Summary
Här beskriver vi hur man konstruerar ett grundläggande tredimensionellt (3D) testinalt cellinjemodellsystem och ett paraffininbäddningsprotokoll för ljusmikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter. Färgning av utvalda proteiner möjliggör analys av flera visuella parametrar från ett enda experiment för potentiell användning i prekliniska läkemedelsscreeningstudier.
Abstract
Det har skett en ökad användning av in vivo - och in vitro-tarmmodeller för att studera patofysiologin vid inflammatoriska tarmsjukdomar, för farmakologisk screening av potentiellt fördelaktiga ämnen och för toxicitetsstudier av potentiellt skadliga livsmedelskomponenter. Av relevans finns det för närvarande en efterfrågan på utveckling av cellbaserade in vitro-modeller för att ersätta djurmodeller. Här presenteras ett protokoll för en grundläggande, "frisk vävnad" tredimensionell (3D) tarmekvivalent modell med hjälp av cellinjer med den dubbla fördelen att den ger både experimentell enkelhet (standardiserat och lätt repeterbart system) och fysiologisk komplexitet (Caco-2-enterocyter med en stödjande immunkomponent av U937-monocyter och L929-fibroblaster). Protokollet inkluderar också paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av fasta tarmekvivalenter, vilket ger fördelen att analysera flera visuella parametrar från ett enda experiment. Hematoxylin och eosin (H&E) färgade snitt som visar Caco-2 kolonnceller som bildar ett tätt och regelbundet monolager i kontrollbehandlingar används för att verifiera modellens effektivitet som ett experimentellt system. Genom att använda gluten som en proinflammatorisk livsmedelskomponent inkluderar parametrar som analyseras från sektioner minskad tjocklek på monolager, såväl som störning och avlossning från den underliggande matrisen (H&E), minskat tight junction-proteinuttryck som visas från ockludinfärgning (kvantifierbart statistiskt) och immunaktivering av migrerande U937-celler som framgår av kluster av differentiering 14 (CD14) färgning och CD11b-relaterad differentiering till makrofager. Som visats genom att använda lipopolysackarid för att simulera tarminflammation, är ytterligare parametrar som kan mätas ökad slemfärgning och cytokinuttryck (såsom midkine) som kan extraheras från mediet före fixering. Den grundläggande tredimensionella (3D) tarmslemhinnemodellen och fixerade sektioner kan rekommenderas för studier av inflammatorisk status och barriärintegritet med möjlighet att analysera flera visuella kvantifierbara parametrar.
Introduction
Tarmepitelbarriären, en encellig tjock inre beklädnad som innehåller olika typer av epitelceller, utgör den första fysiska försvarsbarriären eller gränssnittet mellan kroppens yttre och inre miljö 1,2. Enterocyter av kolumntyp utgör den vanligaste typen av epitelceller. Dessa är ansvariga för att upprätthålla epitelbarriärens integritet genom interaktioner mellan flera barriärkomponenter, inklusive täta korsningar (TJ), som spelar en viktig roll vid barriäråtdragning 1,3. TJ-strukturen består av intracellulära plackproteiner, såsom zonula occludens (ZO) och cingulin, som samarbetar med transmembranproteiner, inklusive ockludiner, claudiner och junctional adhesion molecules (JAMs) som bildar blixtlåsliknande struktur som tätt förbinder de närliggande cellerna 3,4. De transmembrana proteinerna reglerar den passiva paracellulära diffusionen av små föreningar och utesluter giftiga stora molekyler.
Potentiellt giftiga livsmedelsföreningar och livsmedelsföroreningar stimulerar inflammatorisk cytokinproduktion som stör epitelpermeabiliteten, aktiverar immunceller och orsakar kronisk tarmvävnadsinflammation 5,6,7. Däremot har olika antioxidanter och antiinflammatoriska fytokemikalier rapporterats minska inflammatoriskt cytokinuttryck och förbättra tarmens TJ-barriärintegritet genom återställande av TJ-proteinuttryck och sammansättning 4,6,8. Därför har regleringen av epitelbarriärens integritet av både fördelaktiga och skadliga föreningar lett till en ökad användning av både in vivo- och in vitro-modeller som syftar till att efterlikna tarmbarriären för läkemedelsscreening och toxicitetsstudier. Detta är särskilt relevant med tanke på det ökande intresset för att förstå patofysiologin för tarmsjukdomar (IBD), nekrotiserande enterokolit och cancer, som kan simuleras i experimentella modeller 8,9,10.
Det har funnits en efterfrågan på utveckling av cellbaserade in vitro-modeller för att uppnå målet med "3R" i djurförsök. Det handlar bland annat om ersättningsalternativ till användning av djur, minskning av antalet djur som används och förfining när det gäller att införa metoder som lindrar lidande 11,12,13. Dessutom är de underliggande molekylära, cellulära och fysiologiska mekanismerna mellan mänskliga och murina modeller (gnagare är den mest använda arten) distinkta, vilket leder till kontroverser om murina modellers effektivitet som prediktorer för mänskliga svar12,13. Många fördelar med in vitro-modeller av humana cellinjer inkluderar målbegränsade experiment, direkt observation och kontinuerlig analys13.
