Summary
Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.
Abstract
İnflamatuar bağırsak hastalıklarının patofizyolojisini incelemek, potansiyel olarak yararlı maddelerin farmakolojik taraması ve potansiyel olarak zararlı gıda bileşenleri üzerinde toksisite çalışmaları yapmak için in vivo ve in vitro bağırsak modellerinin kullanımında bir artış olmuştur. Konuyla ilgili olarak, hayvan modellerinin yerini almak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik mevcut bir talep vardır. Burada, hücre hatlarını kullanan temel, "sağlıklı doku" üç boyutlu (3D) bağırsak eşdeğeri modeli için bir protokol, hem deneysel basitlik (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem) hem de fizyolojik karmaşıklık (U937 monositleri ve L929 fibroblastlarının destekleyici bir bağışıklık bileşenine sahip Caco-2 enterositleri) sağlamanın ikili yararı ile sunulmaktadır. Protokol ayrıca, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi de içerir, böylece tek bir deneyden birden fazla görsel parametreyi analiz etme avantajı sağlar. Hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmış kesitler, Caco-2 kolumnar hücrelerinin kontrol tedavilerinde sıkı ve düzenli bir tek tabaka oluşturduğunu gösteren deneysel bir sistem olarak modelin etkinliğini doğrulamak için kullanılmıştır. Glüteni pro-inflamatuar bir gıda bileşeni olarak kullanarak, bölümlerden analiz edilen parametreler arasında azaltılmış tek tabaka kalınlığının yanı sıra altta yatan matristen (H & E) bozulma ve ayrılma, oklüdin boyamadan (istatistiksel olarak ölçülebilir) gösterildiği gibi sıkı bağlantı protein ekspresyonunun azalması ve farklılaşma 14 (CD14) boyama kümesinden ve CD11b ile ilişkili makrofajlara farklılaşmadan kanıtlandığı gibi göç eden U937 hücrelerinin bağışıklık aktivasyonu. Bağırsak iltihabını simüle etmek için lipopolisakkarit kullanılarak gösterildiği gibi, ölçülebilen ek parametreler, fiksasyondan önce ortamdan ekstrakte edilebilen artmış mukus boyaması ve sitokin ekspresyonudur (midkin gibi). Temel üç boyutlu (3D) bağırsak mukoza modeli ve sabit kesitler, birden fazla görsel ölçülebilir parametreyi analiz etme imkanı ile inflamatuar durum ve bariyer bütünlüğü çalışmaları için önerilebilir.
Introduction
Farklı tipte epitel hücreleri içeren tek hücre kalınlığında bir iç astar olan bağırsak epitel bariyeri, vücudun dış ve iç ortamı arasındaki ilk fiziksel savunma bariyerini veya arayüzünü oluşturur 1,2. Kolumnar tip enterositler, epitel hücrelerinin en bol bulunan tipini oluşturur. Bunlar, bariyer sıkılaştırmada önemli bir rol oynayan sıkı bağlantılar (TJ'ler) dahil olmak üzere çeşitli bariyer bileşenleri arasındaki etkileşimler yoluyla epitelyal bariyer bütünlüğünün korunmasından sorumludur 1,3. TJ yapısı, komşu hücreleri sıkıca birbirine bağlayan fermuar benzeri bir yapı oluşturan oklüdinler, kladinler ve eklemsel adezyon molekülleri (JAM'ler) dahil olmak üzere transmembran proteinlerle işbirliği yapan zonula okludens (ZO) ve singulin gibi hücre içi plak proteinlerinden oluşur 3,4. Transmembran proteinler, küçük bileşiklerin pasif paraselüler difüzyonunu düzenler ve toksik büyük molekülleri dışlar.
Potansiyel olarak toksik gıda bileşikleri ve gıda kontaminantları, epitel geçirgenliğini bozan, bağışıklık hücrelerini aktive eden ve kronik bağırsak dokusu iltihabına neden olan inflamatuar sitokin üretimini uyarır 5,6,7. Buna karşılık, çeşitli antioksidan ve antienflamatuar fitokimyasalların, inflamatuar sitokin ekspresyonunu azalttığı ve TJ protein ekspresyonunun ve montajınınrestorasyonu yoluyla bağırsak TJ bariyer bütünlüğünü arttırdığı bildirilmiştir 4,6,8. Bu nedenle, hem yararlı hem de zararlı bileşikler tarafından epitelyal bariyer bütünlüğünün düzenlenmesi, farmasötik tarama ve toksisite çalışmaları için bağırsak bariyerini taklit etmeyi amaçlayan hem in vivo hem de in vitro modellerin kullanımında bir artış görmüştür. Bu, deneysel modellerde simüle edilebilen bağırsak bağırsak hastalıkları (IBD), nekrotizan enterokolit ve kanserin patofizyolojisini anlamaya yönelik artan ilgi göz önüne alındığında özellikle önemlidir 8,9,10.
Hayvan testlerinde "3R" hedefine ulaşmak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik bir talep olmuştur. Bunlar, hayvanların kullanımına alternatif alternatifler, kullanılan hayvan sayısının azaltılması ve sıkıntıyı hafifleten yöntemlerin benimsenmesinde iyileştirmeyi içerir 11,12,13. Ayrıca, insan ve fare modelleri (kemirgenler en yaygın kullanılan türlerdir) arasındaki altta yatan moleküler, hücresel ve fizyolojik mekanizmalar ayırt edicidir ve fare modellerinin insan tepkilerinde öngörücü olarak etkinliği konusunda tartışmalara yol açar12,13. İn vitro insan hücre hattı modellerinin sayısız avantajı arasında hedef kısıtlamalı deney, doğrudan gözlem ve sürekli analizyer alır 13.
