Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Grunnleggende tredimensjonalt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

Summary

Her beskriver vi konstruksjon av et basalt tredimensjonalt (3D) tarmcellelinjemodellsystem og en parafininnebyggingsprotokoll for lysmikroskopisk evaluering av faste tarmekvivalenter. Farging av utvalgte proteiner tillater analyse av flere visuelle parametere fra et enkelt eksperiment for potensiell bruk i prekliniske legemiddelscreeningsstudier.

Abstract

Det har vært en økning i bruken av in vivo og in vitro intestinale modeller for å studere patofysiologien ved inflammatoriske tarmsykdommer, for farmakologisk screening av potensielt fordelaktige stoffer og for toksisitetsstudier på potensielt skadelige matkomponenter. Av relevans er det en nåværende etterspørsel etter utvikling av cellebaserte in vitro-modeller for å erstatte dyremodeller. Her presenteres en protokoll for en grunnleggende, "sunt vev" tredimensjonal (3D) tarmekvivalent modell ved bruk av cellelinjer med den doble fordelen av å gi både eksperimentell enkelhet (standardisert og lett repeterbart system) og fysiologisk kompleksitet (Caco-2 enterocytter med en støttende immunkomponent av U937-monocytter og L929-fibroblaster). Protokollen inkluderer også parafininnebygging for lysmikroskopisk evaluering av faste tarmekvivalenter, og gir dermed fordelen av å analysere flere visuelle parametere fra et enkelt eksperiment. Hematoksylin- og eosinfargede seksjoner som viser Caco-2-søylecellene som danner et tett og regelmessig monolag i kontrollbehandlinger, brukes til å verifisere effekten av modellen som et eksperimentelt system. Ved bruk av gluten som en pro-inflammatorisk matkomponent, inkluderer parametere analysert fra seksjoner redusert monolagtykkelse, samt forstyrrelse og løsrivelse fra den underliggende matriksen (H &E), redusert tett kryssproteinuttrykk som vist fra okkludinfarging (kvantifiserbar statistisk) og immunaktivering av migrerende U937-celler som vist fra klyngen av differensiering 14 (CD14) farging og CD11b-relatert differensiering i makrofager. Som vist ved bruk av lipopolysakkarid for å simulere tarmbetennelse, er ytterligere parametere som kan måles økt slimfarging og cytokinekspresjon (som midkine) som kan ekstraheres fra mediet før fiksering. Den grunnleggende tredimensjonale (3D) tarmslimhinnemodellen og faste seksjoner kan anbefales for inflammatoriske status- og barriereintegritetsstudier med mulighet for å analysere flere visuelle kvantifiserbare parametere.

Introduction

Tarmepitelbarrieren, en encelletykk indre foring som inneholder forskjellige typer epitelceller, utgjør den første fysiske defensive barrieren eller grensesnittet mellom utsiden og kroppens indre miljø 1,2. Columnar-type enterocytter utgjør den mest tallrike typen epitelceller. Disse er ansvarlige for å opprettholde epitelbarrierens integritet gjennom interaksjoner mellom flere barrierekomponenter, inkludert tette kryss (TJ), som spiller en betydelig rolle i barrierestramming 1,3. TJ-strukturen består av intracellulære plakkproteiner, slik som zonula occludens (ZO) og cingulin, som samarbeider med transmembranproteiner, inkludert okkludiner, klaudiner og junctional adhesjonsmolekyler (JAMs) som danner glidelåslignende struktur som tett forbinder nabocellene 3,4. De transmembrane proteiner regulerer passiv paracellulær diffusjon av små forbindelser og utelukker giftige store molekyler.

Potensielt giftige matforbindelser og matforurensninger stimulerer inflammatorisk cytokinproduksjon som forstyrrer epitelpermeabiliteten, aktiverer immunceller og forårsaker kronisk tarmvevbetennelse 5,6,7. I motsetning til dette har forskjellige antioksidanter og antiinflammatoriske fytokjemikalier blitt rapportert å redusere inflammatorisk cytokinekspresjon og forbedre intestinal TJ-barriereintegritet gjennom restaurering av TJ-proteinuttrykk og montering 4,6,8. Derfor har reguleringen av epitelbarriereintegritet av både gunstige og skadelige forbindelser sett en økning i bruken av både in vivo og in vitro-modeller rettet mot å etterligne tarmbarrieren for farmasøytiske screening- og toksisitetsstudier. Dette er spesielt relevant gitt den økende interessen for å forstå patofysiologien ved tarmtarmsykdommer (IBD), nekrotiserende enterokolitt og kreft, som kan simuleres i eksperimentelle modeller 8,9,10.

Det har vært etterspørsel etter utvikling av cellebaserte in vitro-modeller for å oppnå målet om "3R" i dyreforsøk. Disse inkluderer erstatningsalternativer til bruk av dyr, reduksjon i antall dyr som brukes, og forbedring i å ta i bruk metoder som lindrer nød 11,12,13. Videre er de underliggende molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismene mellom humane og murine modeller (gnagere er den mest brukte arten) særegne, noe som fører til kontrovers angående effekten av murine modellene som prediktorer i menneskelige responser12,13. Mange fordeler med in vitro humane cellelinjemodeller inkluderer målbegrenset eksperimentering, direkte observasjon og kontinuerlig analyse13.