Monolager av encellig typ i tvådimensionella (2D) kulturer har fungerat som kraftfulla modeller. Dessa kan dock inte exakt reproducera den fysiologiska komplexiteten hos mänskliga vävnader 8,13,14. Som ett resultat av detta utvecklas 3D-odlingssystem med ständigt ökande förbättringar för att rekapitulera den fysiologiska komplexiteten hos både friska och sjuka tarmvävnader som nästa generations verktygslådor för riskbedömning13,14. Dessa modeller inkluderar 3D Transwell-ställningar med olika cellinjer, organoidkulturer och mikrofluidiska enheter (intestine-on-chip) med både cellinjer och organoider (härledda från både friska och sjuka vävnader)8,13,14.
Det 3D-protokoll för tarmekvivalent "frisk vävnad" som presenterades i den aktuella studien baserades på att hitta en balans mellan fysiologisk komplexitet och experimentell enkelhet13. Modellen är representativ för en 3D Transwell-struktur, bestående av tre cellinjer (enterocyter [guldstandarden kolonadenokarcinom Caco-2-linjen] med en stödjande immunkomponent [U937-monocyter och L929-fibroblaster]), som utgör ett standardiserat och lätt repeterbart system som är tillämpligt för preliminär screening av dietmolekyler av intresse för tarmepitelbarriärens integritet och immunsvar. Protokollet inkluderar paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av epitelbarriärens integritet med hjälp av fasta tarmekvivalenter. Fördelen med det nuvarande tillvägagångssättet är att många sektioner av de inbäddade vävnaderna kan fås att färgas för flera parametrar från ett enda experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av den grundläggande 3D-rekonstruerade tarmslemhinnemodellen
OBS: Hela proceduren måste utföras i en steril laminär flödeshuv. Alla steg i förfarandet med användning av cellinkubatorn innebär att odlingarna inkuberas vid 37 °C i en fuktad atmosfär som innehåller 5 % CO2 (om inte annat anges i protokollet).
- Förberedelse av de cellinjer som används i tarmmodellsystemet
- Frö L929 musfibroblastceller i en koncentration av 5 x 105 i 5 ml av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) innehållande 2 mM L-glutamin, 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin-streptomycin (Pen-streptokocker) i en F25-kolv och odla det i en inkubator 4 dagar före konstruktionen av tarmmodellerna. Efter 48 timmar avlägsnar du mediet med en pipett. Tillsätt sedan färskt medium (5 ml) och inkubera cellerna ytterligare i 48 timmar.
OBS: Cellerna måste vara 80 % sammanflytande innan de används. - Frö Caco-2-celler (koncentration av 2 x 106) i 10 ml DMEM-medium (med 10 % FBS och 1 % Pen-Streptokocker) i en F75-cellkolv och odla den i en inkubator 4 dagar före konstruktionen av tarmslemhinnemodellen. Efter 48 timmar byts mediet enligt beskrivningen i steg 1.1.1 och inkuberas ytterligare i 48 timmar till ett sammanflöde på 80 %.
OBS: Cellerna måste vara i en aktiv prolifererande fas: inte för glesa eller för sammanflytande. Ett sammanflöde på 50-60 % rekommenderas. Cellerna får inte sås dagen innan modellen görs eftersom det skulle kunna bromsa cellernas spridningsförmåga, som då inte skulle slå rot perfekt i den rekonstruerade 3D-modellen. - Tillsätt U937-celler som växer i suspension (koncentration av 1 x 106) till 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (innehållande 2 mM L-glutamin, 1 % natriumpyruvat, 10 % FBS och 1 % Pen-Streptokocker) i en F75-cellkolv 2 dagar före modellinstallationen och placera i en inkubator i 48 timmar.
- Frö L929 musfibroblastceller i en koncentration av 5 x 105 i 5 ml av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) innehållande 2 mM L-glutamin, 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin-streptomycin (Pen-streptokocker) i en F25-kolv och odla det i en inkubator 4 dagar före konstruktionen av tarmmodellerna. Efter 48 timmar avlägsnar du mediet med en pipett. Tillsätt sedan färskt medium (5 ml) och inkubera cellerna ytterligare i 48 timmar.
- Förberedelse av Transwells co-culture plate-insatser
- Välj en 24-hålars platta som innehåller insatser med 0,4 μm filter.
OBS: 0.4 μm-filtret är ett standardval i läkemedelstransportstudier. Filterstorlekarna 3 μm och 8 μm rekommenderas inte för att förhindra eventuella förluster av de kollageninbäddade cellerna. - Använd en pipett och hydrera Transwell-filtren (hädanefter kallade membraninsatser) med 500 μL Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) under och ovanför filterinsatsen.
- Stäng flerbrunnsplattan och placera den i en inkubator i minst 2 timmar.
OBS: Membraninsatserna kan sitta kvar i HBSS i upp till 24 timmar. Den här åtgärden kan utföras dagen innan modellen konstrueras. Det är viktigt att membraninsatserna är helt hydratiserade och att filtret inte torkar ut, eftersom det kan göra det svårare för provet att fästa ordentligt. - Ta bort plattorna från inkubatorn efter 2 timmar (eller 24 timmar). Aspirera försiktigt HBSS uppifrån och under membraninsatserna med en pipett och låt den torka i 10 minuter.
- Välj en 24-hålars platta som innehåller insatser med 0,4 μm filter.