İki boyutlu (2D) kültürlerdeki tek hücre tipi tek katmanlar güçlü modeller olarak hizmet etmiştir. Bununla birlikte, bunlar insan dokularının fizyolojik karmaşıklığını tam olarak yeniden üretemez 8,13,14. Sonuç olarak, yeni nesil risk değerlendirme araç kutuları olarak hem sağlıklı hem de hastalıklı bağırsak dokularının fizyolojik karmaşıklığını özetlemek için sürekli artan iyileştirmelerle 3D kültür sistemleri geliştirilmektedir13,14. Bu modeller, hem hücre hatlarını hem de organoidleri (hem sağlıklı hem de hastalıklı dokulardan elde edilen) kullanan çeşitli hücre hatları, organoid kültürleri ve mikroakışkan cihazlara (çip üzerinde bağırsak) sahip 3D Transwell iskelelerini içerir8,13,14.
Bu çalışmada sunulan 3 boyutlu "sağlıklı doku" bağırsak eşdeğeri protokolü, fizyolojik karmaşıklık ve deneysel basitlik arasında bir denge kurmaya dayanmaktadır13. Model, üç hücre hattından (destekleyici bir bağışıklık bileşeni [U937 monositleri ve L929 fibroblastları] ile enterositler [altın standart kolon adenokarsinomu Caco-2 hattı]) oluşan bir 3D Transwell iskelesini temsil eder, standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir bir sistem oluşturur. Protokol, sabit bağırsak eşdeğerleri kullanılarak epitelyal bariyer bütünlüğünün hafif mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi içerir. Mevcut yaklaşımın avantajı, gömülü dokuların çok sayıda bölümünün tek bir deneyden birden fazla parametre için boyanabilmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Temel 3D rekonstrükte edilmiş bağırsak mukoza modelinin hazırlanması
NOT: Tüm prosedür steril bir laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Hücre inkübatörünün kullanımını içeren prosedürdeki tüm adımlar, kültürlerin %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de inkübe edildiğini gösterir (protokolde aksi belirtilmedikçe).
- Bağırsak model sisteminde kullanılan hücre hatlarının önceden hazırlanması
- L929 fare fibroblast hücrelerini, 2 mM L-glutamin,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 5 mL'sinde 5 x 105 konsantrasyonunda tohumlayın ve bir F25 şişesinde ve bağırsak modellerinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, bir pipet kullanarak ortamı çıkarın. Daha sonra taze ortam (5 mL) ekleyin ve hücreleri 48 saat daha inkübe edin.
NOT: Hücreler kullanılmadan önce %80 birleşik olmalıdır. - Bir F75 hücre şişesinde 10 mL DMEM ortamında (% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile) Caco-2 hücrelerini (konsantrasyon 2 x 106) tohumlayın ve bağırsak mukoza modelinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi değiştirin ve 48 saat boyunca% 80'lik bir birleşmeye kadar inkübe edin.
NOT: Hücreler aktif bir proliferatif fazda olmalıdır: ne çok seyrek ne de çok birleşik. % 50-60 izdiham önerilir. Hücreler, modeli yapmadan bir gün önce ekilmemelidir, çünkü bu, hücrelerin çoğalma kapasitesini yavaşlatabilir ve bu da yeniden yapılandırılmış 3D modelde mükemmel bir şekilde kök salmayacaktır. - Model kurulumundan 2 gün önce bir F75 hücre şişesinde süspansiyon halinde (1 x 106 konsantrasyon) 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamına (2 mM L-glutamin,% 1 sodyum piruvat,% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep içeren) süspansiyon (1 x 10 6 konsantrasyonu) içinde büyüyen U937 hücrelerini ekleyin ve 48 saat boyunca bir inkübatöre koyun.
- L929 fare fibroblast hücrelerini, 2 mM L-glutamin,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 5 mL'sinde 5 x 105 konsantrasyonunda tohumlayın ve bir F25 şişesinde ve bağırsak modellerinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, bir pipet kullanarak ortamı çıkarın. Daha sonra taze ortam (5 mL) ekleyin ve hücreleri 48 saat daha inkübe edin.
- Transwell ko-kültür plakası eklerinin hazırlanması
- 0,4 μm filtreli kesici uçlar içeren 24 oyuklu bir plaka seçin.
NOT: 0,4 μm filtre, ilaç taşıma çalışmalarında standart bir seçimdir. 3 μm ve 8 μm filtre boyutları, kollajen gömülü hücrelerin olası kayıplarını önlemek için önerilmez. - Bir pipet kullanarak, Transwell filtrelerini (bundan böyle membran ekleri olarak anılacaktır) filtre ekinin altında ve üstünde 500 μL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nemlendirin.
- Çok kuyulu plakayı kapatın ve en az 2 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Membran ekleri HBSS'de 24 saate kadar kalabilir. Bu işlem, modeli oluşturmadan bir gün önce gerçekleştirilebilir. Membran eklerinin tamamen hidratlanması ve filtrenin kurumaması önemlidir, çünkü bu, numunenin düzgün bir şekilde yapışmasını zorlaştırabilir. - Plakaları 2 saat (veya 24 saat) sonra inkübatörden çıkarın. HBSS'yi bir pipet kullanarak membran eklerinin üstünden ve altından dikkatlice aspire edin ve 10 dakika kurumaya bırakın.
- 0,4 μm filtreli kesici uçlar içeren 24 oyuklu bir plaka seçin.
- Temel 3D bağırsak model sisteminin hücresiz kollajen lamina propria'sının hazırlanması (GÜN 1)
- DMEM'de aşağıdaki bileşenleri içeren buz üzerinde 50 mL'lik steril bir tüpte hücresiz bir kollajen solüsyonu hazırlayın:% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 200 mM L-glutamin,% 1 sodyum bikarbonat ve 1.35 mg / mL Tip 1 sıçan kuyruğu kollajeni.
NOT: Tüm bu bileşenler buz üzerinde tutulmalı ve soğutulmuş pipet uçlarıyla DMEM'e eklenmelidir. Tip 1 sıçan kuyruğu kolajeni, artan sıcaklık ve pH ile polimerize olduğu için en son eklenmelidir. Hazırlanan hücresiz kollajen çözeltisinin miktarı, gerekli bağırsak eşdeğerlerinin sayısına bağlı olacaktır. - Seçilen bağırsak eşdeğeri sayısı için her bir plaka ekine (membran filtrenin üstüne) 250 μL çözelti ekleyin ve kapağı çok kuyulu plakanın üzerine yerleştirin. Kollajen çözeltisinin laminer akış başlığı altında oda sıcaklığında (RT) polimerize olmasına izin verin.
