の培地をピペットで取り除きます。
注:培地は、炎症性サイトカインの放出を測定するためのその後の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)タイプのテストのために保存できます。この目的のために、培地を滅菌バイアルに添加し、さらなる分析のために-20°Cで保存しなければならない。
2. 再建された腸粘膜モデルのパラフィン包埋
注意: 手順全体は、化学ヒュームフードの下で実行する必要があります。各ステップとそれぞれの時間配分を厳守する必要があります。このため、すべての試薬を事前に準備しておくことが重要です。
- パラフィンマシンを58°Cに設定して、使用できる状態にします。
- メンブレンインサートを、滅菌済み24ウェルプレートのペンチを使用して洗浄ウェルに移します。
- PBS中の37%緩衝ホルマリン500 μLをフィルターの上に、1 mLをフィルターの下に添加します。蓋を閉め、室温で薬液ヒュームフードの下に2時間放置します。
注:別の方法として、4%緩衝ホルマリンを室温で1時間使用できます。 - ホルマリンを取り除き、フィルターの上と下の両方にHBSS溶液を追加します。次に、HBSSを取り外します。
- 固有層をメンブレンインサートから取り外します。
注:腸粘膜の細胞は、通常、膜インサートに付着していないため、メンブレンインサートから非常に簡単に剥離します。さらに、2つのサンプルコンパートメント(頂端と基底部)は取り付けられたままで、3D構造が保持されます。何らかの理由で腸粘膜が容易に剥離しない場合は、滅菌された使い捨てメスの刃を使用して、膜インサートから腸粘膜を除去することが重要になります。メンブレンインサートを切断して、プラスチックから取り外すことができます。メスでサンプルに触れないように注意してください。コラーゲン包埋細胞からメンブレンインサートを除去する動機は、このフィルターがその後の固定またはパラフィン包埋段階で剥離し、腸粘膜モデル間の比較が不均衡になる可能性があるためです。さらに、埋め込まれた切片内のメンブレンインサートは、切片形成を妨げる可能性のある異なる粘稠度を持っています。 - 100 mLビーカーを化学ヒュームフードの下に置き、それぞれに調査中の1つの再建された腸粘膜モデルシステムを含むように正しくラベル付けします。各ビーカーに25 mLの35%ETOHを加え、再建された腸粘膜を追加します。10分間インキュベートします。
- 35%エタノールを25 mLの50%エタノールに置き換え、10分間インキュベートします。
- 50%エタノールを25 mLの70%エタノールと交換し、10分間インキュベートします。
- 70%エタノールを25 mLの80%エタノールに置き換え、10分間インキュベートします。
- 80%エタノールを25 mLの95%エタノールに置き換え、10分間インキュベートします。
- 95%エタノールを25 mLの100%エタノールに置き換え、10分間インキュベートします。
- 100%エタノールを100%エタノールの別の25 mL交換物と交換し、10分間インキュベートします。
- 100 mLビーカーをドラフトの下に置き、それぞれに調査中のモデルが1つ含まれるように正しくラベル付けします。50 mLのキシレンまたは組織学的透明化剤を10〜20分間加えます。
注:Histo-Clear(組織学的透明化剤)は、好酸性染色の透明度と鮮やかさを高めるため、推奨されます。除去時間は、再建された腸粘膜サンプルごとに異なる可能性があり、2〜3分ごとに外観の透明性をチェックする必要があります。 - サンプルが透明になったらすぐに、金属製のティッシュカセットホルダーに入れ、加熱された機械内で流動パラフィンに45分間浸します。
- パラフィンを交換し、サンプルを加熱した機械内にさらに45分間放置します。
- ティッシュカセットホルダーを取り外し、氷の上に置いて冷まします。冷却されたサンプルブロックが金属ホルダーから外れると、室温でさらに冷却できます。
- ブロックを RT に保存します。
注意: 目的が切片をすぐに準備することであるならば、ブロックは使用時にそれらが十分に冷却されるように4°Cに置くことができる。 - ミクロトームを用いて4μm切片を切断する。
- 切断した部分をスライドに置き、37°Cのオーブンで24時間乾燥させます。
- スライドを使用する準備が整いました。H&E組織学的染色または免疫組織化学反応染色(抗原抗体型)を行うまで、室温で保存してください。