- Beredning av det cellfria kollagenet lamina propria i det grundläggande 3D-tarmmodellsystemet (DAG 1)
- Bered en cellfri kollagenlösning i ett 50 ml sterilt rör på is som innehåller följande komponenter i DMEM: 10 % fetalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin, 1 % natriumbikarbonat och 1,35 mg/ml typ 1 råttsvanskollagen.
OBS: Alla dessa komponenter måste hållas på is och läggas till DMEM med kylda pipettspetsar. Typ 1 råttsvanskollagen måste tillsättas sist eftersom detta polymeriseras med ökande temperatur och pH. Mängden cellfri kollagenlösning som bereds beror på antalet tarmekvivalenter som krävs. - Tillsätt 250 μl av lösningen till varje plattinsats (ovanför membranfiltret) för det antal intestinala ekvivalenter som valts och placera locket över flerbrunnsplattan. Låt kollagenlösningen polymeriseras vid rumstemperatur (RT) under huven för laminärt flöde.
OBS: Bortsett från övergången till en mer fast fas, är polymerisationen också uppenbar från en färgförändring från gul till rosa. Polymerisationen är vanligtvis klar inom 10-15 minuter.
- Bered en cellfri kollagenlösning i ett 50 ml sterilt rör på is som innehåller följande komponenter i DMEM: 10 % fetalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin, 1 % natriumbikarbonat och 1,35 mg/ml typ 1 råttsvanskollagen.
- Beredning, cellräkning och tillägg av fibroblast- (L929) och monocytceller (U937) till modellsystemet (DAG 1)
- Ta bort L929-cellkulturen (steg 1.1.1) från inkubatorn. Använd en vakuumpump för att aspirera mediet, ersätt det med 5 ml steril fosfatbuffertsaltlösning (PBS; utan Ca och Mg) och skölj cellerna.
- Aspirera PBS med hjälp av en vakuumpump. Tillsätt 2 ml av en förberedd trypsin-EDTA-lösning (0,05 % trypsin och 0,02 % EDTA i PBS) och placera i en inkubator i 3-5 min.
- Använd ett inverterat mikroskop (t.ex. en Eclipse Ts2, Nikon) för att fastställa om cellerna lossnar från vidhäftningsytan. Om detta inträffar, tillsätt omedelbart 2 ml DMEM (innehållande 10 % FBS) för att blockera trypsinreaktionen och skölj cellerna.
- Överför celllösningen till ett sterilt 15 ml rör och centrifugera vid 645 x g i 5 minuter. Använd en vakuumpump för att aspirera supernatanten.
OBS: Försiktighet krävs för att inte störa pelleten. Effekten av DMEM testades på L929- och U937-cellerna och visade sig inte ha negativa effekter på tillväxten. - Tillsätt 1 ml DMEM till pelleten och suspendera cellerna.
OBS: Cellerna måste vara homogent suspenderade i lösningen. - Ta bort 20 μl av cellerna i DMEM och tillsätt 20 μl trypanblå lösning. Ta bort 20 μl av blandningen och utvärdera celltätheten mikroskopiskt med hjälp av en cellräkningskammare.
- Ta bort U937-cellkulturen (steg 1.1.3) från inkubatorn. Centrifugera celllösningen vid 645 x g i 5 minuter. Använd en vakuumpump och aspirera supernatanten för att undvika att störa pelleten.
- Suspendera cellerna i 1 ml RPMI. Precis som med L929-cellerna, se till att cellerna är homogent suspenderade i lösningen.
- Fastställ på samma sätt celltätheten enligt vad som anges i steg 1.4.6.
- Bered en kollagenlösning enligt beskrivningen i steg 1.3.1.
OBS: Mängden lösning som ska tillverkas måste ta hänsyn till 450 μL för varje insats (eller modell). - Bered en lösning av DMEM som innehåller 50 000 L929-celler respektive 15 000 U937-celler i en volym av 50 μL för varje testinal ekvivalentmodell som ska konstrueras.
OBS: Antalet celler är en kritisk faktor. För många av båda celltyperna skulle resultera i en lamina propria som är överdrivet full av celler som inte skulle vara tillräckligt organiserade. Ett sämre antal fibroblaster (som genererar kollagen) skulle resultera i en mindre kompakt lamina propria, medan för få monocyter skulle hämma immunsvaret på stimuli. Förutsatt att rätt antal celler finns inom varje 50 μL alikvot kan en total volym på 600 μL beredas för de 12 filterinsatser som finns i varje 24 brunnsplatta. - Tillsätt varje 50 μl alikvot som innehåller cellerna till 450 μl kollagenlösning i steg 1.4.10. Blanda ordentligt.
- Överlägg den förbelagda cellfria kollagenlamina propria med 500 μL av den kollageninnehållande celllösningen för varje modell.
OBS: Det är viktigt att snabbt lägga till volymerna till varje insats, och därför är det lämpligt att begränsa antalet rekonstruerade tarmslemhinnemodeller till 12 eller färre åt gången. - Stäng plattan och placera den i en inkubator i 2 timmar så att lösningen stelnar.
- Beredning, cellräkning och tillägg av epitelceller Caco-2 till tarmmodellen (DAG 1)
- Ta bort Caco-2-cellkulturen (steg 1.1.2) från inkubatorn. Upprepa procedurerna från steg 1.4.1 med 10 ml PBS för preliminär sköljning. Tillsätt sedan 5 ml av en förberedd trypsin-EDTA-lösning (0,05 % trypsin och 0,02 % EDTA i Ca- och Mg-fri PBS) och lägg i en inkubator i 5-8 min.