Encelle-type monolayers i todimensjonale (2D) kulturer har tjent som kraftige modeller. Disse kan imidlertid ikke nøyaktig reprodusere den fysiologiske kompleksiteten til menneskelig vev 8,13,14. Som et resultat utvikles 3D-kultursystemer med stadig økende forbedringer for å rekapitulere den fysiologiske kompleksiteten til både sunt og sykt tarmvev som neste generasjons risikovurderingsverktøykasser13,14. Disse modellene inkluderer 3D Transwell stillas med forskjellige cellelinjer, organoidkulturer og mikrofluidiske enheter (tarm-på-chip) som bruker både cellelinjer og organoider (avledet fra både sunt og sykt vev)8,13,14.

3D "sunt vev" intestinal ekvivalent protokoll presentert i denne studien var basert på å finne en balanse mellom fysiologisk kompleksitet og eksperimentell enkelhet13. Modellen er representativ for et 3D Transwell-stillas, bestående av tre cellelinjer (enterocytter [gullstandardadenokarsinomet Caco-2-linjen] med en støttende immunkomponent [U937-monocytter og L929-fibroblaster]), som utgjør et standardisert og lett repeterbart system som gjelder for foreløpig screening av diettmolekyler av interesse for tarmepitelbarriereintegritet og immunrespons. Protokollen inkluderer parafininnebygging for lysmikroskopisk evaluering av epitelbarriereintegritet ved bruk av faste tarmekvivalenter. Fordelen med den nåværende tilnærmingen er at mange deler av det innebygde vevet kan gjøres for å flekke for flere parametere fra et enkelt eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av den grunnleggende 3D rekonstruerte tarmslimhinnemodellen

MERK: Hele prosedyren må utføres i en steril laminær strømningshette. Alle trinnene i prosedyren som involverer bruk av celleinkubatoren betyr at kulturer inkuberes ved 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 (med mindre annet er angitt i protokollen).