NOT: Daha katı bir faza geçişin yanı sıra, polimerizasyon, rengin sarıdan pembeye değişmesinden de belirgindir. Polimerizasyon genellikle 10-15 dakika içinde tamamlanır.
- DMEM'de aşağıdaki bileşenleri içeren buz üzerinde 50 mL'lik steril bir tüpte hücresiz bir kollajen solüsyonu hazırlayın:% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 200 mM L-glutamin,% 1 sodyum bikarbonat ve 1.35 mg / mL Tip 1 sıçan kuyruğu kollajeni.
- Fibroblast (L929) ve monosit (U937) hücrelerinin hazırlanması, hücre sayımı ve model sisteme eklenmesi (1. GÜN)
- L929 hücre kültürünü (adım 1.1.1) inkübatörden çıkarın. Bir vakum pompası kullanarak, ortamı aspire edin, 5 mL steril fosfat tampon salin (PBS; Ca ve Mg olmadan) ile değiştirin ve hücreleri durulayın.
- PBS'yi bir vakum pompası kullanarak aspire edin. 2 mL önceden hazırlanmış bir tripsin-EDTA çözeltisi (PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin ve 3-5 dakika boyunca bir inkübatöre koyun.
- Hücrelerin yapışma yüzeyinden ayrılıp ayrılmadığını belirlemek için ters çevrilmiş bir mikroskop (örneğin, bir Eclipse Ts2, Nikon) kullanın. Bu meydana gelirse, tripsin reaksiyonunu bloke etmek ve hücreleri durulamak için hemen 2 mL DMEM (% 10 FBS içerir) ekleyin.
- Hücre çözeltisini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 645 x g'da santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak süpernatanı aspire edin.
NOT: Peletin bozulmamasına özen gösterilmelidir. DMEM'in etkisi L929 ve U937 hücreleri üzerinde test edildi ve büyüme üzerinde olumsuz etkileri olduğu gösterilmedi. - Peletlere 1 mL DMEM ekleyin ve hücreleri askıya alın.
NOT: Hücreler çözelti içinde homojen bir şekilde süspanse edilmelidir. - DMEM'deki hücrelerin 20 μL'sini çıkarın ve 20 μL Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Karışımın 20 μL'sini çıkarın ve bir hücre sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu mikroskobik olarak değerlendirin.
- U937 hücre kültürünü (adım 1.1.3) inkübatörden çıkarın. Hücre çözeltisini 645 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak, peleti rahatsız etmemek için süpernatanı aspire edin.
- Hücreleri 1 mL RPM'de askıya alın. L929 hücrelerinde olduğu gibi, hücrelerin çözelti içinde homojen bir şekilde süspanse edildiğinden emin olun.
- Benzer şekilde, adım 1.4.6'da bildirildiği gibi hücre yoğunluğunu belirleyin.
- Adım 1.3.1'de açıklandığı gibi bir kolajen çözeltisi hazırlayın.
NOT: Yapılacak çözelti miktarı, her bir kesici uç (veya model) için 450 μL dikkate alınmalıdır. - Oluşturulacak her bağırsak eşdeğer modeli için 50 μL'lik bir hacimde sırasıyla 50.000 L929 hücresi ve 15.000 U937 hücresi içerecek şekilde bir DMEM çözeltisi hazırlayın.
NOT: Hücre sayısı kritik bir faktördür. Her iki hücre tipinin de çok fazla olması, yeterince organize edilemeyen hücrelerle aşırı dolu bir lamina propria ile sonuçlanacaktır. Düşük sayıda fibroblast (kollajen üreten) daha az kompakt bir lamina propria ile sonuçlanırken, çok az monosit uyaranlara karşı bağışıklık tepkisini engelleyecektir. Her 50 μL'lik alikot içinde doğru hücre sayısının bulunması koşuluyla - her 24 kuyucuklu plakada bulunan 12 filtre eki için toplam 600 μL'lik bir hacim hazırlanabilir. - Hücreleri içeren her 50 μL'lik alikotu adım 1.4.10'da 450 μL kollajen çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın.
- Her model için önceden kaplanmış hücresiz kollajen lamina propria'yı 500 μL kollajen içeren hücre çözeltisi ile kaplayın.
NOT: Hacimleri her bir eke hızlı bir şekilde eklemek önemlidir ve bu nedenle, yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası modellerinin sayısını bir seferde 12 veya daha az ile sınırlamanız önerilir. - Plakayı kapatın ve çözeltinin sertleşmesini sağlamak için 2 saat boyunca bir inkübatöre koyun.
- Hazırlanması, hücre sayımı ve epitelyal Caco-2 hücrelerinin bağırsak modeline eklenmesi (GÜN 1)
- Caco-2 hücre kültürünü (adım 1.1.2) inkübatörden çıkarın. Ön durulama için 10 mL PBS kullanarak adım 1.4.1'deki prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra 5 mL önceden hazırlanmış bir tripsin-EDTA çözeltisi (Ca ve Mg içermeyen PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin ve 5-8 dakika boyunca bir inkübatöre koyun.
- Hücre sayma odasını kullanarak hücreleri saymak için 1.4.3 adımlarını (ancak tripsin reaksiyonunu bloke etmek için 5 mL DMEM kullanarak) 1.4.6'ya kadar tekrarlayın.
- 50 μL'de 150.000 Caco-2 hücresi içeren bir DMEM çözeltisi hazırlayın.
NOT: Kullanılan hücre sayısı kritik bir noktadır. 150.000 hücreyi aşmak, kompakt bir düzensiz epitel tabakasına neden olabilirken, çok az (100.000'den az) ile hücreler büyümek için mücadele eder ve süreksiz bir bağırsak epitel tabakası oluşturan bazal zarı yeterince örtmez. Hücrelerin etkili bir şekilde askıya alındığından emin olun. Homojen dağılımı sağlamak için 200 μL'lik bir pipetin ucu kullanılabilir. Herhangi bir zamanda 12 modelin yapılabileceği göz önüne alındığında, 600 μL'lik bir hücre çözeltisi hazırlanabilir. - Adım 1.4.14'te gereken 2 saatten sonra, her bir bazal membranın ortasına DMEM'de süspanse edilmiş 50 μL Caco-2 hücresi ekleyin. Çok kuyulu plakanın kapağını kapatın.
- Steril laminer akış başlığının altında 10 dakika inkübe edin. Ardından 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.
- %10 FBS ve %1 Pen/Strep içeren bir DMEM solüsyonu hazırlayın.
NOT: Model başına 1 mL hacim kullanmak için yeterli bir çözelti hazırlayın. - Yeniden yapılandırılmış modelin üzerine 500 μL ortam ve filtrenin altına 500 μL ekleyin.
NOT: Hücrelerin ayrılmasını veya gerilmesini önlemek için ortamı filtrenin üzerine eklerken dikkatli olunmalıdır. - Çok kuyulu plaka sistemini kapatın ve inkübatöre yerleştirin.
- Model hazırlama/oluşturma ve kullanımı (2. GÜN - 6. GÜN)
- 2. GÜN: Çözeltiyi bir pipet kullanarak hem yeniden yapılandırılmış modelin üstünden hem de filtrenin altından dikkatlice çıkarın. Filtrenin üstünde ve altında sırasıyla taze 500 μL taze DMEM (%10 FBS ve %1 Pen/Strep) ile değiştirin.
- 3. GÜN: Adım 1.6.1'de yukarıdaki gibi tekrarlayın.
- 4. GÜN: Adım 1.6.1'de yukarıdaki gibi tekrarlayın.
NOT: Bu bağırsak modeli statik bir hücresel modeldir; Bu nedenle, moleküllerin salınmasını ve hücrelerin büyümesini ve uyarılmasını desteklemek için, ortamın her gün değiştirilmesi çok önemlidir. - 5. GÜN: Bu noktada, model tamamen oluşturulur/geliştirilir. Daha ileri çalışmalar için bu modelleri kullanın.
NOT: Modeli kullanmak için en uygun zaman 5 gündür. Hücreler bir inkübatörde daha uzun süre tutulabilse de, ne kadar çok zaman geçerse, epitel hücrelerinin kontrolsüz bir şekilde büyüme olasılığı o kadar artar ve bu da kullanımı zor, düzensiz ve kompakt bir tabaka ile sonuçlanır. - 5 günde, modelleri toksik (glüten veya lipopolisakkarit [LPS]) veya ilgilenilen faydalı bileşenlerle (polifenoller) inkübe edin. Bunları, DMEM ortamında asılı duran yeniden yapılandırılmış modelin üst kısmına ekleyin.
NOT: İlgilenilen her bir bileşenin uygun konsantrasyonu hesaplanmalı ve bir DMEM ortamında askıya alınmalıdır. Deneysel modellerle karşılaştırmak için sadece DMEM ortamı içeren işlenmemiş kontroller ayarlanmalıdır. - Kontrol ve deneysel modelleri bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.
- 6. GÜN: Filtrenin üstündeki ve altındaki ortamı bir pipetle çıkarın.
NOT: Ortam, inflamatuar sitokinlerin salınımını ölçmek için müteakip enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tipi testler için saklanabilir. Bu amaçla, ortam steril şişelere eklenmeli ve daha fazla analiz için -20 ° C'de saklanmalıdır.
2. Yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası modellerinin parafin gömülmesi
NOT: Tüm prosedür kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir. Her adıma ve ilgili zaman tahsisine kesinlikle uyulmalıdır. Bu nedenle, tüm reaktiflerin önceden hazırlanması önemlidir.
- Parafin makinesini kullanıma hazır hale getirmek için 58 °C'ye ayarlayın.
- Membran eklerini steril 24 oyuklu bir plakada pense kullanarak kuyucukları temizlemek için aktarın.
- Filtrenin üzerine PBS'ye 500 μL %37 tamponlu formalin ve filtrenin altına 1 mL ekleyin. Kapağı kapatın ve RT'de 2 saat kimyasal çeker ocak altında bırakın.
NOT: Alternatif olarak, RT'de 1 saat boyunca% 4 tamponlu formalin kullanılabilir. - Formalini çıkarın ve filtrenin hem üstüne hem de altına HBSS solüsyonu ekleyin. Ardından HBSS'yi çıkarın.
- Lamina propria'yı membran ekinden ayırın.
NOT: Bağırsak mukozasının hücreleri, ikincisine bağlı olmadıkları için genellikle zar ekinden çok kolay ayrılır. Ek olarak, iki numune bölmesi (apikal ve bazal) 3D yapıyı koruyarak bağlı kalır. Herhangi bir nedenle kolayca ayrılmazlarsa, bağırsak mukozasını zar ekinden çıkarmak için steril tek kullanımlık bir neşter bıçağı kullanmak önemli olacaktır. Membran eki kesilebilir, böylece plastikten ayrılabilir. Numuneye asla neşterle dokunmamaya dikkat edin. Membran ekinin kollajen gömülü hücrelerden çıkarılmasının nedeni, bu filtrenin sonraki fiksasyon veya parafin gömme aşamalarında ayrılabilmesi ve bağırsak mukoza modelleri arasındaki karşılaştırmaları orantısız hale getirebilmesidir. Ayrıca, gömülü bölüm içindeki membran ekleri, kesit almaya müdahale edebilecek farklı bir kıvama sahiptir. - 100 mL'lik beherleri, her biri incelenmekte olan yeniden yapılandırılmış bir bağırsak mukozası model sistemini içerecek şekilde doğru şekilde etiketlenmiş kimyasal çeker ocakların altına yerleştirin. Her behere 25 mL% 35 ETOH ekleyin ve ardından yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozasını ekleyin. 10 dakika inkübe edin.