- Upprepa steg 1.4.3 (men använd 5 ml DMEM för att blockera trypsinreaktionen) till 1.4.6 för att räkna cellerna med hjälp av cellräkningskammaren.
- Bered en lösning av DMEM för att innehålla ett antal av 150 000 Caco-2-celler i 50 μL.
OBS: Antalet celler som används är en kritisk punkt. Att överskrida 150 000 celler kan resultera i ett kompakt oorganiserat epitelskikt, medan med för lite (mindre än 100 000) kämpar cellerna för att växa och täcker inte basalmembranet tillräckligt, vilket skapar ett diskontinuerligt tarmepitellager. Se till att cellerna är effektivt avstängda. Spetsen på en 200 μL pipett kan användas för att säkerställa homogen fördelning. Med tanke på att 12 modeller kan konstrueras vid varje given tidpunkt kan en 600 μL celllösning beredas. - Efter de 2 timmar som krävs i steg 1.4.14 tillsätts 50 μl Caco-2-celler suspenderade i DMEM i mitten av varje basalmembran. Stäng locket på flerbrunnsplattan.
- Inkubera under den sterila huven med laminärt flöde i 10 min. Överför sedan till inkubatorn i 30 minuter.
- Bered en DMEM-lösning som innehåller 10 % FBS och 1 % Pen/Streptokocker.
OBS: Förbered en tillräcklig lösning för att använda en volym på 1 ml per modell. - Tillsätt 500 μl av mediet ovanför den rekonstruerade modellen och 500 μl under filtret.
OBS: Försiktighet krävs när du tillsätter mediet ovanför filtret för att undvika att cellerna lossnar eller stressas. - Stäng flerbrunnsplattsystemet och placera det i inkubatorn.
- Förberedelse/utformning och användning av modeller (DAG 2 till DAG 6)
- DAG 2: Ta försiktigt bort lösningen från både ovanför den rekonstruerade modellen och under filtret med hjälp av en pipett. Ersätt med färsk 500 μL färsk DMEM (10 % FBS och 1 % Pen/Strep) ovanför respektive under filtret.
- DAG 3: Upprepa som ovan i steg 1.6.1.
- DAG 4: Upprepa som ovan i steg 1.6.1.
OBS: Denna tarmmodell är en statisk cellulär modell; Därför, för att gynna frisättningen av molekyler och tillväxt och stimulering av celler, är det mycket viktigt att mediet byts varje dag. - DAG 5: Vid denna tidpunkt är modellen färdigformad/utvecklad. Använd dessa modeller för vidare studier.
OBS: Den bästa tiden att använda modellen är vid 5 dagar. Även om cellerna kan hållas i en inkubator under längre perioder, ju mer tid som går, desto större är sannolikheten att epitelcellerna kan växa på ett okontrollerat sätt, vilket resulterar i ett oorganiserat och kompakt lager som är svårt att använda. - Efter 5 dagar, inkubera modellerna med antingen giftiga (gluten eller lipopolysackarid [LPS]) eller fördelaktiga komponenter (polyfenoler) av intresse. Lägg till dessa till den övre delen av den rekonstruerade modellen som är upphängd i DMEM-mediet.
OBS: Lämplig koncentration av varje komponent av intresse måste beräknas och suspenderas i ett DMEM-medium. Icke-behandlade kontroller som endast innehåller DMEM-medium måste ställas in för jämförelse med de experimentella modellerna. - Inkubera kontroll- och experimentmodellerna under 24 timmar i en inkubator.
- DAG 6: Ta bort mediet ovanför och under filtret med en pipett.
OBS: Mediet kan lagras för efterföljande enzymkopplade immunadsorberande analyser (ELISA)-tester för att mäta frisättningen av inflammatoriska cytokiner. För detta ändamål måste mediet tillsättas till sterila injektionsflaskor och förvaras vid -20 °C för vidare analys.
2. Paraffininbäddning av de rekonstruerade tarmslemhinnemodellerna
OBS: Hela proceduren måste utföras under ett kemiskt dragskåp. Varje steg och respektive tidstilldelning måste följas strikt. Av denna anledning är det viktigt att ha alla reagenser förberedda i förväg.
- Ställ in paraffinmaskinen på 58 °C så att den är klar att användas.
- Överför membraninsatserna till rena brunnar med en tång i en steril 24-hålsplatta.
- Tillsätt 500 μl 37 % buffrat formalin i PBS ovanför filtret och 1 ml under filtret. Stäng locket och låt det ligga under kemiskt dragskåp i 2 timmar vid RT.
OBS: Som ett alternativ kan 4 % buffrat formalin användas vid RT i 1 timme. - Ta bort formalinet och tillsätt HBSS-lösning både ovanför och under filtret. Ta sedan bort HBSS.
- Lossa lamina propria från membraninsatsen.