  1. Tidligere forberedelse av cellelinjene som brukes i tarmmodellsystemet
    1. Seed L929 mus fibroblastceller i en konsentrasjon på 5 x 105 i 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) inneholdende 2 mM L-glutamin, 10% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) i en F25-kolbe og dyrker den i en inkubator 4 dager før konstruksjonen av tarmmodellene. Etter 48 timer, fjern mediet med en pipette. Tilsett deretter friskt medium (5 ml), og inkuber cellene videre i 48 timer.
      MERK: Cellene må være 80 % konfluente før de brukes.
    2. Frø Caco-2 celler (konsentrasjon på 2 x 106) i 10 ml DMEM medium (med 10% FBS og 1% Pen-Strep) i en F75 cellekolbe og kultur den i en inkubator 4 dager før konstruksjonen av tarmslimhinnemodellen. Etter 48 timer skiftes mediet som beskrevet i trinn 1.1.1 og inkuberes videre i 48 timer til en konfluens på 80 %.
      MERK: Cellene må være i en aktiv prolifererende fase: ikke for sparsom eller for sammenflytende. En 50-60% sammenløp anbefales. Cellene må ikke sås dagen før modellen lages, fordi dette kan bremse cellenes proliferative kapasitet, som da ikke vil slå perfekt rot i den rekonstruerte 3D-modellen.
    3. Legg til U937-celler som vokser i suspensjon (konsentrasjon på 1 x 106) til 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (inneholdende 2 mM L-glutamin, 1% natriumpyruvat, 10% FBS og 1% Pen-Strep) i en F75-cellekolbe 2 dager før modelloppsettet, og sett i en inkubator i 48 timer.
  2. Forberedelse av Transwell co-kultur plateinnsatser
    1. Velg en 24-brønns plate som inneholder innsatser med 0,4 μm filtre.
      MERK: 0,4 μm filteret er et standardvalg i narkotikatransportstudier. Filterstørrelsene på 3 μm og 8 μm anbefales ikke for å forhindre mulige tap av kollagen-innebygde celler.
    2. Bruk en pipette til å hydrere Transwell-filtrene (heretter kalt membraninnsatser) med 500 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) under og over filterinnsatsen.
    3. Lukk flerbrønnsplaten og legg den i en inkubator i minst 2 timer.
      MERK: Membraninnsatsene kan forbli i HBSS i opptil 24 timer. Denne operasjonen kan utføres dagen før du konstruerer modellen. Det er viktig at membraninnsatsene er helt hydrert og at filteret ikke tørker ut, da dette kan gjøre det vanskeligere for prøven å feste seg ordentlig.
    4. Fjern platene fra inkubatoren etter 2 timer (eller 24 timer). Aspirer HBSS forsiktig ovenfra og under membraninnsatsene med en pipette og la den tørke i 10 minutter.
  3. Fremstilling av cellefritt kollagen lamina propria av det grunnleggende 3D intestinale modellsystemet (DAG 1)
    1. Forbered en cellefri kollagenoppløsning i et 50 ml sterilt rør på is som inneholder følgende komponenter i DMEM: 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 200 mM L-glutamin, 1% natriumbikarbonat og 1,35 mg / ml Type 1 rottehale kollagen.
      MERK: Alle disse komponentene må holdes på is og legges til DMEM med avkjølte pipettespisser. Type 1 rottehale kollagen må tilsettes sist da dette polymeriseres med økende temperatur og pH. Mengden cellefri kollagenoppløsning fremstilt vil avhenge av antall tarmekvivalenter som kreves.
    2. Tilsett 250 μL av løsningen til hver plateinnsats (over membranfilteret) for antall intestinale ekvivalenter valgt, og legg lokket over flerbrønnsplaten. La kollagenoppløsningen polymerisere ved romtemperatur (RT) under avtrekksviften for laminær luftstrøm.
      MERK: Bortsett fra overgangen til en mer solid fase, er polymerisasjon også tydelig fra en endring i farge fra gul til rosa. Polymerisasjonen er vanligvis fullført innen 10-15 minutter.
  4. Klargjøring, celletelling og addisjon av fibroblastceller (L929) og monocyttceller (U937) til modellsystemet (DAG 1)
    1. Fjern L929-cellekulturen (trinn 1.1.1) fra inkubatoren. Bruk en vakuumpumpe, aspirer mediet, erstatt det med 5 ml sterilt fosfatbuffersaltvann (PBS; uten Ca og Mg), og skyll cellene.
    2. Aspirer PBS ved hjelp av en vakuumpumpe. Tilsett 2 ml av en ferdig forberedt trypsin-EDTA-løsning (0,05% trypsin og 0,02% EDTA i PBS) og sett i en inkubator i 3-5 minutter.
    3. Bruk et omvendt mikroskop (for eksempel en Eclipse Ts2, Nikon) for å fastslå om cellene løsner fra adhesjonsoverflaten. Hvis dette skjer, tilsett umiddelbart 2 ml DMEM (inneholdende 10% FBS) for å blokkere trypsinreaksjonen og skyll cellene.
    4. Overfør celleoppløsningen til et sterilt 15 ml rør og sentrifuge ved 645 x g i 5 minutter. Bruk en vakuumpumpe til å aspirere supernatanten.
      NOTAT: Forsiktighet er nødvendig for ikke å forstyrre pelleten. Effekten av DMEM ble testet på L929- og U937-cellene og ble ikke vist å ha negative effekter på vekst.
    5. Tilsett 1 ml DMEM til pelleten og suspender cellene.
      MERK: Cellene må suspenderes homogent i løsningen.
    6. Fjern 20 μL av cellene i DMEM og tilsett 20 μL Trypan blå oppløsning. Fjern 20 μL av blandingen og evaluer celletettheten mikroskopisk ved hjelp av et celletellingskammer.
    7. Fjern U937 cellekultur (trinn 1.1.3) fra inkubatoren. Sentrifuger celleoppløsningen ved 645 x g i 5 minutter. Bruk en vakuumpumpe til å aspirere supernatanten for å unngå å forstyrre pelleten.
    8. Suspender cellene i 1 ml RPMI. Som med L929-cellene, sørg for at cellene er homogent suspendert i løsningen.