- 免疫組織化学的染色では、目的の抗体(オクルジンなどのTJタンパク質の研究、または単球の活性化、遊走、分化)を選択し、市販のキットを使用して発現を(染色を介して)検出します。
- 同様に、アルシアンブルーおよび過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色キットを使用して粘液を測定します。
- 顕微鏡で採取した顕微鏡写真上の陽性ピクセルの割合を計算することにより、オクルジンなどの目的の染色されたTJタンパク質を定量します。
- 画像解析ソフトウェア(ImageJ2ソフトウェア[Wayne Rasband、バージョン2.9.0/1.53t]など)を使用して細胞の画像を解析します。
- ピクセルの解析を実行するには、デジタル画像を 300 ピクセル/インチに処理し、8 ビットに変換します。次に、 Color Deconvolution プラグインでバイナリ画像を処理し、目的のタンパク質の染色(この場合はオクルージンの永久赤色染色)を分析します。
- 選択した画像をtiffとして保存し、グラフィックエディタ(Adobe PhotoshopCC [バージョン20.0.4]など)でアーティファクトを排除するための「クリーンアップ」手順を実行します。
- その後、ImageJ2の Analyze Particle Analyze アプリケーションで対象分野をすべて測定し、そのデータを画素数として報告します。
注:各実験は、各反復に対して3つの内部複製フィールドを分析して、3回に分けて実行する必要があります。粘液の定量化には、ピクセルを測定するのと同じ原理を、紫色マゼンタ色に染色された中性ムチンと明るい青色に染色された酸性粘液の画像にそれぞれ適用できます。
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Representative Results
最初の重要な側面は、実験目的で基本的な3D腸当量粘膜の受容性を決定することです。これは、組織学および組織病理学の研究室で最も広く使用されている染色、すなわちヘマトキシリン(核物質を濃い青紫色に染色)およびエオシン(ピンクのさまざまな色合いの細胞質物質を染色)で行います。H&E染色は、まず未処理のコントロールで行い、実験的処理と同じ条件と時間枠で培養します。細胞のパターン、形状、構造を可視化することで、この腸管細胞モデルシステムの成功は、5日後にCaco-2細胞が細胞外マトリックス(ECM)に富む固有層の上にタイトで規則的な単層を形成することによって決定されます(図1A)。さらなる分析に適さないと判断されるモデル系の例には、10日後に示されているように、上皮層が乱れて過剰に増殖するものが含まれます(図1B)。別の例としては、過剰なCaco-2細胞の播種または過度のインキュベーションによって引き起こされる、厚すぎて混乱した上皮層があります(図1C)。奇形(図1D)は、増殖の活発な段階にない播種細胞、固有層の調製中またはパラフィンによる固定中の問題(細胞が剥離/破壊された)のいずれかに起因し、許容できない再建された腸粘膜の一例でもあります。同様に、上皮層形成の欠如(図1E)は許容できないが、これはCaco-2細胞の播種が少なすぎるか、固有層の調製に問題があることを示している。複数の切片を生成できる許容可能な3D腸当量を使用して、1回の実験からさまざまなパラメータを調べることができます。
分析可能な様々なパラメータのうち、炎症誘発性誘導剤に応答するバリアの完全性を可視化し、TJタンパク質を染色して定量し、未処理のコントロールモデルシステムと比較することができます。ここでは、グルテン含量の高いデュラム小麦源由来の総小麦タンパク質40 μg/mLが、細胞の完全性とTJオクルジンタンパク質含有量の両方に対して炎症誘発性効果を発揮することを実証しました7(図2A)。H&E組織学的染色を用いて、対照モデル系はCaco-2柱状細胞がタイトで規則的な単層を形成していることを示しています。対照的に、グルテン含有タンパク質サンプルの効果は、単層の破壊を引き起こし、より非特異的なエオシン染色を引き起こすことが示されました(図2A)。さらに、上皮層の厚さを測定することができ、炎症誘発性グルテンへの曝露後に有意に減少することが示されています(図2A、B)。オクルージンに対する抗体(赤色染色に結合)を用いて、オクルージンタンパク質を可視化し、定量することができました。対照群では、グルテンタンパク質に24時間曝露された腸粘膜と比較して、オクルジンタンパク質含有量が有意に高いことが明らかになりました(図2A、C)。