OBS: Cellerna i tarmslemhinnan lossnar vanligtvis mycket lätt från membraninsatsen eftersom de inte är fästa vid den senare. Dessutom förblir de två provfacken (apikala och basala) fästa och behåller 3D-strukturen. Om de av någon anledning inte lätt lossnar är det viktigt att använda ett sterilt engångsskalpellblad för att ta bort tarmslemhinnan från membraninsatsen. Membraninsatsen kan skäras och på så sätt lossna från plasten. Var noga med att aldrig röra provet med skalpellen. Motivet för att ta bort membraninsatsen från de kollageninbäddade cellerna är att detta filter kan lossna i de efterföljande fixerings- eller paraffininbäddningsfaserna, vilket gör jämförelser mellan tarmslemhinnemodeller oproportionerliga. Dessutom har membraninsatserna i den inbäddade sektionen en annan konsistens som kan störa sektioneringen. - Placera 100 ml-bägarna under det kemiska dragskåpet, var och en korrekt märkt för att inkludera ett rekonstruerat testinalt tarmslemhinnemodellsystem som undersöks. Tillsätt 25 ml 35 % ETOH till varje bägare och tillsätt sedan den rekonstruerade tarmslemhinnan. Inkubera i 10 min.
- Byt ut 35 % etanol mot 25 ml 50 % etanol och inkubera i 10 minuter.
- Byt ut 50 % etanol mot 25 ml 70 % etanol och inkubera i 10 minuter.
- Byt ut 70 % etanol mot 25 ml 80 % etanol och inkubera i 10 minuter.
- Byt ut 80 % etanol mot 25 ml 95 % etanol och inkubera i 10 minuter.
- Byt ut 95 % etanol mot 25 ml 100 % etanol och inkubera i 10 minuter.
- Byt ut 100 % etanol mot ytterligare 25 ml byte av 100 % etanol och inkubera i 10 min.
- Placera 100 ml bägare under dragskåpet, var och en korrekt märkt för att inkludera en modell som undersöks. Tillsätt 50 ml xylen eller ett histologiskt rengöringsmedel i 10-20 min.
OBS: Histo-Clear (histologiskt rensmedel) rekommenderas eftersom medlet förbättrar klarheten och livfullheten hos acidofila fläckar. Rensningstiden kan variera från ett rekonstruerat tarmslemhinneprov till ett annat och måste kontrolleras för transparens i utseende var 2-3:e minut. - Så snart proverna är genomskinliga, placera dem i en metallkassetthållare som sedan sänks ner i flytande paraffin inuti den uppvärmda maskinen i 45 minuter.
- Byt paraffin och låt proverna vara kvar i den uppvärmda maskinen i ytterligare 45 minuter.
- Ta bort hållaren för vävnadskassetten och lägg den på is för att svalna. När de kylda provblocken lossnar från metallhållaren kan dessa kylas ytterligare vid rumstemperatur.
- Förvara blocken på RT.
OBS: Om målet är att förbereda sektioner omedelbart, kan blocken placeras vid 4 ° C så att de är väl kylda när de används. - Skär 4 μm sektioner med en mikrotom.
- Lägg de skurna sektionerna på objektglas och torka dem i en ugn vid 37 ° C i 24 timmar.
- Rutschkanorna är klara att användas. Förvara dem vid RT tills de utför antingen H&E histologisk färgning eller immun-histokemisk reaktionsfärgning (antigen-antikroppstyp).
- För immunhistokemisk färgning, välj de antikroppar som är av intresse (antingen för studier av TJ-proteiner såsom ockludin eller för monocytaktivering, migration och differentiering) och detektera uttryck (via färgning) med hjälp av kommersiella kit.
- På samma sätt kan du mäta slem med hjälp av Alcian blue och periodisk syra-Schiff (PAS) färgningssats.
- Kvantifiera de färgade TJ-proteinerna av intresse, såsom ockludin, genom att beräkna procentandelen positiva pixlar på mikroskop tagna från mikroskopet.
- Analysera bilder av cellerna med hjälp av bildanalysprogram (t.ex. ImageJ2-programvara [Wayne Rasband, version 2.9.0/1.53t]).
- För att utföra analysen av pixlarna, bearbeta de digitala bilderna till 300 pixlar/tum och konvertera dem till 8 bitar. Bearbeta sedan de binära bilderna med Color Deconvolution-plugin för att analysera färgningen av proteinet av intresse, i det här fallet den permanenta röda färgningen av ockludin.
- Spara den markerade bilden som en tiff och utsätt den för en "rensningsprocedur" för att eliminera artefakter med en grafikredigerare (t.ex. Adobe PhotoshopCC [version 20.0.4]).
- Därefter mäts alla intresseområden med applikationen Analyze Particle of ImageJ2, och data rapporteras som antal pixlar.