    9. På samme måte etablerer du celletettheten som rapportert i trinn 1.4.6.
    10. Forbered en kollagenoppløsning som beskrevet i trinn 1.3.1.
      MERK: Mengden løsning som skal lages må ta hensyn til 450 μL for hver innsats (eller modell).
    11. Forbered en oppløsning av DMEM for å inneholde et antall på henholdsvis 50.000 L929-celler og 15.000 U937-celler i et volum på 50 μL for hver tarmekvivalentmodell som skal konstrueres.
      MERK: Antall celler er en kritisk faktor. For mange av begge celletyper ville resultere i en lamina propria overdrevet full av celler som ikke ville være tilstrekkelig organisert. Et dårligere antall fibroblaster (som genererer kollagen) vil resultere i en mindre kompakt lamina propria, mens for få monocytter vil hindre immunresponsen mot stimuli. Forutsatt at riktig antall celler er tilstede i hver 50 μL alikot - kan et totalt volum på 600 μL fremstilles for de 12 filterinnsatsene som er tilstede i hver 24 brønnplate.
    12. Tilsett hver 50 μL alikot som inneholder cellene til 450 μL kollagenoppløsning i trinn 1.4.10. Bland godt.
    13. Legg den forhåndsbelagte cellefrie kollagenlamina propria med 500 μL av den kollagenholdige celleløsningen for hver modell.
      MERK: Det er viktig å raskt legge volumene til hvert innlegg, og som sådan anbefales det å begrense antall rekonstruerte tarmslimhinnemodeller til 12 eller færre om gangen.
    14. Lukk platen og legg den i en inkubator i 2 timer for å la løsningen stivne.
  5. Fremstilling, celletelling og addisjon av Caco-2-epitelceller til tarmmodellen (DAG 1)
    1. Fjern Caco-2 cellekulturen (trinn 1.1.2) fra inkubatoren. Gjenta prosedyrene fra trinn 1.4.1 med 10 ml PBS for foreløpig skylling. Deretter tilsettes 5 ml av en ferdig forberedt trypsin-EDTA-løsning (0,05% trypsin og 0,02% EDTA i Ca- og Mg-fri PBS) og legges i en inkubator i 5-8 minutter.
    2. Gjenta trinn 1.4.3 (men bruk 5 ml DMEM for å blokkere trypsinreaksjonen) til 1.4.6 for å telle cellene ved hjelp av celletellekammeret.
    3. Forbered en oppløsning av DMEM for å inneholde et antall på 150.000 Caco-2 celler i 50 μL.
      MERK: Antall celler som brukes er et kritisk punkt. Over 150 000 celler kan resultere i et kompakt uorganisert epitellag, mens med for lite (mindre enn 100 000) sliter cellene med å vokse og dekker ikke tilstrekkelig kjellermembranen og skaper et diskontinuerlig tarmepitellag. Forsikre deg om at cellene er effektivt suspendert. Spissen av en 200 μL pipette kan brukes til å sikre homogen fordeling. Gitt at 12 modeller kan konstrueres til enhver tid, kan en 600 μL celleløsning fremstilles.
    4. Etter de 2 timene som kreves i trinn 1.4.14, tilsett 50 μL Caco-2-celler suspendert i DMEM til midten av hver kjellermembran. Lukk lokket på flerbrønnsplaten.
    5. Inkuber under den sterile laminære strømningshetten i 10 minutter. Overfør deretter til inkubatoren i 30 minutter.
    6. Lag en DMEM-oppløsning som inneholder 10 % FBS og 1 % penn/streptokokker.
      MERK: Klargjør en tilstrekkelig løsning til å bruke et volum på 1 ml per modell.
    7. Tilsett 500 μL av mediet over den rekonstruerte modellen og 500 μL under filteret.
      MERK: Vær forsiktig når du legger til mediet over filteret for å unngå å løsne eller stresse cellene.
    8. Lukk flerbrønnsplatesystemet og legg det i inkubatoren.
  6. Modellforberedelse/-dannelse og bruk (DAG 2 til DAG 6)
    1. DAG 2: Fjern oppløsningen forsiktig både fra den rekonstruerte modellen og under filteret ved hjelp av en pipette. Bytt ut med ferske 500 μL fersk DMEM (10% FBS og 1% Pen / Strep) over og under filteret, henholdsvis.
    2. DAG 3: Gjenta som ovenfor i trinn 1.6.1.
    3. DAG 4: Gjenta som ovenfor i trinn 1.6.1.
      MERK: Denne tarmmodellen er en statisk cellulær modell; Derfor, for å favorisere frigjøring av molekyler og vekst og stimulering av celler, er det svært viktig at mediet endres hver dag.
    4. DAG 5: På dette tidspunktet er modellen ferdig utformet/utviklet. Bruk disse modellene for videre studier.
      MERK: Den beste tiden å bruke modellen er på 5 dager. Selv om cellene kan opprettholdes i en inkubator i lengre perioder, jo mer tid som går, desto større er sannsynligheten for at epitelcellene kan vokse på en ukontrollert måte, noe som resulterer i et uorganisert og kompakt lag som er vanskelig å bruke.
    5. Etter 5 dager, inkuber modellene med enten giftige (gluten eller lipopolysakkarid [LPS]) eller fordelaktige komponenter (polyfenoler) av interesse. Legg disse til den øvre delen av den rekonstruerte modellen suspendert i DMEM-mediet.
      MERK: Den passende konsentrasjonen av hver komponent av interesse må beregnes og suspenderes i et DMEM-medium. Ikke-behandlede kontroller som bare inneholder DMEM-medium, må settes opp for sammenligning med eksperimentmodellene.
    6. Inkubere kontroll- og eksperimentelle modeller i 24 timer i en inkubator.
    7. DAG 6: Fjern mediet over og under filteret med en pipette.
      MERK: Mediet kan lagres for påfølgende enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA)-type tester for å måle frigivelsen av inflammatoriske cytokiner. Til dette formål må mediet tilsettes sterile hetteglass og oppbevares ved -20 ° C for videre analyse.