免疫成分(U937単球に代表される)で構成される腸当量は、単球の活性化、遊走、およびマクロファージへの分化に対する炎症誘発性誘導物質の効果を調べるのにも理想的です。ここでも、グルテン含量の高い小麦源から抽出した40 μg/mLの総小麦タンパク質を使用して、固有層におけるU937単球の炎症誘発性活性化が、高速赤色結合CD14染色から明らかになりました(図3A)。活性化は、この赤色に染色された膜糖タンパク質が単球およびマクロファージ上で発現増加することから検出されます。CD14タンパク質の増加は、免疫蛍光下で緑色に染色されるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)でも検出されました。移動は、Caco-2単分子膜の近くに活性化されたU937細胞が存在することから証明されました。単層が破裂したところでは、U937細胞がCaco-2細胞単層内に侵入していることが示されました(図3A)。対照群では、CD14染色された単球遊走の証拠はありませんでした(図3A)。単球のマクロファージへの分化は、マーカーCD11bから識別できます。 赤色発色剤またはFITCによる対照群では、CD11b染色は明らかではありませんでした(図3B)。代わりに、グルテンに曝露された組織では、CD11bマクロファージがECMに富む固有層と破裂したCaco-2単層の両方で観察されました(図3B)。
LPSを用いて腸の炎症をシミュレートすることで、このモデルシステムを使用して、未処理のコントロールとLPS処理でCaco-2細胞によって産生される酸性ムチンとムコ多糖類をそれぞれ調査することも可能であることを示しています(図4A)。アルシアンブルー染色とPAS染色では、酸性粘液は明るい青色に、中性粘液はパープルマゼンタにそれぞれ染色されます。粘液染色の程度も同様に定量化でき、1 ng/mL の LPS チャレンジで有意に誘導されることが示されています(図 4B)。さらに、固定前に培地を除去して、炎症誘発性サイトカイン産生を調べることができます。多数の排泄性サイトカインを測定できますが、この特定の例では、ミッドカイン(MDK)を選択しました。MDKは、活性化B細胞の転写因子である核因子κ-軽鎖-増強剤(NF-κB)経路によって誘導される内因性炎症マーカーであり、腸細胞の炎症性疾患にも関連しています15。LPSチャレンジでは、MDKは対照群と比較して有意に誘導されます(図5)。
図1:未処理のコントロール3D腸当物。 実験目的での基本的な3D腸粘膜モデルの有効性の検証として、未処理のコントロール3D腸当量(Caco-2 / U937 / L929共培養)のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を24時間行いました。(A)許容可能な実験モデルと許容できないモデルを比較し、10日後に過剰な(B)上皮増殖と無秩序な層、(C)過剰な上皮の厚さと混乱、(D)奇形、および(E)上皮細胞層がないことを示しています。各画像のスケールバーは 50 μm です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:処理された3D腸当物 。 (A)ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の染色、および対照群と比較して、高グルテン含有モダン小麦ミックスから40μg/mLの総タンパク質を24時間曝露した3D腸当量物(Caco-2 / U937 / L929共培養物)のオクルージン発現(CTRL)。各画像のスケールバーは 50 μm です。 (B)Caco-2細胞の厚さの定量化と(C)オクルジン-赤色発色物質染色。有意差は一元配置分散(ANOVA)によって決定され、*** 0.0001
al.7の許可を得て改作したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:CD14およびCD11B染色。 24時間後に、タンパク質を添加していない(コントロール[CTRL])または高グルテン含有モダン小麦ミックスからの総タンパク質40 μg/mLに曝露した3D腸当量(Caco-2/U937/L929共培養物)におけるU937単球およびCD11B U937分化マクロファージのCD14染色。CD14およびCD11b染色では、ファストレッドを発色物質として使用し、核をエオシンで対比染色しました。各画像のスケールバーは20 μmです。 