OBS: Varje experiment bör utföras i tre exemplar med tre interna replikatfält analyserade för varje replikat. För kvantifiering av slem kan samma princip för att mäta pixlarna tillämpas på bilder som tas av de lila-magentafärgade neutrala mucinerna respektive ljusblåfärgat surt slem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den första viktiga aspekten är att bestämma acceptansen av den grundläggande 3D-tarmekvivalenta slemhinnan för experimentella ändamål. Detta utförs med den mest använda fläcken i histologiska och histopatologiska laboratorier, nämligen hematoxylin (fläckar kärnmaterial djupt blålila färg) och eosin (fläckar cytoplasmatiskt material i olika nyanser av rosa). H&E-färgningen utförs först på en obehandlad kontroll, som odlas under samma förhållanden och tidsram som de experimentella behandlingarna. Från att visualisera cellernas mönster, form och struktur bestäms framgången för detta testinala cellmodellsystem av Caco-2-cellerna som bildar ett tätt och regelbundet monolager ovanför den extracellulära matrisen (ECM)-rika lamina propria efter 5 dagar (Figur 1A). Exempel på modellsystem som skulle anses vara oacceptabla för vidare analyser är de som visar överdriven tillväxt med oorganiserade epitellager, vilket visas efter 10 dagar (Figur 1B). Ett ytterligare exempel är ett epitelskikt som är för tjockt och oorganiserat (Figur 1C), orsakat antingen av sådd av överskott av Caco-2-celler eller en överdriven inkubation. Missbildningar (Figur 1D), som antingen kan hänföras till fröceller som inte befann sig i en aktiv proliferationsfas, eller problem vid beredning av lamina propria eller under fixering med paraffin (celler lossnade/förstördes), är också ett exempel på en oacceptabel rekonstruerad tarmslemhinna. Lika oacceptabelt är bristen på epitelskiktbildning (figur 1E), vilket tyder på sådd av för få Caco-2-celler eller problem vid beredningen av lamina propria. Med hjälp av acceptabla 3D-tarmekvivalenter, från vilka flera snitt kan genereras, kan sedan olika parametrar undersökas från ett enda experiment.
Av de olika parametrar som kan analyseras kan barriärintegritet som svar på pro-inflammatoriska inducerare visualiseras, och TJ-proteiner färgas och kvantifieras och jämföras med obehandlade kontrollmodellsystem. Här visar vi den pro-inflammatoriska effekten av 40 μg/ml totalt veteprotein från en durumvetekälla med hög glutenhalt7, på både cellulär integritet och TJ-ockludinproteininnehåll (Figur 2A). Med hjälp av H&E:s histologiska färgning visar kontrollmodellsystemet att Caco-2-kolonncellerna bildar ett tätt och regelbundet monolager. Däremot visade sig effekten av det glutenhaltiga proteinprovet orsaka störning av monolagret, med mer ospecifik eosinfärgning (Figur 2A). Dessutom kan tjockleken på epitelskiktet mätas och visar sig vara signifikant reducerad efter exponering för proinflammatoriskt gluten (Figur 2A,B). Med hjälp av en antikropp mot ockludin (konjugerad till rödkromogenfärgning) kunde ockludinprotein visualiseras och kvantifieras. Signifikant högre ockludinproteinhalt sågs i kontrollgruppen jämfört med tarmslemhinnan som exponerats för glutenprotein i 24 timmar (Figur 2A,C).
Tarmekvivalenterna som består av en immunkomponent (representerad av U937-monocyter) är också idealiska för att undersöka effekterna av proinflammatoriska inducerare på monocytaktivering, migration och differentiering till makrofager. Återigen, med användning av totalt 40 μg/ml veteprotein extraherat från en vetekälla med högt gluteninnehåll, var proinflammatorisk aktivering av U937-monocyter i lamina propria uppenbar från snabb röd kopplad CD14-färgning (Figur 3A). Aktivering detekteras från det ökade uttrycket av detta rödfärgade membranglykoprotein på monocyter och makrofager. Förhöjt CD14-protein detekterades också med fluoresceinisotiocyanat (FITC), som färgas grönt under immunofluorescens. Migrationen påvisades genom närvaron av aktiverade U937-celler nära Caco-2-monolagret. Där monolagret hade brustit visade det sig att U937-cellerna hade trängt in i Caco-2-cellens monolager (Figur 3A). Det fanns inga tecken på CD14-färgad monocytmigration i kontrollgruppen (Figur 3A). Differentieringen av monocyter till makrofager kan identifieras från markören CD11b. Ingen CD11b-färgning sågs i kontrollgruppen med vare sig röd kromogen eller FITC (Figur 3B). I de vävnader som exponerades för gluten observerades istället CD11b-makrofager både i den ECM-rika lamina propria och i det brustna Caco-2-monolagret (Figur 3B).
Genom att använda LPS för att simulera tarminflammation visar vi här att det också är möjligt att använda detta modellsystem för att undersöka sura mucin- och mukopolysackarider som produceras av Caco-2-cellerna i den obehandlade kontrollen respektive LPS-behandlingen (Figur 4A). Med hjälp av Alcian blue och PAS-färgning färgas surt slem ljusblått och neutrala muciner färgas lila-magenta. Omfattningen av slemfärgning kan på liknande sätt kvantifieras och har visat sig vara signifikant inducerad under 1 ng/ml LPS-provokation (figur 4B). Dessutom, före fixering, kan mediet avlägsnas för att undersöka proinflammatorisk cytokinproduktion. Även om många utsöndringscytokiner kan mätas, valdes i detta specifika fall midkine (MDK). MDK är en endogen inflammatorisk markör inducerad av transkriptionsfaktorn, nukleär faktor kappa-light-chain-enhancer av aktiverad B-cell (NF-κB) -väg, och är också associerad med inflammatoriska sjukdomar i tarmceller15. Under LPS-utmaningen induceras MDK signifikant jämfört med kontrollen (figur 5).