2. Parafininnebygging av de rekonstruerte tarmslimhinnemodellene

MERK: Hele prosedyren må utføres under en kjemisk avtrekkshette. Hvert trinn og respektive tidsfordeling må følges nøye. Av denne grunn er det viktig å ha alle reagenser forberedt på forhånd.

  1. Sett parafinmaskinen på 58 °C slik at den er klar til bruk.
  2. Overfør membraninnsatsene til rene brønner ved hjelp av tanger i en steril 24-brønnsplate.
  3. Tilsett 500 μL 37 % bufret formalin i PBS over filteret og 1 ml under filteret. Lukk lokket og la det ligge under den kjemiske avtrekkshetten i 2 timer ved RT.
    MERK: Som et alternativ kan 4% bufret formalin brukes ved RT i 1 time.
  4. Fjern formalinen og tilsett HBSS-løsningen både over og under filteret. Fjern deretter HBSS.
  5. Løsne lamina propria fra membraninnsatsen.
    MERK: Cellene i tarmslimhinnen løsner vanligvis veldig lett fra membraninnsatsen, da de ikke er festet til sistnevnte. I tillegg forblir de to prøverommene (apikale og basale) festet, og beholder 3D-strukturen. Hvis de av en eller annen grunn ikke er lett løsrevet, vil det være viktig å bruke et sterilt engangs skalpellblad for å fjerne tarmslimhinnen fra membraninnsatsen. Membraninnsatsen kan kuttes, og dermed løsne den fra plasten. Vær forsiktig så du aldri berører prøven med skalpellen. Motivet for å fjerne membraninnsatsen fra de kollagen-innebygde cellene er at dette filteret kan løsne i de påfølgende fikserings- eller parafininnebyggingsfasene, noe som gjør sammenligninger mellom tarmslimhinnemodeller uproporsjonale. Videre har membraninnsatsene i den innebygde delen en annen konsistens som kan forstyrre seksjoneringen.
  6. Plasser de 100 ml begerglassene under den kjemiske avtrekkshetten, hver riktig merket for å inkludere ett rekonstruert modellsystem for tarmslimhinner som undersøkes. Tilsett 25 ml 35% ETOH til hvert beger og tilsett deretter den rekonstruerte tarmslimhinnen. Inkuber i 10 min.
  7. Bytt ut 35% etanol med 25 ml 50% etanol og inkuber i 10 minutter.
  8. Bytt ut 50% etanol med 25 ml 70% etanol og inkuber i 10 minutter.
  9. Bytt ut 70% etanol med 25 ml 80% etanol og inkuber i 10 minutter.
  10. Bytt ut 80% etanol med 25 ml 95% etanol og inkuber i 10 minutter.
  11. Bytt ut 95% etanol med 25 ml 100% etanol og inkuber i 10 minutter.
  12. Bytt ut 100% etanol med en annen 25 ml endring av 100% etanol og inkuber i 10 minutter.
  13. Plasser 100 ml begre under avtrekkshetten, hver riktig merket for å inkludere en modell som undersøkes. Tilsett 50 ml xylen eller et histologisk clearingmiddel i 10-20 minutter.
    MERK: Histo-Clear (histologisk clearingmiddel) anbefales da midlet forbedrer klarheten og livligheten til acidofile flekker. Clearingtiden kan variere fra en rekonstruert tarmslimhinneprøve til en annen og må kontrolleres for åpenhet i utseende hver 2-3 min.
  14. Så snart prøvene er gjennomsiktige, plasser dem i en metallvevskassettholder som deretter senkes ned i flytende parafin inne i den oppvarmede maskinen i 45 minutter.
  15. Bytt parafin og la prøvene ligge inne i den oppvarmede maskinen i ytterligere 45 minutter.
  16. Fjern silkekassettholderen og legg den på is for å avkjøles. Når de avkjølte prøveblokkene løsner fra metallholderen, kan disse avkjøles ytterligere ved romtemperatur.
  17. Lagre blokkene på RT.
    MERK: Hvis målet er å forberede seksjoner umiddelbart, kan blokkene plasseres ved 4 ° C slik at de er godt avkjølt når de brukes.
  18. Klipp 4 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotom.
  19. Plasser kuttseksjonene på lysbildene og tørk dem i en ovn ved 37 ° C i 24 timer.
  20. Lysbildene er klare til bruk. Oppbevar dem ved RT til du utfører enten H &E histologisk farging eller immunhistokjemisk reaksjonsfarging (antigen-antistofftype).
    1. For immunhistokjemisk farging, velg antistoffene av interesse (enten for studier av TJ-proteiner som okkludin eller for monocytaktivering, migrasjon og differensiering) og detekter uttrykk (via farging) ved hjelp av kommersielle sett.
    2. På samme måte måler du slim ved hjelp av Alcian blå og periodisk syre-Schiff (PAS) fargesett.
    3. Kvantifiser de fargede TJ-proteinene av interesse, for eksempel okkludin, ved å beregne prosentandelen positive piksler på mikrografer hentet fra mikroskopet.
    4. Analyser bilder av cellene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare (f.eks. ImageJ2-programvare [Wayne Rasband, versjon 2.9.0/1.53t]).
      1. For å utføre analysen av pikslene, behandle de digitale bildene til 300 piksler / tommer og konverter dem til 8 biter. Deretter behandler du de binære bildene med Color Deconvolution-plugin for å analysere fargingen av proteinet av interesse, i dette tilfellet den permanente røde fargingen av okkludin.
      2. Lagre det valgte bildet som en tiff, og utsett det for en "opprydding"-prosedyre for å eliminere artefakter med et grafikkredigeringsprogram (f.eks. Adobe PhotoshopCC [versjon 20.0.4]).
      3. Deretter måler du alle interessefelt med applikasjonen Analyze Particle of ImageJ2, og rapporterer dataene som antall piksler.
        MERK: Hvert eksperiment skal utføres i triplikat med tre interne replikasjonsfelt analysert for hver replikasjon. For å kvantifisere slim kan det samme prinsippet om måling av pikslene brukes på bildene tatt av henholdsvis de lilla-magenta-fargede nøytrale mucinene og det lyse blåfargede sure slimet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første viktige aspektet er å bestemme akseptabiliteten til den grunnleggende 3D-tarmekvivalente slimhinnen for eksperimentelle formål. Dette utføres med den mest brukte flekken i histologi- og histopatologilaboratorier, nemlig hematoksylin (flekker kjernefysisk materiale dyp blålilla farge) og eosin (flekker cytoplasmatisk materiale varierende nyanser av rosa). H&E-fargingen utføres først på en ubehandlet kontroll, som dyrkes under de samme forholdene og tidsrammen som de eksperimentelle behandlingene. Fra å visualisere mønsteret, formen og strukturen til celler, bestemmes suksessen til dette tarmcellemodellsystemet av Caco-2-cellene som danner et tett og vanlig monolag over den ekstracellulære matriksen (ECM) -rike lamina propria etter 5 dager (figur 1A). Eksempler på modellsystemer som vil bli ansett som uakseptable for videre analyser inkluderer de som viser overdreven vekst med uorganiserte epitellag, som vist etter 10 dager (figur 1B). Et ytterligere eksempel er et epitellag som er for tykt og uorganisert (figur 1C), forårsaket enten av såing av overflødige Caco-2-celler eller overdreven inkubasjon. Misdannelse (figur 1D), som enten skyldes såceller som ikke var i en aktiv proliferasjonsfase, eller problemer med fremstilling av lamina propria eller under fiksering med parafin (cellene løsnet/ødelagt), er også et eksempel på en uakseptabel rekonstruert tarmslimhinne. Tilsvarende uakseptabelt er mangelen på dannelse av epitellag (figur 1E), noe som indikerer såing av for få Caco-2-celler eller problemer i fremstillingen av lamina propria. Ved å bruke akseptable 3D-tarmekvivalenter, hvorfra flere seksjoner kan genereres, kan forskjellige parametere deretter undersøkes fra et enkelt eksperiment.