フルオレセインイソチオシアネート(緑色)によるCD14およびCD11b染色も免疫蛍光法下で示されました。核は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で対比染色しました。各画像のスケールバーは 50 μm です。矢印は、単球(CD14陽性細胞)とマクロファージ(CD11b陽性細胞)の存在を示します。この図は、Truzzi et al.7の許可を得て改作したものです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、およびアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)染色による粘液発現。 (A)1 ng/mLのリポ多糖類に曝露された未処理の同等物および再建された腸粘膜モデル系における24時間後の塩基性3D腸当量(Caco-2 /U937/L929共培養)のCaco-2細胞。各画像のスケールバーは 50 μm です。 (B)粘液発現の定量化は一元配置分散(ANOVA)によって決定され、有意性は**** P < 0.0001として報告されました。黒い点は反復数を表します。この図は、Truzzi et al.16の許可を得て改変したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:ミッドカイン発現 1ng/mLのリポ多糖類に曝露された未処理のコントロール(CTRL)および腸粘膜モデル系における24時間後の3D腸当量(Caco-2 / U937 / L929共培養)の培地でのミッドカイン発現。ミッドカイン発現の定量化は一元配置分散(ANOVA)によって決定され、有意性は**** P < 0.0001として報告されました。この図は、Truzzi et al.16の許可を得て改変したものである。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:腸管当等物の構築と実験的使用、ならびに組織切片からのパラメータの固定と顕微鏡分析を表す模式図。 概略図は、腸当量物の構築と、これらのモデルに投与できる可能な実験的治療をまとめたものです。1回の実験で複数の組織切片を生成することで、 図1、 図2、 図3、 図4に示すように、腸粘膜の多数の構造的および免疫的側面の分析が可能になります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する基本的な再建腸粘膜モデルシステム(図6)は、生理学的複雑さ(線維芽細胞と単球を含むECMに富む固有層支持体を持つCaco-2単層を含む、より生理学的に関連性のある3D細胞培養)と実験の単純さ(市販のヒト細胞株を使用して標準化され、再現性のあるシステムを作製する)を兼ね備えています13.そのため、このモデルシステムは、潜在的な医薬品/食品成分が腸バリアの完全性に及ぼす影響を評価することを目的としたマウスモデルの適切な代替手段と見なされています。この点に関して、以前の論文は、潜在的に有益な化合物(および用量依存性)と有害な食品成分の両方をテストする上で、現在の細胞培養モデルの有効性を実証しています7,16,17。さらに、LPSまたは代替の炎症誘発性試薬(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸またはデキストラン硫酸ナトリウム)を現在の腸粘膜モデルに追加して、IBD症状をシミュレートすることができます。そうすることで、腸疾患の病因を構造的側面からだけでなく、IBD15のマーカーである炎症誘発性MDKなどのサイトカインの発現から研究できる可能性があります。この基本モデルシステムは、より広範な集団に対する最終的な薬物スクリーニングの可能性も秘めています。モデルシステムは2Dモデルよりも生理学的に複雑ですが13,14、複雑な人間の生理機能を再現する上での限界には、マイクロ流体システム(栄養素の継続的な供給と老廃物の除去、および機械的刺激の流体灌流)8,14とマイクロバイオーム(腸疾患における宿主とマイクロバイオームの相互作用の評価)8の両方がないことが含まれます。14。