Figur 1: Obehandlade 3D-testinala kontrollekvivalenter. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) av obehandlade 3D-kontrollintestinala intestinala ekvivalenter (Caco-2 /U937/L929 samkulturer) under 24 timmar som en verifiering av effekten av den grundläggande 3D-tarmslemhinnemodellen för experimentella ändamål. (A) En acceptabel experimentell modell jämförs med oacceptabla modeller, som visar överdriven (B) epiteltillväxt och oorganiserade lager efter 10 dagar, (C) överdriven epiteltjocklek och desorganisation, (D) missbildning och (E) inget epitelcellager. Skalstrecket i varje bild är lika med 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Behandlade 3D-intestinala ekvivalenter. (A) Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) och ockludinuttryck av 3D-intestinala ekvivalenter (Caco-2 /U937/L929 samkulturer) exponerade under 24 timmar till 40 μg/ml totalt protein från en modern veteblandning med hög glutenhalt jämfört med kontrollen (CTRL). Skalstapeln i varje bild är lika med 50 μm. (B) Kvantifiering av Caco-2-celltjocklek och (C) ockludin-röd kromogenfärgning. Signifikanta skillnader bestämdes av enkelriktad varians (ANOVA) och representerades som *** 0,0001< P < 0,001. De svarta prickarna representerar antalet replikat. Denna figur har anpassats med tillstånd från Truzzi et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: CD14- och CD11B-färgning. CD14-färgning av U937-monocyter och CD11B U937-differentierade makrofager i 3D-intestinala ekvivalenter (Caco-2/U937/L929-samkulturer) exponerade för inget tillsatt protein (kontroll [CTRL]) eller 40 μg/ml totalprotein från en modern veteblandning med hög glutenhalt efter en period av 24 timmar. För CD14- och CD11b-färgning användes snabbrött som kromogen och kärnor motfärgades med eosin. Skalstrecket i varje bild är lika med 20 μm. CD14 och CD11b-färgning med fluoresceinisotiocyanat (grön) visades också under immunofluorescens. Kärnorna motfärgades med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Skalstrecket i varje bild är lika med 50 μm. Pilar indikerar närvaron av monocyter (CD14-positiva celler) och makrofager (CD11b-positiva celler). Denna figur har anpassats med tillstånd från Truzzi et al.7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) och slemuttryck från färgning av Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff Stain (PAS). (A) Caco-2-celler i basiska 3D-intestinala ekvivalenter (Caco-2/U937/L929 samkulturer) efter 24 timmar i de obehandlade ekvivalenta och rekonstruerade modellsystemen för tarmslemhinnor som exponerats för 1 ng/ml lipopolysackarid. Skalstapeln i varje bild är lika med 50 μm. (B) Kvantifiering av slemuttryck bestämdes med enkelriktad varians (ANOVA) med signifikans rapporterad som **** P < 0,0001. De svarta prickarna representerar antalet replikat. Denna figur har anpassats med tillstånd från Truzzi et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Midkine-uttryck. Midkinuttryck i medium av 3D-tarmekvivalenter (Caco-2 /U937/L929 samkulturer) efter 24 timmar i de obehandlade kontroll- (CTRL) och tarmslemhinnemodellsystemen exponerade för 1ng/ml lipopolysackarid. Kvantifiering av midkinuttryck bestämdes med enkelriktad varians (ANOVA) med signifikans rapporterad som **** P < 0,0001. Denna figur har anpassats med tillstånd från Truzzi et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Schematisk bild av konstruktion och experimentell användning av tarmekvivalenter, samt fixering och mikroskopiska analyser av parametrar från vävnadssnitt. Det schematiska diagrammet sammanfattar uppbyggnaden av tarmekvivalenter och möjliga experimentella behandlingar som kan administreras till dessa modeller. Genereringen av flera vävnadssnitt från ett enda experiment möjliggör analyser av många strukturella och immunologiska aspekter av tarmslemhinnan, som illustreras i figur 1, figur 2, figur 3 och figur 4. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det grundläggande rekonstruerade modellsystemet för tarmslemhinnan som presenteras här (Figur 6) kombinerar fysiologisk komplexitet (mer fysiologiskt relevanta 3D-cellkulturer som innehåller ett Caco-2-monolager med ett ECM-rikt lamina propria-stöd som innehåller fibroblaster och monocyter) med experimentell enkelhet (med hjälp av kommersiella mänskliga cellinjer för att producera standardiserade och lätt repeterbara system)13. Som sådant anses detta modellsystem vara ett lämpligt alternativ till murina modeller som syftar till att utvärdera effekten av potentiella läkemedel/livsmedelskomponenter på tarmbarriärens integritet. I detta avseende styrker tidigare artiklar effektiviteten av den nuvarande cellodlingsmodellen när det gäller att testa både potentiellt fördelaktiga föreningar (plus dosberoende) och skadliga livsmedelskomponenter 7,16,17. Dessutom kan LPS eller alternativa proinflammatoriska reagenser (2,4,6-trinitrobensensulfonsyra eller dextransulfatnatrium) läggas till den nuvarande tarmslemhinnemodellen för att simulera IBD-symtom. På så sätt är det potentiellt möjligt att studera etiologin för tarmsjukdomar ur en strukturell aspekt såväl som från uttrycket av cytokiner, såsom proinflammatorisk MDK, som är en markör för IBD15. Detta grundläggande modellsystem har också potential för eventuell läkemedelsscreening för den bredare befolkningen. Även om modellsystemet är fysiologiskt mer komplext än 2D-modeller13,14, inkluderar begränsningarna i reproduktionen av komplex mänsklig fysiologi frånvaron av både ett mikrofluidiskt system (fluidisk perfusion av en kontinuerlig tillförsel av näringsämnen och avlägsnande av avfallsprodukter samt mekaniska stimuli)8,14 och mikrobiomet (utvärdering av värd-mikrobiominteraktioner vid tarmsjukdomar)8, 14. veckor
Fördelen med att använda den nuvarande grundläggande 3D-modellen av tarmslemhinnor i kombination med paraffininbäddning för ljusmikroskopisk utvärdering av epitelbarriärens integritet är att flera vävnadssnitt kan göras från ett enda experiment, vilket möjliggör analys av många parametrar. Transepitelial elektrisk resistans (TEER)3 är en vanligt förekommande metod för att bedöma tarmbarriärens integritet och har använts i samband med makromolekylära permeabilitetsstudier 3,18, samt allmänt rapporterade studier om Western blot-utvärdering av TJ-proteinuttryck. Western blot-utvärdering ger kvantitativ insikt i övergripande förändringar i proteinuttryck, och TEER fungerar som ett kvantitativt mått på barriärintegritet. Istället ger mikroskopisk utvärdering ett värdefullt verktyg för kvalitativ visualisering och bedömning av lokala proteinförändringar och interaktioner18.