Av de forskjellige parametrene som kan analyseres, kan barriereintegritet som respons på proinflammatoriske induktorer visualiseres, og TJ-proteiner farges og kvantifiseres og sammenlignes med ubehandlede kontrollmodellsystemer. Her demonstrerer vi den proinflammatoriske effekten av 40 μg / ml totalt hveteprotein fra en durumhvetekilde med høyt gluteninnhold7, både på cellulær integritet så vel som TJ okkludinproteininnhold (figur 2A). Ved hjelp av H &E histologisk farging viser kontrollmodellsystemet Caco-2 søylecellene som danner et tett og vanlig monolag. Derimot ble effekten av den glutenholdige proteinprøven vist å forårsake forstyrrelse av monolaget, med mer uspesifikk eosinfarging (figur 2A). Videre kan tykkelsen på epitellaget måles og er vist å bli betydelig redusert etter eksponering for proinflammatorisk gluten (figur 2A,B). Ved å bruke et antistoff mot okkludin (konjugert til rødkromogenfarging), kunne okkludinprotein visualiseres og kvantifiseres. Signifikant høyere okkluderingsproteininnhold ble sett i kontrollgruppen sammenlignet med tarmslimhinnen eksponert for glutenprotein i 24 timer (figur 2A, C).

Tarmekvivalentene som består av en immunkomponent (representert ved U937-monocytter) er også ideelle for å undersøke effekten av proinflammatoriske induktorer på monocytaktivering, migrasjon og differensiering i makrofager. Igjen, ved bruk av 40 μg / ml totalt hveteprotein ekstrahert fra en hvetekilde med høyt gluteninnhold, var proinflammatorisk aktivering av U937-monocytter i lamina propria tydelig fra rask rødkoblet CD14-farging (figur 3A). Aktivering oppdages fra det økte uttrykket av dette rødfargede membranglykoproteinet på monocytter og makrofager. Det ble også påvist økt CD14-protein med fluoresceinisotiocyanat (FITC), som flekker grønt under immunfluorescens. Migrasjon ble påvist fra tilstedeværelsen av aktiverte U937-celler nær Caco-2 monolaget. Der monolaget hadde sprukket, ble det vist at U937-cellene hadde kommet inn i Caco-2-cellemonolaget (figur 3A). Det var ingen holdepunkter for CD14-farget monocyttmigrasjon i kontrollgruppen (figur 3A). Differensieringen av monocytter til makrofager er identifiserbar fra markøren CD11b. Det ble ikke påvist CD11b-farging i kontrollgruppen med verken rødkromogen eller FITC (figur 3B). I stedet ble CD11b-makrofager observert i vev eksponert for gluten både i ECM-rik lamina propria og i det rupturerte Caco-2 monolaget (figur 3B).