上皮バリアの完全性の光学顕微鏡的評価のためにパラフィン包埋と組み合わせて現在の基本的な3D腸粘膜モデルを使用する利点は、1回の実験から複数の組織切片を作成できるため、多数のパラメータの分析が可能になることです。経上皮電気抵抗(TEER)3は、腸管バリアの完全性を評価するために一般的に使用される方法であり、高分子透過性研究3,18、およびTJタンパク質発現のウェスタンブロット評価に関する広く報告されている研究と組み合わせて使用されています。 ウェスタンブロット評価は、タンパク質発現の全体的な変化に関する定量的な洞察を提供し、TEERはバリアの完全性の定量的尺度として機能します。代わりに、顕微鏡的評価は、局所的なタンパク質の変化と相互作用の定性的視覚化と評価のための貴重なツールを提供します18。
免疫成分を含むモデルの顕微鏡的評価により、CD14およびCD11b染色によって実証されたように、単球のマクロファージへの分化やECMにおける活性化単球の遊走などの免疫応答の可視化が可能になります。同定は、 図3のCD14およびCD11bに示されているように、個々の組織切片の免疫組織化学および/または免疫蛍光染色によって行うことができます。免疫組織化学は、再建された腸粘膜組織全体の構造可視化を可能にします。さらに、細胞内の核と細胞質の両方を識別することが可能です。対照的に、共焦点免疫蛍光法では、組織全体を観察することはできません(目的のマーカーとDAPI染色された核のみ)。ただし、背景色が除去された非常にクリーンな画像を提供します。この利点は、マーカーの正または負の証明をより正確に行うことができるため、色の強度の違い(たとえば、あるセルで別のセルよりも多く表現されているマーカー)の計算が可能になることです。固有層内からCaco-2単分子膜へのCD14単球の移動の程度は、さまざまな時点で撮影された複数の複製画像から推定することもできます。それにもかかわらず、炎症の証拠は、CD14とCD11bの両方の染色細胞の存在から明らかでした。
20〜40μgの総タンパク質の範囲が、ウェスタンブロッティングに大部分のラボで使用されています19。多数のギャップ結合タンパク質(オクルージン、クローディン、ゾヌリン、E-カデリン)の定量は、個々の組織切片の免疫組織化学的染色および/または蛍光染色によって行うことができ、それぞれ必要なタンパク質を大幅に削減できます。同時に、同じ実験から、化合物に応答する上皮層の完全性も、H&E染色による細胞のパターン、形状、および構造から視覚化できます。
粘液産生、TJタンパク質、および免疫応答から産生されるタンパク質の染色に使用するための基本的な3D再構成腸粘膜の有効性は、特にモデルシステムの構築および組織固定中の重要なステップの克服にかかっています。 モデル構築に関しては、正しい合流点を使用し、正しい数のCaco-2細胞(プロトコルの注記で示されている)をそれぞれ播種することが基本です。細胞が多すぎたり、合流点が間違っていたりすると、上皮層が厚く乱れてしまいます。代わりに、細胞が少なすぎると、上皮層の形成が減少または欠如します。播種における同様に基本的なことは、ECMにおける正しい細胞合流点とL929細胞とU937細胞の数、および調製中のコラーゲンの正しい取り扱いです。過剰な細胞やコラーゲンの急速な重合は、コンパクトで奇形のECMをもたらし、その結果、上記の上皮細胞の構造に影響を与えます。同様に、コラーゲンを形成するL929細胞が少なすぎるとECMの一貫性が不正確になり、U937単球が少なすぎると免疫応答が促進されません。また、長時間のインキュベーションでは細胞が過剰に増殖し、上皮層がコンパクトになるため、5日後に細胞を実験に使用することも重要です。さらに、本設計はマイクロ流体システムを欠き、静的な腸細胞モデルを代表していることを考えると、分子の放出と細胞の成長と刺激を促進するために、培地を毎日交換することが非常に重要です。固定プロトコルに関しては、透明化段階が重要であり、組織がパラフィンで透明になるのに必要な時間が異なる場合があることを考えると、この段階で各腸粘膜系を注意深く観察する必要があります。固定手順全体を通して、これらのモデルを損傷しないように、これらのモデルの取り扱いに注意を払う必要があります。
結論として、基本的な3D腸管等価物の構築と固定における重要なポイントに厳守が払われれば、モデルは、医薬品スクリーニングおよび毒性試験における複数のパラメーターの評価のために多数の組織切片を提供することができます。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
ウンベルト・ヴェロネージ財団の研究者活動を支援するフェローシップに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
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