- %35 etanolü 25 mL %50 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
- %50 etanolü 25 mL %70 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
- %70 etanolü 25 mL %80 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
- %80 etanolü 25 mL %95 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
- %95 etanolü 25 mL %100 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
- %100 etanolü 25 mL'lik başka bir %100 etanol değişimiyle değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
- Çeker ocakların altına, her biri incelenmekte olan bir modeli içerecek şekilde doğru şekilde etiketlenmiş 100 mL'lik beherler yerleştirin. 10-20 dakika boyunca 50 mL ksilen veya histolojik bir temizleme maddesi ekleyin.
NOT: Ajan asidofilik lekelerin berraklığını ve canlılığını arttırdığı için Histo-Clear (histolojik temizleme ajanı) önerilir. Temizleme süresi, yeniden yapılandırılmış bir bağırsak mukozası örneğinden diğerine değişebilir ve her 2-3 dakikada bir görünümde şeffaflık açısından kontrol edilmelidir. - Numuneler şeffaf olur olmaz, bunları metal bir doku kaset tutucusuna yerleştirin ve daha sonra ısıtılmış makinenin içinde 45 dakika boyunca sıvı parafine daldırın.
- Parafini değiştirin ve numuneleri ısıtılmış makinenin içinde 45 dakika daha bırakın.
- Kağıt mendil kaset tutucusunu çıkarın ve soğuması için buzun üzerine koyun. Soğutulmuş numune blokları metal tutucudan ayrıldığında, bunlar oda sıcaklığında daha fazla soğutulabilir.
- Blokları RT'de saklayın.
NOT: Amaç bölümleri hemen hazırlamaksa, bloklar 4 ° C'ye yerleştirilebilir, böylece kullanıldıklarında iyi soğutulurlar. - Bir mikrotom kullanarak 4 μm'lik kesitler kesin.
- Kesilen bölümleri slaytlara yerleştirin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de bir fırında kurutun.
- Slaytlar kullanıma hazırdır. H & E histolojik boyama veya immün-histokimyasal reaksiyon boyama (antijen-antikor tipi) gerçekleştirene kadar bunları RT'de saklayın.
- İmmün-histokimyasal boyama için, ilgilenilen antikorları seçin (oklüdin gibi TJ proteinlerinin incelenmesi veya monosit aktivasyonu, göçü ve farklılaşması için) ve ticari kitleri kullanarak ekspresyonu (boyama yoluyla) tespit edin.
- Benzer şekilde, Alcian mavisi ve periyodik asit-Schiff (PAS) boyama kitini kullanarak mukusu ölçün.
- Mikroskoptan alınan mikrograflardaki pozitif piksellerin yüzdesini hesaplayarak okkludin gibi ilgilenilen boyanmış TJ proteinlerini ölçün.
- Görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ2 yazılımı [Wayne Rasband, sürüm 2.9.0/1.53t]) kullanarak hücrelerin resimlerini analiz edin.
- Piksellerin analizini gerçekleştirmek için dijital görüntüleri 300 piksel/inç olarak işleyin ve 8 bite dönüştürün. Ardından, ilgilenilen proteinin boyanmasını, bu durumda oklüdinin kalıcı kırmızı boyamasını analiz etmek için ikili görüntüleri Color Deconvolution eklentisi ile işleyin.
- Seçilen resmi tiff olarak kaydedin ve bir grafik düzenleyiciyle (örneğin, Adobe PhotoshopCC [sürüm 20.0.4]) yapaylıkları ortadan kaldırmak için bir "temizleme" prosedürüne tabi tutun.
- Daha sonra, ImageJ2'nin Parçacığını Analiz Et uygulaması ile tüm ilgi alanlarını ölçün ve verileri piksel sayısı olarak raporlayın.
NOT: Her deneme, her çoğaltma için analiz edilen üç dahili çoğaltma alanıyla üç kopya halinde gerçekleştirilmelidir. Mukusun miktarını belirlemek için, pikselleri ölçmenin aynı prensibi, sırasıyla mor-macenta lekeli nötr müsinler ve parlak mavi lekeli asidik mukusun alınan görüntülerine uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk önemli husus, temel 3D bağırsak eşdeğer mukozasının deneysel amaçlar için kabul edilebilirliğini belirlemektir. Bu, histoloji ve histopatoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan boya olan hematoksilen (nükleer materyali koyu mavi-mor renkte boyar) ve eozin (sitoplazmik materyali pembenin değişen tonlarında boyar) ile gerçekleştirilir. H&E boyaması ilk olarak, deneysel tedavilerle aynı koşullar ve zaman dilimi altında kültürlenen, işlenmemiş bir kontrol üzerinde gerçekleştirilir. Hücrelerin desenini, şeklini ve yapısını görselleştirmekten, bu bağırsak hücre modeli sisteminin başarısı, Caco-2 hücrelerinin 5 gün sonra hücre dışı matris (ECM) açısından zengin lamina propria'nın üzerinde sıkı ve düzenli bir tek tabaka oluşturmasıyla belirlenir (Şekil 1A). Daha ileri analizler için kabul edilemez olarak kabul edilecek model sistemlerine örnek olarak, 10 gün sonra gösterildiği gibi, düzensiz epitel katmanları ile aşırı büyüme gösterenler dahildir (Şekil 1B). Ek bir örnek, fazla Caco-2 hücrelerinin tohumlanmasından veya aşırı inkübasyondan kaynaklanan çok kalın ve düzensiz bir epitel tabakasıdır (Şekil 1C). Proliferasyonun aktif bir fazında olmayan tohumlama hücrelerine veya lamina propria'nın hazırlanmasında veya parafin ile fiksasyon sırasında (hücreler ayrıldı / mahvoldu) sorunlara atfedilebilen malformasyon (Şekil 1D), aynı zamanda kabul edilemez bir yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozasının bir örneğidir. Benzer şekilde, çok az sayıda Caco-2 hücresinin tohumlanmasının veya lamina propria'nın hazırlanmasındaki problemlerin göstergesi olan epitel tabakası oluşumunun olmaması da kabul edilemez (Şekil 1E). Birden fazla kesitin oluşturulabildiği kabul edilebilir 3D bağırsak eşdeğerleri kullanılarak, tek bir deneyden çeşitli parametreler araştırılabilir.
Analiz edilebilen çeşitli parametrelerden, pro-inflamatuar indükleyicilere yanıt olarak bariyer bütünlüğü görselleştirilebilir ve TJ proteinleri boyanabilir ve ölçülebilir ve işlenmemiş kontrol modeli sistemleriyle karşılaştırılabilir. Burada, yüksek glüten içeriğine7 sahip bir durum buğdayı kaynağından elde edilen 40 μg/mL toplam buğday proteininin hem hücresel bütünlük hem de TJ oklüdin protein içeriği üzerindeki proinflamatuar etkisini gösteriyoruz (Şekil 2A). H&E histolojik boyamayı kullanarak, kontrol modeli sistemi, sıkı ve düzenli bir tek tabaka oluşturan Caco-2 kolumnar hücrelerini gösterir. Buna karşılık, glüten içeren protein örneğinin etkisinin, daha spesifik olmayan eozin boyama ile tek tabakanın bozulmasına neden olduğu gösterilmiştir (Şekil 2A). Ayrıca, epitel tabakasının kalınlığı ölçülebilir ve proinflamatuar glütene maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde azaldığı gösterilmiştir (Şekil 2A, B). Oklüdine karşı bir antikor (kırmızı kromojen boyamasına konjuge olarak) kullanılarak, okkludin proteini görselleştirilebilir ve ölçülebilir. Kontrol grubunda, 24 saat boyunca gluten proteinine maruz kalan bağırsak mukozasına kıyasla önemli ölçüde daha yüksek oklüdin protein içeriği belirgindi.
Bir bağışıklık bileşeninden (U937 monositleri ile temsil edilir) oluşan bağırsak eşdeğerleri, pro-inflamatuar indükleyicilerin monosit aktivasyonu, migrasyonu ve makrofajlara farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için de idealdir. Bir kez daha, yüksek glüten içeriğine sahip bir buğday kaynağından ekstrakte edilen 40 μg / mL toplam buğday proteini kullanılarak, lamina propria'daki U937 monositlerinin pro-inflamatuar aktivasyonu, hızlı kırmızı bağlı CD14 boyamasından belirgindi. Aktivasyon, bu kırmızı lekeli zar glikoproteininin monositler ve makrofajlar üzerindeki artan ekspresyonundan tespit edilir. İmmünofloresan altında yeşile boyanan floresein izotiyosiyanat (FITC) ile artmış CD14 proteini de tespit edildi. Migrasyon, Caco-2 tek tabakasına yakın aktive edilmiş U937 hücrelerinin varlığından kanıtlandı. Tek tabakanın yırtıldığı yerde, U937 hücrelerinin Caco-2 hücre tek tabakasına girdiği gösterilmiştir (Şekil 3A). Kontrol grubunda CD14 boyalı monosit göçü kanıtı yoktu (Şekil 3A). Monositlerin makrofajlara farklılaşması, CD11b belirtecinden tanımlanabilir. Kontrol grubunda kırmızı kromojen veya FITC ile CD11b boyaması görülmedi (Şekil 3B). Bunun yerine, glütene maruz kalan dokularda, CD11b makrofajları hem ECM'den zengin lamina propria'da hem de rüptüre Caco-2 tek tabakasında gözlenmiştir (Şekil 3B).
Bağırsak iltihabını simüle etmek için LPS'yi kullanarak, burada bu model sisteminin, sırasıyla tedavi edilmemiş kontrol ve LPS tedavisinde Caco-2 hücreleri tarafından üretilen asidik müsin ve mukopolisakkaritleri araştırmak için de kullanılmasının mümkün olduğunu gösteriyoruz (Şekil 4A). Alcian mavisi ve PAS boyaması kullanılarak, asidik mukus parlak mavi boyanır ve nötr müsinler sırasıyla mor-macenta ile boyanır. Mukus boyamanın kapsamı benzer şekilde ölçülebilir ve 1 ng / mL LPS zorluğu altında önemli ölçüde indüklendiği gösterilmiştir (Şekil 4B). Ayrıca, fiksasyondan önce, proinflamatuar sitokin üretimini araştırmak için ortam çıkarılabilir. Çok sayıda boşaltım sitokini ölçülebilmesine rağmen, bu özel durumda midkin (MDK) seçilmiştir. MDK, aktive B hücresi (NF-κB) yolunun transkripsiyon faktörü, nükleer faktör kappa-hafif zincir arttırıcısı tarafından indüklenen endojen inflamatuar bir belirteçtir ve ayrıca bağırsak hücrelerinin enflamatuar hastalıkları ile ilişkilidir15. LPS zorluğu altında, MDK, kontrole kıyasla önemli ölçüde indüklenir (Şekil 5).
Şekil 1: Tedavi edilmemiş kontrol 3D bağırsak eşdeğerleri. Deneysel amaçlar için temel 3D bağırsak mukoza modelinin etkinliğinin doğrulanması için 24 saat boyunca tedavi edilmemiş kontrol 3D bağırsak eşdeğerlerinin (Caco-2 /U937/L929 ko-kültürleri) hematoksilen ve eozin (H&E) boyanması. (A) Kabul edilebilir bir deneysel model, 10 gün sonra aşırı (B) epitel büyümesi ve düzensiz tabakalar, (C) aşırı epitel kalınlığı ve düzensizliği, (D) malformasyon ve (E) epitel hücre tabakası göstermeyen, kabul edilemez modellerle karşılaştırılır. Her görüntüdeki ölçek çubuğu 50 μm'ye eşittir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tedavi edilen 3D bağırsak eşdeğerleri. (A) Hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması ve 3D bağırsak eşdeğerlerinin (Caco-2 / U937 / L929 ko-kültürleri) oklüdin ekspresyonu, kontrole kıyasla yüksek glüten içeren modern buğday karışımından 24 saat ila 40 μg / mL toplam proteine maruz bırakıldı (CTRL). Her görüntüdeki ölçek çubuğu 50 μm'ye eşittir. (B) Caco-2 hücre kalınlığının ölçülmesi ve (C) oklüdin-kırmızı kromojen boyama. Anlamlı farklılıklar tek yönlü varyans (ANOVA) ile belirlendi ve *** 0.0001< P < 0.001 olarak gösterildi. Siyah noktalar kopya sayısını temsil eder. Bu rakam Truzzi ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CD14 ve CD11B boyama. U937 monositlerinin CD14 boyanması ve CD11B U937, 24 saatlik bir süre sonra ilave protein içermeyen (kontrol [CTRL]) veya yüksek glüten içeren modern buğday karışımından 40 μg/mL toplam proteine maruz bırakılan 3D bağırsak eşdeğerlerinde (Caco-2 / U937 / L929 ko-kültürleri) makrofajları farklılaştırdı. CD14 ve CD11b boyama için kromojen olarak hızlı kırmızı kullanıldı ve çekirdekler eozin ile karşı boyandı. Her görüntüdeki ölçek çubuğu 20 μm'ye eşittir. Floresein izotiyosiyanat (yeşil) ile CD14 ve CD11b boyaması da immünofloresan altında gösterilmiştir. Çekirdekler 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyandı. Her görüntüdeki ölçek çubuğu 50 μm'ye eşittir. Oklar, monositlerin (CD14 pozitif hücreler) ve makrofajların (CD11b pozitif hücreler) varlığını gösterir. Bu rakam Truzzi ve ark.7'nin izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması ve Alcian Mavisi / Periyodik Asit-Schiff Boyası (PAS) boyamasından mukus ekspresyonu. (A) Caco-2 hücreleri, 1 ng / mL lipopolisakkarite maruz bırakılan tedavi edilmemiş eşdeğer ve yeniden yapılandırılmış bağırsak mukoza model sistemlerinde 24 saat sonra temel 3D bağırsak eşdeğerlerinde (Caco-2 / U937 / L929 ko-kültürleri). Her görüntüdeki ölçek çubuğu 50 μm'ye eşittir. (B) Mukus ekspresyonunun nicelleştirilmesi, anlamlılık **** P < 0.0001 olarak bildirilen tek yönlü varyans (ANOVA) ile belirlendi. Siyah noktalar kopya sayısını temsil eder. Bu rakam Truzzi ve ark.16'nın izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Midkin ifadesi. 1ng / mL lipopolisakkarite maruz bırakılan tedavi edilmemiş kontrol (CTRL) ve bağırsak mukoza model sistemlerinde 24 saat sonra 3D bağırsak eşdeğerleri (Caco-2 / U937 / L929 ko-kültürleri) ortamında midkin ekspresyonu. Midkin ekspresyonunun nicelleştirilmesi tek yönlü varyans (ANOVA) ile belirlendi ve anlamlılık **** P < 0.0001 olarak bildirildi. Bu rakam Truzzi ve ark.16'nın izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bağırsak eşdeğerlerinin yapımı ve deneysel kullanımının yanı sıra doku kesitlerinden parametrelerin fiksasyonu ve mikroskobik analizlerini temsil eden şematik diyagram. Şematik diyagram, bağırsak eşdeğerlerinin yapısını ve bu modellere uygulanabilecek olası deneysel tedavileri özetlemektedir. Tek bir deneyden birden fazla doku kesitinin oluşturulması, Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterildiği gibi bağırsak mukozasının çok sayıda yapısal ve immün yönünün analizine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan temel yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası model sistemi (Şekil 6), fizyolojik karmaşıklığı (fibroblastlar ve monositler içeren ECM açısından zengin lamina propria desteğine sahip bir Caco-2 tek tabakası içeren fizyolojik olarak daha ilgili 3D hücre kültürleri) deneysel basitlikle (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem üretmek için ticari insan hücre hatlarını kullanarak) birleştirir13. Bu nedenle, bu model sistemi, potansiyel tıbbi ilaçların/gıda bileşenlerinin bağırsak bariyer bütünlüğü üzerindeki etkisini değerlendirmeyi amaçlayan fare modellerine uygun bir alternatif olarak kabul edilmektedir. Bu bağlamda, önceki makaleler, mevcut hücre kültürü modelinin hem potansiyel olarak faydalı bileşiklerin (artı doz bağımlılığı) hem de zararlı gıda bileşenlerinintest edilmesindeki etkinliğini doğrulamaktadır 7,16,17. Ayrıca, IBD semptomlarını simüle etmek için mevcut bağırsak mukoza modeline LPS veya alternatif proinflamatuar reaktifler (2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit veya dekstran sülfat sodyum) eklenebilir. Bunu yaparken, bağırsak hastalıklarının etiyolojisini yapısal bir açıdan ve IBD15'in bir belirteci olan pro-inflamatuar MDK gibi sitokinlerin ekspresyonundan incelemek potansiyel olarak mümkündür. Bu temel model sistemi aynı zamanda daha geniş nüfus için nihai uyuşturucu tarama potansiyeline de sahiptir. Model sistemi fizyolojik olarak 2D modellerden daha karmaşık olmasınarağmen13,14, karmaşık insan fizyolojisinin çoğaltılmasındaki sınırlamalar, hem mikroakışkan bir sistemin (sürekli bir besin kaynağının akışkan perfüzyonu ve atık ürünlerin yanı sıra mekanik uyaranların uzaklaştırılması)8,14 hem de mikrobiyomun (bağırsak hastalıklarında konakçı-mikrobiyom etkileşimlerinin değerlendirilmesi)8, 14.
Epitelyal bariyer bütünlüğünün ışık mikroskobik değerlendirmesi için mevcut temel 3D bağırsak mukozası modelini parafin gömme ile birlikte kullanmanın avantajı, tek bir deneyden birkaç doku kesitinin yapılabilmesi ve böylece çok sayıda parametrenin analizine izin vermesidir. Transepitelyal elektrik direnci (TEER)3, bağırsak bariyeri bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve makromoleküler geçirgenlik çalışmaları 3,18 ve ayrıca TJ protein ekspresyonunun Western blot değerlendirmesi üzerine yaygın olarak bildirilen çalışmalarla birlikte kullanılmıştır. Western blot değerlendirmesi, protein ekspresyonundaki genel değişiklikler hakkında nicel bir içgörü sağlar ve TEER, bariyer bütünlüğünün nicel bir ölçüsü olarak hizmet eder. Bunun yerine, mikroskobik değerlendirme, yerel protein değişikliklerinin ve etkileşimlerinin kalitatif görselleştirilmesi ve değerlendirilmesi için değerli bir araç sağlar18.
Bir bağışıklık bileşenine sahip bir modelin mikroskobik değerlendirmesi, burada CD14 ve CD11b boyama ile gösterildiği gibi, monositlerin makrofajlara farklılaşması ve ECM'de aktive edilmiş monositlerin göçü gibi bağışıklık tepkilerinin görselleştirilmesine izin verir. Tanımlama, Şekil 3'te CD14 ve CD11b için gösterildiği gibi, bireysel doku kesitlerinde immünohistokimya ve / veya immünofloresan boyama yoluyla yapılabilir. İmmünohistokimya, yeniden yapılandırılmış bağırsak mukoza dokusunun bir bütün olarak yapısal olarak görüntülenmesine izin verir. Ayrıca, hücrelerde hem çekirdeği hem de sitoplazmayı tanımlamak mümkündür. Buna karşılık, konfokal immünofloresan, dokunun bir bütün olarak görülmesine izin vermez (sadece ilgilenilen belirteçler ve DAPI ile boyanmış çekirdekler). Ancak arka plan renginin ortadan kaldırıldığı çok temiz bir görüntü sağlar. Bunun avantajı, işaretleyicilerin pozitifliğini veya negatifliğini kanıtlamada daha fazla kesinliğe izin vermesi ve bu nedenle renk yoğunluğundaki herhangi bir farklılığın hesaplanmasına izin vermesidir (örneğin, bir hücrede diğerinden daha fazla ifade edilen bir işaretleyici). Potansiyel olarak, CD14 monositlerinin lamina propria içinden Caco-2 tek tabakasına migrasyonunun derecesi, çeşitli zaman noktalarında alınan çoklu kopya görüntülerden de tahmin edilebilir. Bununla birlikte, hem CD14 hem de CD11b boyalı hücrelerin varlığından inflamasyon kanıtı belirgindi.
20-40 μg'lık bir toplam protein aralığı, laboratuvarların çoğu tarafından western blotlamaiçin kullanılır 19. Çok sayıda boşluk bağlantı proteininin (okludin, claudin, zonulin ve E-caderin) miktar tayini, sırasıyla önemli ölçüde daha az protein gerektiren, bireysel doku kesitlerinde immünohistokimyasal ve/veya floresan boyama ile gerçekleştirilebilir. Aynı zamanda, aynı deneyden, bileşiklere yanıt olarak epitel tabakasının bütünlüğü, H&E boyama ile hücrelerin deseninden, şeklinden ve yapısından da görselleştirilebilir.
Mukus üretiminin, TJ proteinlerinin ve immün yanıtlardan üretilen proteinlerin boyanmasında kullanılmak üzere temel bir 3D yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozasının etkinliği, özellikle model sistemin inşasında ve doku fiksasyonu sırasında kritik adımların üstesinden gelinmesine bağlıdır. Model yapımı ile ilgili olarak, sırasıyla doğru birleşmeyi kullanmak ve doğru sayıda Caco-2 hücresinin (protokoldeki notlarla belirtilen) tohumlanması esastır. Çok fazla hücre veya yanlış bir birleşme, kalın ve düzensiz bir epitel tabakasına neden olur. Bunun yerine, çok az hücre, epitel tabakası oluşumunun azalmasına veya eksikliğine neden olur. Tohumlamada eşit derecede önemli olan, ECM'deki doğru hücre birleşimi ve L929 ve U937 hücrelerinin sayısının yanı sıra hazırlama sırasında kolajenin doğru şekilde kullanılmasıdır. Fazla hücreler veya kollajenin hızlı polimerizasyonu, kompakt ve hatalı biçimlendirilmiş bir ECM ile sonuçlanacak ve bu da yukarıdaki epitel hücrelerinin yapısını etkileyecektir. Benzer şekilde, çok az sayıda kollajen oluşturan L929 hücresi, ECM'nin yanlış kıvamına neden olurken, çok az sayıda U937 monositi bir bağışıklık tepkisini desteklemez. Ayrıca, hücrelerin 5 gün sonra deney için kullanılmasıdır, çünkü uzun süreli bir inkübasyon, kompakt bir epitel tabakası ile sonuçlanan aşırı hücre büyümesine neden olur. Ayrıca, mevcut tasarımın mikroakışkan bir sistemden yoksun olduğu ve statik bir bağırsak hücresel modelini temsil ettiği göz önüne alındığında, moleküllerin salınmasını ve hücrelerin büyümesini ve uyarılmasını desteklemek için, ortamın her gün değiştirilmesi çok önemlidir. Fiksasyon protokolü ile ilgili olarak, temizleme aşaması kritiktir ve dokuların parafin içinde saydam hale gelmesi için gereken sürenin değişebileceği göz önüne alındığında, bu aşamada her bağırsak mukoza sistemi yakından izlenmelidir. Sabitleme prosedürü boyunca, bu modellere zarar vermemek için kullanılırken dikkatli olunmalıdır.
Sonuç olarak, temel 3D bağırsak eşdeğerlerinin yapımında ve fiksasyonunda kritik noktalara sıkı sıkıya bağlı kalınması koşuluyla, modeller farmasötik tarama ve toksisite çalışmalarında çoklu parametrelerin değerlendirilmesi için çok sayıda doku kesiti sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Araştırmacı çalışmalarını destekleyen bir burs için Umberto Veronesi Vakfı'na teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