Ved å bruke LPS til å simulere tarmbetennelse, viser vi her at det også er mulig å bruke dette modellsystemet til å undersøke sure muko- og mukopolysakkarider produsert av Caco-2-cellene i henholdsvis den ubehandlede kontroll- og LPS-behandlingen (figur 4A). Ved bruk av Alcian blå og PAS farging, er surt slim farget lyseblått, og nøytrale muciner er farget lilla-magenta, henholdsvis. Omfanget av slimfarging kan tilsvarende kvantifiseres og er vist å være signifikant indusert under 1 ng/ml LPS-utfordring (figur 4B). Videre, før fiksering, kan mediet fjernes for å undersøke proinflammatorisk cytokinproduksjon. Selv om mange ekskresjonscytokiner kan måles, ble midkine (MDK) i dette tilfellet valgt. MDK er en endogen inflammatorisk markør indusert av transkripsjonsfaktoren, nukleær faktor kappa-lyskjedeforsterker av aktivert B-celle (NF-κB) -vei, og er også assosiert med inflammatoriske sykdommer i tarmceller15. Under LPS-utfordringen induseres MDK signifikant sammenlignet med kontrollen (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Ubehandlede kontroll 3D tarmekvivalenter. Farging av hematoksylin og eosin (H&E) av ubehandlede 3D-tarmekvivalenter (Caco-2/U937/L929-kokulturer) i 24 timer som en verifisering av effekten av den grunnleggende 3D-tarmslimhinnemodellen for eksperimentelle formål. (A) En akseptabel eksperimentell modell sammenlignes med uakseptable modeller, som viser overdreven (B) epitelvekst og uorganiserte lag etter 10 dager, (C) overdreven epiteltykkelse og desorganisering, (D) misdannelse og (E) ingen epitelcellelag. Skalalinjen i hvert bilde tilsvarer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Behandlede 3D-tarmekvivalenter. (A) Farging av hematoksylin og eosin (H&E) og okkludering av 3D-intestinale ekvivalenter (Caco-2/U937/L929 kokulturer) eksponert i 24 timer til 40 μg/ml totalt protein fra en høy glutenholdig moderne hveteblanding sammenlignet med kontrollen (CTRL). Skalalinjen i hvert bilde tilsvarer 50 μm. (B) Kvantifisering av Caco-2 celletykkelse og (C) okkludinrød kromogenfarging. Signifikante forskjeller ble bestemt ved enveis varians (ANOVA) og representert som *** 0,0001< P < 0,001. De svarte prikkene representerer antall replikater. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Truzzi et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: CD14- og CD11B-farging. CD14-farging av U937-monocytter og CD11B U937-differensierte makrofager i 3D-tarmekvivalenter (Caco-2/U937/L929-kokulturer) eksponert for ikke tilsatt protein (kontroll [CTRL]) eller 40 μg/ml totalprotein fra en høyglutenholdig moderne hveteblanding etter en periode på 24 timer. For CD14- og CD11b-farging ble rask rød brukt som kromogen og kjerner ble motfarget med eosin. Skalalinjen i hvert bilde tilsvarer 20 μm. CD14- og CD11b-farging med fluoresceinisotiocyanat (grønn) ble også vist under immunfluorescens. Kjernene ble motfarget med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Skalalinjen i hvert bilde tilsvarer 50 μm. Piler indikerer tilstedeværelse av monocytter (CD14 positive celler) og makrofager (CD11b positive celler). Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Truzzi et al.7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Hematoksylin- og eosinfarging (H&E) og slimuttrykk fra Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff Stain (PAS) farging. (A) Caco-2 celler i basiske 3D intestinale ekvivalenter (Caco-2 / U937 / L929 kokulturer) etter 24 timer i den ubehandlede ekvivalente og rekonstruerte tarmslimhinnemodellsystemer utsatt for 1 ng / ml lipopolysakkarid. Skalalinjen i hvert bilde er lik 50 μm. (B) Kvantifisering av slimuttrykk ble bestemt av enveis varians (ANOVA) med signifikans rapportert som **** P < 0,0001. De svarte prikkene representerer antall replikater. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Truzzi et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Midkine-uttrykk. Midkineekspresjon i mediet av 3D intestinale ekvivalenter (Caco-2 /U937/L929 kokulturer) etter 24 timer i ubehandlet kontroll (CTRL) og tarmslimhinne modellsystemer eksponert for 1ng/ml lipopolysakkarid. Kvantifisering av midkineuttrykk ble bestemt av enveis varians (ANOVA) med signifikans rapportert som **** P < 0,0001. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Truzzi et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk diagram som representerer konstruksjon og eksperimentell bruk av tarmekvivalenter, samt fiksasjon og mikroskopiske analyser av parametere fra vevssnitt. Det skjematiske diagrammet oppsummerer konstruksjonen av tarmekvivalenter og mulige eksperimentelle behandlinger som kan administreres til disse modellene. Genereringen av flere vevssnitt fra et enkelt eksperiment tillater analyser av mange strukturelle og immunmessige aspekter ved tarmslimhinnen, som illustrert i figur 1, figur 2, figur 3 og figur 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det grunnleggende rekonstruerte modellsystemet for tarmslimhinner som presenteres her (figur 6) kombinerer fysiologisk kompleksitet (mer fysiologisk relevante 3D-cellekulturer som inneholder et Caco-2-monolag med en ECM-rik lamina propria-støtte som inneholder fibroblaster og monocytter) med eksperimentell enkelhet (ved bruk av kommersielle humane cellelinjer for å produsere standardiserte og lett repeterbare systemer)13. Dette modellsystemet anses derfor som et egnet alternativ til murinmodeller med sikte på å evaluere effekten av potensielle legemidler/matkomponenter på integriteten til tarmbarrieren. I denne forbindelse underbygger tidligere artikler effekten av den nåværende cellekulturmodellen ved testing av både potensielt gunstige forbindelser (pluss doseavhengighet) så vel som skadelige matkomponenter 7,16,17. Videre kan LPS eller alternative proinflammatoriske reagenser (2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre eller dekstransulfatnatrium) tilsettes til den nåværende tarmslimhinnemodellen for å simulere IBD-symptomer. På denne måten er det potensielt mulig å studere etiologien til tarmsykdommer fra et strukturelt aspekt, så vel som fra ekspresjonen av cytokiner, som proinflammatorisk MDK, som er en markør for IBD15. Dette grunnleggende modellsystemet har også et eventuelt screeningpotensial for narkotika for den bredere befolkningen. Selv om modellsystemet er fysiologisk mer komplekst enn 2D-modeller13,14, inkluderer begrensningene i reproduksjon av kompleks menneskelig fysiologi fraværet av både et mikrofluidisk system (fluidisk perfusjon av kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer og fjerning av avfallsprodukter samt mekaniske stimuli)8,14 og mikrobiomet (evaluering av vertsmikrobiominteraksjoner i tarmsykdommer)8, 14.

Fordelen med å bruke den nåværende grunnleggende 3D-tarmslimhinnemodellen i kombinasjon med parafininnebygging for lysmikroskopisk evaluering av epitelbarriereintegritet er at flere vevssnitt kan gjøres fra et enkelt eksperiment, og dermed tillate analyse av mange parametere. Transepitelial elektrisk motstand (TEER)3 er en vanlig metode for å vurdere tarmbarrierens integritet og har blitt brukt i forbindelse med makromolekylære permeabilitetsstudier 3,18, samt mye rapporterte studier på Western blot evaluering av TJ-proteinuttrykk.  Western blot-evaluering gir kvantitativ innsikt i generelle endringer i proteinuttrykk, og TEER fungerer som et kvantitativt mål på barriereintegritet. I stedet gir mikroskopisk evaluering et verdifullt verktøy for kvalitativ visualisering og vurdering av lokale proteinendringer og interaksjoner18.

Mikroskopisk evaluering av en modell med en immunkomponent tillater visualisering av immunresponser, for eksempel differensiering av monocytter i makrofager og migrasjon av aktiverte monocytter i ECM, som demonstrert her ved CD14- og CD11b-farging. Identifisering kan gjøres via immunhistokjemi og/eller immunfluorescensfarging på enkelte vevssnitt, slik det ble vist for CD14 og CD11b i figur 3. Immunhistokjemi tillater strukturell visualisering av det rekonstruerte tarmslimhinnevevet som helhet. Videre er det mulig å identifisere både kjernene og cytoplasma i celler. I motsetning til dette tillater konfokal immunfluorescens ikke at vevet ses som en helhet (bare markørene av interesse og DAPI-fargede kjerner). Det gir imidlertid et veldig rent bilde der bakgrunnsfargen elimineres. Fordelen med dette er at det tillater større presisjon i å bevise positiviteten eller negativiteten til markørene og som sådan beregningen av eventuelle forskjeller i fargeintensitet (for eksempel en markør som er mer uttrykt i en celle enn i en annen). Potensielt kan omfanget av migrasjon av CD14-monocyttene fra lamina propria til Caco-2-monolaget også estimeres fra flere replikerte bilder tatt på forskjellige tidspunkter. Ikke desto mindre var tegn på betennelse tydelig fra tilstedeværelsen av både CD14- og CD11b-fargede celler.