Mikroskopisk utvärdering av en modell med en immunkomponent möjliggör visualisering av immunsvar, såsom differentiering av monocyter till makrofager och migration av aktiverade monocyter i ECM, vilket demonstreras här genom CD14- och CD11b-färgning. Identifiering kan göras via immunhistokemi och/eller immunofluorescensfärgning på enskilda vävnadssnitt, vilket visades för CD14 och CD11b i figur 3. Immunohistokemi möjliggör strukturell visualisering av den rekonstruerade tarmslemhinnevävnaden som helhet. Dessutom är det möjligt att identifiera både kärnorna och cytoplasman i celler. Konfokal immunofluorescens gör det däremot inte möjligt att se vävnaden som en helhet (endast de intressanta markörerna och DAPI-färgade kärnor). Det ger dock en mycket ren bild där bakgrundsfärgen elimineras. Fördelen med detta är att det tillåter större precision när det gäller att bevisa markörernas positivitet eller negativitet och som sådan beräkning av eventuella skillnader i färgintensitet (till exempel en markör som uttrycks mer i en cell än i en annan). Potentiellt kan omfattningen av migrationen av CD14-monocyterna från lamina propria till Caco-2-monolagret också uppskattas från flera replikatbilder tagna vid olika tidpunkter. Icke desto mindre var tecken på inflammation uppenbara från närvaron av både CD14- och CD11b-färgade celler.
Ett intervall på 20–40 μg totalt protein används av de flesta laboratorier för western blotting19. Kvantifieringen av ett stort antal gap junction-proteiner (ockludin, claudin, zonulin och E-caderin) kan utföras genom immunhistokemisk och/eller fluorescerande färgning på enskilda vävnadssnitt, vilket kräver betydligt mindre protein. Samtidigt, från samma experiment, kan integriteten hos epitelskiktet som svar på föreningar också visualiseras från mönstret, formen och strukturen hos celler med H&E-färgning.
Effekten av en grundläggande 3D-rekonstruerad tarmslemhinna för användning vid färgning av slemproduktion, TJ-proteiner och proteiner som produceras från immunsvar är beroende av att man övervinner kritiska steg, särskilt i konstruktionen av modellsystemet och under vävnadsfixering. När det gäller modellkonstruktion är det grundläggande att använda rätt sammanflöde respektive sådd av rätt antal Caco-2-celler (indikeras av anteckningarna i protokollet). För många celler eller ett felaktigt sammanflöde skulle resultera i ett tjockt och oorganiserat epitellager. Istället skulle för få celler resultera i antingen en minskad eller en brist på epitelskiktbildning. Lika grundläggande vid sådd är korrekt cellsammanflöde och antal L929- och U937-celler i ECM, samt korrekt hantering av kollagenet under beredningen. Överskott av celler eller snabb polymerisation av kollagenet skulle resultera i en kompakt och missbildad ECM, vilket i sin tur påverkar strukturen hos epitelcellerna ovanför. På samma sätt skulle för få kollagenbildande L929-celler resultera i en felaktig konsistens av ECM, medan för få U937-monocyter inte skulle gynna ett immunsvar. Det är också viktigt att cellerna används för experiment efter 5 dagar, eftersom en långvarig inkubation skulle resultera i överdriven celltillväxt vilket resulterar i ett kompakt epitellager. Dessutom, med tanke på att den nuvarande designen saknar ett mikrofluidiskt system och är representativ för en statisk tarmcellulär modell, för att gynna frisättningen av molekyler och tillväxt och stimulering av celler, är det mycket viktigt att mediet byts varje dag. När det gäller fixeringsprotokollet är rensningsfasen kritisk och med tanke på att den tid som krävs för att vävnaderna ska bli transparenta i paraffin kan variera, måste varje tarmslemhinnesystem observeras noga under denna fas. Under hela fixeringsproceduren måste försiktighet iakttas vid hanteringen av dessa modeller för att undvika att skada dem.
Sammanfattningsvis, förutsatt att strikt efterlevnad görs av de kritiska punkterna i konstruktionen och fixeringen av de grundläggande 3D-tarmekvivalenterna, kan modellerna tillhandahålla många vävnadssnitt för utvärdering av flera parametrar i läkemedelsscreening och toxicitetsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Tack till Umberto Veronesi-stiftelsen för ett stipendium som stöder forskararbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