Et område på 20-40 μg totalt protein brukes av de fleste laboratorier for vestlig blotting19. Kvantifiseringen av mange gap-junction-proteiner (okkludin, claudin, zonulin og E-caderin) kan utføres ved immunhistokjemisk og/eller fluorescerende farging på individuelle vevsseksjoner, noe som krever betydelig mindre protein. Samtidig, fra samme eksperiment, kan epitellagets integritet som respons på forbindelser også visualiseres fra mønsteret, formen og strukturen til celler med H &E-farging.

Effekten av en grunnleggende 3D rekonstruert tarmslimhinne for bruk i farging av slimproduksjon, TJ-proteiner og proteiner produsert fra immunresponser er avhengig av å overvinne kritiske trinn, spesielt i konstruksjonen av modellsystemet og under vevsfiksering.  Når det gjelder modellkonstruksjon, er det henholdsvis grunnleggende å bruke riktig sammenløp og såing av riktig antall Caco-2-celler (angitt av notatene i protokollen). For mange celler eller feil sammenløp vil resultere i et tykt og uorganisert epitellag. I stedet vil for få celler resultere i enten redusert eller mangel på epitellagdannelse. Like grunnleggende ved såing er riktig cellekonfluens og antall L929- og U937-celler i ECM, samt riktig håndtering av kollagenet under tilberedning. Overflødige celler eller rask polymerisering av kollagenet vil resultere i en kompakt og misformet ECM, som igjen påvirker strukturen til epitelcellene ovenfor. Tilsvarende vil for få kollagendannende L929-celler resultere i feil konsistens av ECM, mens for få U937-monocytter ikke ville favorisere en immunrespons. Det er også viktig at celler brukes til eksperimentering etter 5 dager, da en langvarig inkubasjon vil resultere i overdreven cellevekst som resulterer i et kompakt epitellag. Videre, gitt at den nåværende utformingen mangler et mikrofluidisk system og er representativt for en statisk intestinal cellulær modell, for å favorisere frigjøring av molekyler og vekst og stimulering av celler, er det svært viktig at mediet endres hver dag. Når det gjelder fikseringsprotokollen, er clearingfasen kritisk, og gitt at tiden det tar for vevet å bli gjennomsiktig i parafin kan variere, må hvert tarmslimhinnesystem observeres nøye i denne fasen. Gjennom fikseringsprosedyren må det tas hensyn til håndtering av disse modellene for å unngå å skade dem.

For å konkludere, forutsatt streng overholdelse av de kritiske punktene i konstruksjonen og fikseringen av de grunnleggende 3D-tarmekvivalenter, kan modellene gi mange vevsseksjoner for evaluering av flere parametere i farmasøytiske screening- og toksisitetsstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Takk til Umberto Veronesi Foundation for et stipend som støtter forskerarbeid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue/PAS kit ScyTek Laboratories, Inc. APS-1, APS-2 kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solution Thermo Fisher 15250061 cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells ATCC ATCC HTB-37 cell line
Citro-Histo-Clear Limonene based Histoline laboratories R0050CITRO reagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO 11965092 cell colture reagent
Embedding Center Histoline laboratories TEC2900 instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO A5256701 cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 12350039 cell colture reagent
Human Midkine ELISA kit Cohesion Biosciences CEK1270 kit ELISA
Inverted microscope Eclipse Ts2, Nikon MFA34100 microscope
L929 mouse fibroblasts ATCC ATCC ®-CCL1 cell line
LC3-II Novus Biologicals NB910-40752SuperNovusPack antibody
L-Glutamine GIBCO A2916801 cell colture reagent
Occludin Novus Biologicals NBP1-87402 antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C Histoline laboratories R0040 PLUS instrument for paraffin embedding
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
rat tail collagen type I GIBCO A1048301 cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) GIBCO 21870076 cell colture reagent
Sodium pyruvate GIBCO 11360070 cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher TF-CACC2FL cell counting instrument
Transwell Costar Corning 3413 plastic for cell colture
Trypsin GIBCO 15090046 cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line ATCC ATCC CRL-1593.2 cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit ScyTek Laboratories, Inc. AMH080 kit for immunohistochemical staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
  3. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
  4. Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
  5. Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
  6. Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
  7. Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
  8. Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
  11. Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
  12. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
  13. Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
  14. Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
  15. Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
  16. Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
  17. Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
  18. Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
  19. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 199 tarmmodell immunkomponent in vivo in vitro inflammatoriske tarmsykdommer farmakologisk screening toksisitetsstudier cellebaserte in vitro-modeller eksperimentell enkelhet fysiologisk kompleksitet Caco-2 enterocytter U937 monocytter L929 fibroblaster parafininnebygging lysmikroskopisk evaluering H&E-fargede seksjoner tett kryss
Grunnleggende tredimensjonalt (3D) tarmmodellsystem med en immunkomponent
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Truzzi, F., Dilloo, S., Chang, X.,… More

Truzzi, F., Dilloo, S., Chang, X., Whittaker, A., D'Amen, E., Dinelli, G. Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component. J. Vis. Exp. (199), e65484, doi:10.3791/65484 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter