Summary
Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.
Abstract
Die Verwendung von In-vivo - und In-vitro-Darmmodellen zur Untersuchung der Pathophysiologie entzündlicher Darmerkrankungen, zum pharmakologischen Screening potenziell nützlicher Substanzen und zur Toxizitätsuntersuchung potenziell schädlicher Lebensmittelbestandteile hat zugenommen. Relevant ist, dass derzeit ein Bedarf an der Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen besteht, um Tiermodelle zu ersetzen. Hier wird ein Protokoll für ein grundlegendes, dreidimensionales (3D) intestinales Äquivalentmodell aus "gesundem Gewebe" unter Verwendung von Zelllinien vorgestellt, das sowohl experimentelle Einfachheit (standardisiertes und leicht wiederholbares System) als auch physiologische Komplexität (Caco-2-Enterozyten mit einer unterstützenden Immunkomponente von U937-Monozyten und L929-Fibroblasten) bietet. Das Protokoll beinhaltet auch eine Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Auswertung von fixierten Darmäquivalenten, wodurch der Vorteil der Analyse mehrerer visueller Parameter in einem einzigen Experiment geboten wird. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte (H&E)-gefärbte Schnitte, die zeigen, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht in Kontrollbehandlungen bilden, werden verwendet, um die Wirksamkeit des Modells als experimentelles System zu überprüfen. Zu den Parametern, die aus den Schnitten analysiert wurden, gehören eine reduzierte Monoschichtdicke sowie eine Störung und Ablösung von der zugrunde liegenden Matrix (H&E), eine verminderte Expression von Tight-Junction-Proteinen, wie sie aus der Occludin-Färbung (statistisch quantifizierbar) hervorgeht, und die Immunaktivierung migrierender U937-Zellen, wie sie durch die Cluster-of-Differentiation 14 (CD14)-Färbung und die CD11b-bezogene Differenzierung in Makrophagen nachgewiesen wird. Wie die Verwendung von Lipopolysaccharid zur Simulation einer Darmentzündung zeigt, sind zusätzliche Parameter, die gemessen werden können, eine erhöhte Schleimfärbung und Zytokinexpression (z. B. Midkin), die vor der Fixierung aus dem Medium extrahiert werden können. Das grundlegende dreidimensionale (3D) Darmschleimhautmodell und die fixierten Schnitte können für Studien zum Entzündungsstatus und zur Barriereintegrität empfohlen werden, wobei die Möglichkeit besteht, mehrere visuell quantifizierbare Parameter zu analysieren.
Introduction
Die intestinale Epithelbarriere, eine eine Zelle dicke innere Auskleidung, die verschiedene Arten von Epithelzellen enthält, stellt die erste physikalische Abwehrbarriere oder Schnittstelle zwischen dem äußeren und dem inneren Milieu des Körpers dar 1,2. Enterozyten vom Säulentyp stellen die am häufigsten vorkommende Art von Epithelzellen dar. Diese sind für die Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Barriere durch Wechselwirkungen zwischen mehreren Barrierekomponenten, einschließlich Tight Junctions (TJs), verantwortlich und spielen eine wichtige Rolle bei der Straffung der Barriere 1,3. Die TJ-Struktur besteht aus intrazellulären Plaqueproteinen wie Zonula occludens (ZO) und Cingulin, die mit Transmembranproteinen zusammenarbeiten, einschließlich Occludinen, Claudinen und junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAMs), die eine reißverschlussartige Struktur bilden, die die benachbarten Zellen fest miteinander verbindet 3,4. Die Transmembranproteine regulieren die passive parazelluläre Diffusion kleiner Verbindungen und schließen toxische große Moleküle aus.
Potenziell toxische Lebensmittelverbindungen und Lebensmittelkontaminanten stimulieren die Produktion von entzündlichen Zytokinen, die die epitheliale Permeabilität stören, Immunzellen aktivieren und chronische Entzündungen des Darmgewebes verursachen 5,6,7. Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass verschiedene antioxidative und entzündungshemmende Phytochemikalien die inflammatorische Zytokinexpression reduzieren und die Integrität der intestinalen TJ-Barriere durch die Wiederherstellung der TJ-Proteinexpression und -assemblierung verbessern 4,6,8. Daher hat die Regulierung der Integrität der Epithelbarriere sowohl durch nützliche als auch durch schädliche Verbindungen zu einer Zunahme der Verwendung von In-vivo- und In-vitro-Modellen geführt, die darauf abzielen, die Darmbarriere für pharmazeutische Screening- und Toxizitätsstudien nachzuahmen. Dies ist besonders relevant angesichts des zunehmenden Interesses am Verständnis der Pathophysiologie von Darmerkrankungen (CED), nekrotisierender Enterokolitis und Krebs, die in experimentellen Modellen simuliert werden können 8,9,10.
Gefragt ist die Entwicklung von zellbasierten In-vitro-Modellen, um das Ziel der "3R" im Tierversuch zu erreichen. Dazu gehören Ersatzalternativen zur Verwendung von Tieren, die Verringerung der Anzahl der verwendeten Tiere und die Verfeinerung der Anwendung von Methoden zur Linderung von Not 11,12,13. Darüber hinaus sind die zugrundeliegenden molekularen, zellulären und physiologischen Mechanismen zwischen menschlichen und murinen Modellen (Nagetiere sind die am weitesten verbreitete Spezies) unterschiedlich, was zu einer Kontroverse über die Wirksamkeit der murinen Modelle als Prädiktoren für menschliche Reaktionen führt12,13. Zu den zahlreichen Vorteilen von In-vitro-Modellen humaner Zelllinien gehören zielbeschränkte Experimente, direkte Beobachtung und kontinuierliche Analyse13.
Einzelzell-Monoschichten in zweidimensionalen (2D) Kulturen haben als leistungsfähige Modelle gedient. Diese können jedoch die physiologische Komplexität menschlicher Gewebe nicht exakt wiedergeben 8,13,14. Infolgedessen werden 3D-Kultursysteme mit immer besseren Verbesserungen entwickelt, um die physiologische Komplexität sowohl von gesundem als auch von erkranktem Darmgewebe als Risikobewertungs-Toolboxen der nächsten Generation zu rekapitulieren 13,14. Zu diesen Modellen gehören 3D-Transwell-Gerüste mit verschiedenen Zelllinien, Organoidkulturen und mikrofluidischen Geräten (Intestine-on-Chip), die sowohl Zelllinien als auch Organoide (sowohl aus gesundem als auch aus erkranktem Gewebe) verwenden8,13,14.
Das in der vorliegenden Studie vorgestellte 3D-Protokoll für "gesundes Gewebe" basierte auf der Suche nach einem Gleichgewicht zwischen physiologischer Komplexität und experimenteller Einfachheit13. Das Modell ist repräsentativ für ein 3D-Transwell-Gerüst, das aus drei Zelllinien besteht (Enterozyten [die Goldstandard-Caco-2-Linie des Kolon-Adenokarzinoms] mit einer unterstützenden Immunkomponente [U937-Monozyten und L929-Fibroblasten]), die ein standardisiertes und leicht wiederholbares System darstellen, das für das vorläufige Screening von Nahrungsmolekülen von Interesse auf die Integrität der Darmepithelbarriere und die Immunantwort anwendbar ist. Das Protokoll umfasst Paraffineinbettungen zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Integrität der Epithelbarriere unter Verwendung von fixierten Darmäquivalenten. Der Vorteil des vorliegenden Ansatzes besteht darin, dass zahlreiche Abschnitte des eingebetteten Gewebes in einem einzigen Experiment für mehrere Parameter gefärbt werden können.
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Protocol
1. Erstellung des grundlegenden 3D-rekonstruierten Darmschleimhautmodells
HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Alle Schritte des Verfahrens, bei denen der Zellinkubator verwendet wird, bedeuten, dass die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert werden (sofern im Protokoll nicht anders angegeben).
- Vorherige Präparation der im Darmmodellsystem verwendeten Zelllinien
- L929-Maus-Fibroblastenzellen in einer Konzentration von 5 x 105 in 5 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 2 mM L-Glutamin, 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) enthält, in einem F25-Kolben aussäen und 4 Tage vor dem Aufbau der Darmmodelle in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium mit einer Pipette entfernt. Dann fügen Sie frisches Medium (5 ml) hinzu und inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang.
HINWEIS: Die Zellen müssen vor der Verwendung zu 80 % konfluierend sein. - Caco-2-Zellen (Konzentration von 2 x 106) in 10 mL DMEM-Medium (mit 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken) in einen F75-Zellkolben geben und 4 Tage vor dem Aufbau des Darmschleimhautmodells in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium wie in Schritt 1.1.1 beschrieben gewechselt und 48 h lang bis zu einer Konfluenz von 80 % inkubiert.
HINWEIS: Die Zellen müssen sich in einer aktiven proliferierenden Phase befinden: nicht zu spärlich oder zu konfluierend. Empfohlen wird eine 50-60%ige Konfluenz. Die Zellen dürfen nicht am Tag vor der Herstellung des Modells ausgesät werden, da dies die Proliferationsfähigkeit der Zellen verlangsamen könnte, die sich dann im rekonstruierten 3D-Modell nicht perfekt verankern würden. - U937-Zellen, die in Suspension (Konzentration von 1 x 106) wachsen, zu 10 ml Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (enthält 2 mM L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat, 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken) in einem F75-Zellkolben 2 Tage vor dem Modellaufbau hinzufügen und 48 Stunden lang in einen Inkubator geben.
- L929-Maus-Fibroblastenzellen in einer Konzentration von 5 x 105 in 5 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 2 mM L-Glutamin, 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) enthält, in einem F25-Kolben aussäen und 4 Tage vor dem Aufbau der Darmmodelle in einem Inkubator kultivieren. Nach 48 h wird das Medium mit einer Pipette entfernt. Dann fügen Sie frisches Medium (5 ml) hinzu und inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang.
- Vorbereitung der Transwell Co-Kulturplatteneinsätze
- Wählen Sie eine 24-Well-Platte mit Einsätzen mit 0,4-μm-Filtern.
HINWEIS: Der 0,4-μm-Filter ist eine Standardwahl für Arzneimitteltransportstudien. Die Filtergrößen von 3 μm und 8 μm werden nicht empfohlen, um mögliche Verluste der kollageneingebetteten Zellen zu verhindern. - Befeuchten Sie die Transwell-Filter (im Folgenden als Membraneinsätze bezeichnet) mit einer Pipette mit 500 μl Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) unterhalb und oberhalb des Filtereinsatzes.
- Schließen Sie die Multi-Well-Platte und legen Sie sie für mindestens 2 h in einen Inkubator.
HINWEIS: Die Membraneinsätze können bis zu 24 h im HBSS verbleiben. Dieser Vorgang kann am Tag vor der Erstellung des Modells durchgeführt werden. Es ist wichtig, dass die Membraneinsätze vollständig hydratisiert sind und der Filter nicht austrocknet, da dies die richtige Haftung der Probe erschweren könnte. - Nehmen Sie die Platten nach 2 h (oder 24 h) aus dem Inkubator. Saugen Sie das HBSS vorsichtig von oberhalb und unterhalb der Membraneinsätze mit einer Pipette an und lassen Sie es 10 Minuten trocknen.
- Wählen Sie eine 24-Well-Platte mit Einsätzen mit 0,4-μm-Filtern.
- Präparation der zellfreien Kollagen Lamina propria des grundlegenden 3D-Darmmodellsystems (TAG 1)
- Bereiten Sie eine zellfreie Kollagenlösung in einem sterilen 50-ml-Röhrchen auf Eis vor, die die folgenden Komponenten in DMEM enthält: 10 % fötales Kälberserum (FBS), 200 mM L-Glutamin, 1 % Natriumbicarbonat und 1,35 mg/ml Typ-1-Rattenschwanzkollagen.
HINWEIS: Alle diese Komponenten müssen auf Eis aufbewahrt und mit gekühlten Pipettenspitzen in das DMEM gegeben werden. Das Typ-1-Rattenschwanzkollagen muss zuletzt hinzugefügt werden, da dieses mit steigender Temperatur und steigendem pH-Wert polymerisiert. Die Menge der hergestellten zellfreien Kollagenlösung hängt von der Anzahl der erforderlichen Darmäquivalente ab. - Geben Sie 250 μl der Lösung in jeden Platteneinsatz (über dem Membranfilter) für die Anzahl der ausgewählten Darmäquivalente und legen Sie den Deckel auf die Multi-Well-Platte. Lassen Sie die Kollagenlösung bei Raumtemperatur (RT) unter der Laminar-Flow-Haube polymerisieren.
HINWEIS: Neben dem Übergang in eine festere Phase zeigt sich die Polymerisation auch in einem Farbwechsel von Gelb zu Rosa. Die Polymerisation ist in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten abgeschlossen.
- Bereiten Sie eine zellfreie Kollagenlösung in einem sterilen 50-ml-Röhrchen auf Eis vor, die die folgenden Komponenten in DMEM enthält: 10 % fötales Kälberserum (FBS), 200 mM L-Glutamin, 1 % Natriumbicarbonat und 1,35 mg/ml Typ-1-Rattenschwanzkollagen.
- Präparation, Zellzählung und Zugabe von Fibroblasten- (L929) und Monozytenzellen (U937) zum Modellsystem (DAY 1)
- Entnehmen Sie die L929-Zellkultur (Schritt 1.1.1) aus dem Inkubator. Saugen Sie das Medium mit einer Vakuumpumpe an, ersetzen Sie es durch 5 ml sterile Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS; ohne Ca und Mg) und spülen Sie die Zellen.
- Saugen Sie das PBS mit einer Vakuumpumpe an. Fügen Sie 2 ml einer vorgefertigten Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA in PBS) hinzu und legen Sie sie für 3-5 Minuten in einen Inkubator.
- Verwenden Sie ein inverses Mikroskop (z. B. Eclipse Ts2, Nikon), um festzustellen, ob sich die Zellen von der Adhäsionsfläche lösen. Wenn dies der Fall ist, fügen Sie sofort 2 ml DMEM (mit 10 % FBS) hinzu, um die Trypsinreaktion zu blockieren, und spülen Sie die Zellen.
- Die Zelllösung wird in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 645 x g zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe an.
HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass das Pellet nicht gestört wird. Die Wirkung von DMEM wurde an den L929- und U937-Zellen getestet und es wurde nicht gezeigt, dass sie nachteilige Auswirkungen auf das Wachstum hat. - Geben Sie 1 ml DMEM in das Pellet und suspendieren Sie die Zellen.
HINWEIS: Die Zellen müssen homogen in der Lösung suspendiert sein. - Entfernen Sie 20 μl der Zellen in DMEM und fügen Sie 20 μl Trypanblaulösung hinzu. Entnehmen Sie 20 μl der Mischung und bewerten Sie die Zelldichte mikroskopisch mit einer Zellzählkammer.
- Entfernen Sie die U937-Zellkultur (Schritt 1.1.3) aus dem Inkubator. Die Zelllösung wird bei 645 x g 5 min zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe an, um eine Störung des Pellets zu vermeiden.
- Suspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI. Achten Sie wie bei den L929-Zellen darauf, dass die Zellen homogen in der Lösung suspendiert sind.
- In ähnlicher Weise ist die Zelldichte wie in Schritt 1.4.6 beschrieben zu bestimmen.
- Bereiten Sie eine Kollagenlösung wie in Schritt 1.3.1 beschrieben vor.
HINWEIS: Die Menge der herzustellenden Lösung muss 450 μl für jeden Einsatz (oder jedes Modell) berücksichtigen. - Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die eine Anzahl von 50.000 L929-Zellen bzw. 15.000 U937-Zellen in einem Volumen von 50 μl für jedes zu konstruierende Darmäquivalentmodell enthält.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen ist ein kritischer Faktor. Zu viele von beiden Zelltypen würden zu einer Lamina propria führen, die übermäßig mit Zellen gefüllt ist, die nicht ausreichend organisiert wären. Eine geringere Anzahl von Fibroblasten (die Kollagen produzieren) würde zu einer weniger kompakten Lamina propria führen, während zu wenige Monozyten die Immunantwort auf Reize behindern würden. Unter der Voraussetzung, dass die richtige Anzahl von Zellen in jedem 50-μl-Aliquot vorhanden ist, kann ein Gesamtvolumen von 600 μl für die 12 Filtereinsätze in jeder 24-Well-Platte hergestellt werden. - In Schritt 1.4.10 werden jeweils 50 μl Aliquot mit den Zellen zu 450 μl Kollagenlösung gegeben. Gründlich mischen.
- Übertragen Sie die vorbeschichtete zellfreie Kollagenlamina propria für jedes Modell mit 500 μl der kollagenhaltigen Zelllösung.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Volumina schnell zu jedem Einsatz hinzuzufügen, und daher ist es ratsam, die Anzahl der rekonstruierten Darmschleimhautmodelle auf 12 oder weniger gleichzeitig zu begrenzen. - Schließen Sie die Platte und legen Sie sie für 2 Stunden in einen Inkubator, damit die Lösung aushärten kann.
- Präparation, Zellzählung und Zugabe von epithelialen Caco-2-Zellen zum Darmmodell (TAG 1)
- Entnehmen Sie die Caco-2-Zellkultur (Schritt 1.1.2) aus dem Inkubator. Wiederholen Sie die Verfahren aus Schritt 1.4.1 mit 10 ml PBS zum Vorspülen. Dann 5 ml einer vorgefertigten Trypsin-EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA in Ca- und Mg-freiem PBS) zugeben und für 5-8 Minuten in einen Inkubator geben.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4.3 (aber mit 5 ml DMEM, um die Trypsinreaktion zu blockieren) bis 1.4.6, um die Zellen mit der Zellzählkammer zu zählen.
- Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die eine Anzahl von 150.000 Caco-2-Zellen in 50 μl enthält.
HINWEIS: Die Anzahl der verwendeten Zellen ist ein kritischer Punkt. Bei mehr als 150.000 Zellen kann es zu einer kompakten, desorganisierten Epithelschicht kommen, während bei zu wenig (weniger als 100.000) die Zellen Schwierigkeiten haben zu wachsen und die Basalmembran nicht ausreichend bedecken, wodurch eine diskontinuierliche Darmepithelschicht entsteht. Stellen Sie sicher, dass die Zellen effektiv aufgehängt sind. Die Spitze einer 200-μl-Pipette kann verwendet werden, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Da 12 Modelle gleichzeitig konstruiert werden können, kann eine 600-μl-Zelllösung hergestellt werden. - Nach Ablauf der in Schritt 1.4.14 geforderten 2 Stunden werden 50 μl in DMEM suspendierte Caco-2-Zellen in die Mitte jeder Basalmembran gegeben. Schließen Sie den Deckel der Multiwell-Platte.
- Unter der sterilen Laminar-Flow-Haube 10 Minuten inkubieren. Dann für 30 Minuten in den Inkubator geben.
- Bereiten Sie eine DMEM-Lösung vor, die 10 % FBS und 1 % Pen/Streptokokken enthält.
HINWEIS: Bereiten Sie eine ausreichende Lösung vor, um ein Volumen von 1 ml pro Modell zu verwenden. - Fügen Sie 500 μl des Mediums über dem rekonstruierten Modell und 500 μl unter dem Filter hinzu.
HINWEIS: Beim Hinzufügen des Mediums über dem Filter ist Vorsicht geboten, um ein Ablösen oder Belasten der Zellen zu vermeiden. - Schließen Sie das Multi-Well-Plattensystem und legen Sie es in den Inkubator.
- Modellvorbereitung/-bildung und -nutzung (TAG 2 bis TAG 6)
- TAG 2: Entfernen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette sowohl oberhalb des rekonstruierten Modells als auch unterhalb des Filters. Ersetzen Sie sie durch frische 500 μl frisches DMEM (10 % FBS und 1 % Pen/Streptokokken) über bzw. unter dem Filter.
- TAG 3: Wiederholen Sie den Vorgang wie oben in Schritt 1.6.1.
- TAG 4: Wiederholen Sie den Vorgang wie oben in Schritt 1.6.1.
HINWEIS: Bei diesem Darmmodell handelt es sich um ein statisches Zellmodell. Um die Freisetzung von Molekülen und das Wachstum und die Stimulation von Zellen zu begünstigen, ist es daher sehr wichtig, dass das Medium jeden Tag gewechselt wird. - TAG 5: Zu diesem Zeitpunkt ist das Modell vollständig ausgebildet/entwickelt. Verwenden Sie diese Modelle für weitere Studien.
HINWEIS: Die beste Zeit für die Verwendung des Modells liegt bei 5 Tagen. Obwohl die Zellen über einen längeren Zeitraum in einem Inkubator gehalten werden können, ist die Wahrscheinlichkeit umso größer, dass die Epithelzellen unkontrolliert wachsen, je mehr Zeit vergeht, was zu einer unorganisierten und kompakten Schicht führt, die schwer zu verwenden ist. - Nach 5 Tagen inkubieren Sie die Modelle entweder mit toxischen (Gluten oder Lipopolysaccharid [LPS]) oder nützlichen Komponenten (Polyphenole), die von Interesse sind. Fügen Sie diese dem oberen Teil des rekonstruierten Modells hinzu, das im DMEM-Medium aufgehängt ist.
ANMERKUNG: Die geeignete Konzentration jeder interessierenden Komponente muss berechnet und in einem DMEM-Medium suspendiert werden. Unbehandelte Kontrollen, die nur DMEM-Medium enthalten, müssen für den Vergleich mit den experimentellen Modellen eingerichtet werden. - Inkubieren Sie die Kontroll- und Versuchsmodelle für 24 Stunden in einem Inkubator.
- TAG 6: Entfernen Sie das Medium oberhalb und unterhalb des Filters mit einer Pipette.
HINWEIS: Das Medium kann für nachfolgende ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) aufbewahrt werden, um die Freisetzung von entzündlichen Zytokinen zu messen. Dazu muss das Medium in sterile Fläschchen gegeben und zur weiteren Analyse bei -20°C gelagert werden.
2. Paraffineinbettung der rekonstruierten Darmschleimhautmodelle
HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss unter einem chemischen Abzug durchgeführt werden. Jeder Schritt und die jeweilige Zeiteinteilung müssen strikt eingehalten werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, alle Reagenzien im Voraus vorzubereiten.
- Stellen Sie die Paraffinmaschine auf 58 °C ein, damit sie einsatzbereit ist.
- Übertragen Sie die Membraneinsätze mit einer Zange in eine sterile 24-Well-Platte in saubere Wells.
- 500 μl 37% gepuffertes Formalin in PBS über dem Filter und 1 ml unter dem Filter zugeben. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie ihn 2 h bei RT unter dem chemischen Abzug.
HINWEIS: Alternativ kann 4% gepuffertes Formalin bei RT für 1 h verwendet werden. - Entfernen Sie das Formalin und fügen Sie die HBSS-Lösung sowohl über als auch unter dem Filter hinzu. Entfernen Sie dann das HBSS.
- Lösen Sie die Lamina propria vom Membraneinsatz.
HINWEIS: Die Zellen der Darmschleimhaut lösen sich in der Regel sehr leicht vom Membraneinsatz, da sie nicht an diesem befestigt sind. Darüber hinaus bleiben die beiden Probenkompartimente (apikal und basal) befestigt, wodurch die 3D-Struktur erhalten bleibt. Wenn sie sich aus irgendeinem Grund nicht leicht ablösen lassen, ist es wichtig, eine sterile Einweg-Skalpellklinge zu verwenden, um die Darmschleimhaut aus dem Membraneinsatz zu entfernen. Die Membraneinlage kann geschnitten werden, wodurch sie sich vom Kunststoff löst. Achten Sie darauf, die Probe niemals mit dem Skalpell zu berühren. Das Motiv für die Entfernung des Membraneinsatzes aus den kollageneingebetteten Zellen ist, dass sich dieser Filter in den nachfolgenden Fixierungs- oder Paraffineinbettungsphasen ablösen kann, was Vergleiche zwischen Darmschleimhautmodellen unverhältnismäßig macht. Darüber hinaus haben die Membraneinsätze innerhalb des eingebetteten Abschnitts eine unterschiedliche Konsistenz, die das Schneiden beeinträchtigen kann. - Stellen Sie die 100-ml-Bechergläser unter den chemischen Abzug, wobei jeder Becher korrekt beschriftet ist, um ein rekonstruiertes Darmschleimhaut-Modellsystem zu enthalten, das untersucht wird. Geben Sie 25 ml 35% ETOH in jedes Becherglas und fügen Sie dann die rekonstruierte Darmschleimhaut hinzu. 10 Min. inkubieren.
- Ersetzen Sie das 35%ige Ethanol durch 25 ml 50%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
- Ersetzen Sie das 50%ige Ethanol durch 25 ml 70%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
- Ersetzen Sie das 70%ige Ethanol durch 25 ml 80%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
- Ersetzen Sie das 80%ige Ethanol durch 25 ml 95%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
- Ersetzen Sie das 95%ige Ethanol durch 25 ml 100%iges Ethanol und inkubieren Sie es 10 Minuten lang.
- Ersetzen Sie das 100%ige Ethanol durch einen weiteren 25-ml-Wechsel von 100%igem Ethanol und inkubieren Sie es für 10 Minuten.
- Stellen Sie 100-ml-Bechergläser unter den Abzug, die jeweils korrekt beschriftet sind, um ein zu untersuchendes Modell zu enthalten. Fügen Sie 50 ml Xylol oder ein histologisches Reinigungsmittel für 10-20 Minuten hinzu.
HINWEIS: Histo-Clear (histologisches Clearingmittel) wird empfohlen, da das Mittel die Klarheit und Lebendigkeit acidophiler Färbungen verbessert. Die Clearingzeit kann von einer rekonstruierten Darmschleimhautprobe zur anderen variieren und muss alle 2-3 min auf Transparenz im Erscheinungsbild überprüft werden. - Sobald die Proben durchsichtig sind, legen Sie sie in einen Gewebekassettenhalter aus Metall, der dann in der beheizten Maschine für 45 Minuten in flüssiges Paraffin getaucht wird.
- Wechseln Sie das Paraffin und lassen Sie die Proben weitere 45 Minuten in der beheizten Maschine.
- Entfernen Sie den Taschentuchkassettenhalter und legen Sie ihn zum Abkühlen auf Eis. Wenn sich die gekühlten Probenblöcke vom Metallhalter lösen, können diese bei Raumtemperatur weiter gekühlt werden.
- Bewahren Sie die Blöcke bei RT auf.
HINWEIS: Wenn das Ziel darin besteht, Abschnitte sofort vorzubereiten, können die Blöcke bei 4 ° C platziert werden, damit sie bei der Verwendung gut gekühlt sind. - Schneiden Sie 4-μm-Schnitte mit einem Mikrotom.
- Legen Sie die geschnittenen Abschnitte auf Objektträger und trocknen Sie sie 24 h lang in einem Ofen bei 37 ° C.
- Die Folien sind gebrauchsfertig. Lagern Sie sie bei RT, bis Sie entweder eine H&E-histologische Färbung oder eine immunhistochemische Reaktionsfärbung (Antigen-Antikörper-Typ) durchführen.
- Für die immunhistochemische Färbung wählen Sie die interessierenden Antikörper aus (entweder für die Untersuchung von TJ-Proteinen wie Occludin oder für die Aktivierung, Migration und Differenzierung von Monozyten) und weisen Sie die Expression (durch Färbung) mit kommerziellen Kits nach.
- In ähnlicher Weise ist der Schleim mit dem Alcianblau und dem Periodsäure-Schiff (PAS) Färbekit zu messen.
- Quantifizieren Sie die gefärbten TJ-Proteine von Interesse, wie z. B. Occludin, indem Sie den Prozentsatz der positiven Pixel auf mikroskopischen Aufnahmen berechnen, die mit dem Mikroskop aufgenommen wurden.
- Analysieren Sie Bilder der Zellen mit einer Bildanalysesoftware (z. B. ImageJ2-Software [Wayne Rasband, Version 2.9.0/1.53t]).
- Um die Analyse der Pixel durchzuführen, verarbeiten Sie die digitalen Bilder auf 300 Pixel/Zoll und konvertieren Sie sie in 8 Bit. Verarbeiten Sie dann die binären Bilder mit dem Color Deconvolution-Plugin , um die Färbung des interessierenden Proteins zu analysieren, in diesem Fall die permanente rote Färbung von Occludin.
- Speichern Sie das ausgewählte Bild als TIFF-Datei und unterziehen Sie es einer "Bereinigung", um Artefakte mit einem Grafikeditor (z. B. Adobe PhotoshopCC [Version 20.0.4]) zu entfernen.
- Messen Sie anschließend alle relevanten Felder mit der Anwendung Particle of ImageJ2 analysieren und geben Sie die Daten als Anzahl der Pixel an.
HINWEIS: Jedes Experiment sollte in dreifacher Ausführung durchgeführt werden, wobei für jedes Replikat drei interne Replikatfelder analysiert werden. Zur Quantifizierung des Schleims kann das gleiche Prinzip der Messung der Pixel auf die Bilder angewendet werden, die von den violett-magenta-gefärbten neutralen Mucinen bzw. hellblau gefärbten sauren Schleimen aufgenommen wurden.
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Representative Results
Der erste wichtige Aspekt besteht darin, die Akzeptanz der basischen 3D-Darmäquivalent-Schleimhaut für experimentelle Zwecke zu bestimmen. Dies wird mit der am weitesten verbreiteten Färbung in Histologie- und Histopathologielabors durchgeführt, nämlich Hämatoxylin (färbt Kernmaterial tiefblau-violett) und Eosin (färbt zytoplasmatisches Material in verschiedenen Rosatönen). Die H&E-Färbung wird zunächst an einer unbehandelten Kontrolle durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen und im gleichen Zeitrahmen wie die experimentellen Behandlungen kultiviert wird. Aus der Visualisierung des Musters, der Form und der Struktur von Zellen wird der Erfolg dieses intestinalen Zellmodellsystems dadurch bestimmt, dass die Caco-2-Zellen nach 5 Tagen eine dichte und regelmäßige Monoschicht über der extrazellulären Matrix (EZM)-reichen Lamina propria bilden (Abbildung 1A). Beispiele für Modellsysteme, die für weitere Analysen als inakzeptabel erachtet würden, sind solche, die ein übermäßiges Wachstum mit unorganisierten Epithelschichten zeigen, wie nach 10 Tagen gezeigt wird (Abbildung 1B). Ein weiteres Beispiel ist eine zu dicke und unorganisierte Epithelschicht (Abbildung 1C), die entweder durch die Aussaat überschüssiger Caco-2-Zellen oder durch eine übermäßige Inkubation verursacht wird. Eine Fehlbildung (Abbildung 1D), die entweder auf die Aussaat von Zellen zurückzuführen ist, die sich nicht in einer aktiven Phase der Proliferation befanden, oder auf Probleme bei der Präparation der Lamina propria oder während der Fixierung mit Paraffin (Zellen wurden abgelöst/ruiniert), ist ebenfalls ein Beispiel für eine inakzeptable rekonstruierte Darmschleimhaut. Ebenso inakzeptabel ist die fehlende Bildung von Epithelschichten (Abbildung 1E), die auf die Aussaat von zu wenigen Caco-2-Zellen oder Probleme bei der Präparation der Lamina propria hinweist. Mit akzeptablen 3D-Darmäquivalenten, aus denen mehrere Schnitte generiert werden können, können dann verschiedene Parameter aus einem einzigen Experiment untersucht werden.
Von den verschiedenen Parametern, die analysiert werden können, kann die Barriereintegrität als Reaktion auf proinflammatorische Induktoren visualisiert und TJ-Proteine gefärbt und quantifiziert und mit unbehandelten Kontrollmodellsystemen verglichen werden. Hier zeigen wir die proinflammatorische Wirkung von 40 μg/ml Gesamtweizenprotein aus einer Hartweizenquelle mit einem hohen Glutengehalt7, sowohl auf die zelluläre Integrität als auch auf den TJ-Occludin-Proteingehalt (Abbildung 2A). Mit Hilfe der H&E-Histologie-Färbung zeigt das Kontrollmodellsystem, dass die Caco-2-Säulenzellen eine dichte und regelmäßige Monoschicht bilden. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass die Wirkung der glutenhaltigen Proteinprobe eine Störung der Monoschicht mit mehr unspezifischer Eosinfärbung verursacht (Abbildung 2A). Darüber hinaus kann die Dicke der Epithelschicht gemessen werden und es wird gezeigt, dass sie nach Exposition gegenüber entzündungsförderndem Gluten signifikant reduziert ist (Abbildung 2A,B). Mit Hilfe eines Antikörpers gegen Occludin (konjugiert mit Rotchromogenfärbung) konnte das Occludin-Protein visualisiert und quantifiziert werden. In der Kontrollgruppe zeigte sich ein signifikant höherer Occludin-Proteingehalt im Vergleich zur Darmschleimhaut, die 24 Stunden lang Glutenprotein ausgesetzt war (Abbildung 2A,C).
Die intestinalen Äquivalente, die aus einer Immunkomponente (repräsentiert durch U937-Monozyten) bestehen, sind auch ideal, um die Auswirkungen von entzündungsfördernden Induktoren auf die Aktivierung, Migration und Differenzierung von Monozyten in Makrophagen zu untersuchen. Auch hier zeigte sich bei Verwendung von 40 μg/ml Gesamtweizenprotein, das aus einer Weizenquelle mit hohem Glutengehalt extrahiert wurde, eine proinflammatorische Aktivierung von U937-Monozyten in der Lamina propria durch eine schnelle rotgekoppelte CD14-Färbung (Abbildung 3A). Die Aktivierung wird durch die erhöhte Expression dieses rot gefärbten Membranglykoproteins auf Monozyten und Makrophagen nachgewiesen. Ein erhöhtes CD14-Protein wurde auch mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) nachgewiesen, das sich unter Immunfluoreszenz grün färbt. Die Migration wurde durch das Vorhandensein von aktivierten U937-Zellen in der Nähe der Caco-2-Monoschicht nachgewiesen. Dort, wo die Monoschicht gerissen war, wurde gezeigt, dass die U937-Zellen in die Caco-2-Zell-Monoschicht eingedrungen waren (Abbildung 3A). In der Kontrollgruppe gab es keine Hinweise auf eine CD14-gefärbte Monozytenmigration (Abbildung 3A). Die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen ist anhand des Markers CD11b erkennbar. In der Kontrollgruppe mit rotem Chromogen oder FITC war keine CD11b-Färbung erkennbar (Abbildung 3B). Stattdessen wurden CD11b-Makrophagen in den Geweben, die Gluten ausgesetzt waren, sowohl in der EZM-reichen Lamina propria als auch in der gerissenen Caco-2-Monoschicht beobachtet (Abbildung 3B).
Mit Hilfe von LPS zur Simulation von Darmentzündungen zeigen wir hier, dass es auch möglich ist, mit diesem Modellsystem sauren Muzin und Mucopolysaccharide zu untersuchen, die von den Caco-2-Zellen in der unbehandelten Kontrolle bzw. der LPS-Behandlung produziert werden (Abbildung 4A). Bei der Alcianblau- und PAS-Färbung wird saurer Schleim hellblau und neutrale Muzine violett-magenta gefärbt. Das Ausmaß der Schleimfärbung kann in ähnlicher Weise quantifiziert werden und es wird gezeigt, dass es unter einer LPS-Belastung von 1 ng/ml signifikant induziert wird (Abbildung 4B). Darüber hinaus kann das Medium vor der Fixierung entfernt werden, um die proinflammatorische Zytokinproduktion zu untersuchen. Obwohl zahlreiche exkretorische Zytokine gemessen werden können, wurde in diesem speziellen Fall Midkine (MDK) ausgewählt. MDK ist ein endogener Entzündungsmarker, der durch den Transkriptionsfaktor, den nukleären Faktor kappa-light-chain-enhancer of activated b cell (NF-κB)-Signalweg, induziert wird und auch mit entzündlichen Erkrankungen der Darmzellen in Verbindung gebrachtwird 15. Unter der LPS-Herausforderung wird MDK im Vergleich zur Kontrolle signifikant induziert (Abbildung 5).
Abbildung 1: Unbehandelte Kontroll-3D-Darmäquivalente. Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung von unbehandelten Kontroll-3D-Darmäquivalenten (Caco-2 /U937/L929 Co-Kulturen) für 24 h als Überprüfung der Wirksamkeit des grundlegenden 3D-Darmschleimhautmodells für experimentelle Zwecke. (A) Ein akzeptables experimentelles Modell wird mit inakzeptablen Modellen verglichen, die übermäßiges (B) Epithelwachstum und desorganisierte Schichten nach 10 Tagen, (C) übermäßige Epitheldicke und Desorganisation, (D) Fehlbildungen und (E) keine Epithelzellschicht zeigen. Der Maßstabsbalken in jedem Bild beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Behandelte 3D-Darmäquivalente. (A) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Occludin-Expression von 3D-Darmäquivalenten (Caco-2 /U937/L929-Kokulturen), die 24 h lang bei 40 μg/ml Gesamtprotein aus einer glutenhaltigen modernen Weizenmischung exponiert wurden (CTRL). Der Maßstabsbalken in jedem Bild beträgt 50 μm. (B) Quantifizierung der Caco-2-Zelldicke und (C) Occludin-Rot-Chromogen-Färbung. Signifikante Unterschiede wurden durch unidirektionale Varianz (ANOVA) bestimmt und als *** 0,0001< P < 0,001 dargestellt. Die schwarzen Punkte stellen die Anzahl der Replikate dar. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Truzzi et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CD14- und CD11B-Färbung. CD14-Färbung von U937-Monozyten und CD11B U937-differenzierten Makrophagen in 3D-Darmäquivalenten (Caco-2/U937/L929-Kokulturen), die nach einem Zeitraum von 24 h keinem zugesetzten Protein (Kontrolle [CTRL]) oder 40 μg/ml Gesamtprotein aus einer glutenhaltigen modernen Weizenmischung ausgesetzt wurden. Für die CD14- und CD11b-Färbung wurde schnelles Rot als Chromogen verwendet und die Zellkerne wurden mit Eosin gegengefärbt. Der Maßstabsbalken in jedem Bild beträgt 20 μm. Die CD14- und CD11b-Färbung mit Fluoresceinisothiocyanat (grün) wurde auch unter Immunfluoreszenz gezeigt. Die Zellkerne wurden mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gegengefärbt. Der Maßstabsbalken in jedem Bild beträgt 50 μm. Pfeile zeigen das Vorhandensein von Monozyten (CD14-positive Zellen) und Makrophagen (CD11b-positive Zellen) an. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Truzzi et al.7 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Schleimexpression aus der Alcianblau/Periodensäure-Schiff-Färbung (PAS). (A) Caco-2-Zellen in basischen 3D-Darmäquivalenten (Caco-2 /U937/L929 Co-Kulturen) nach 24 h in den unbehandelten äquivalenten und rekonstruierten Darmschleimhaut-Modellsystemen, die bei 1 ng/ml Lipopolysaccharid exponiert wurden. Der Maßstabsbalken in jedem Bild beträgt 50 μm. (B) Die Quantifizierung der Schleimexpression wurde durch eine unidirektionale Varianz (ANOVA) bestimmt, deren Signifikanz als **** P < 0,0001 angegeben wurde. Die schwarzen Punkte stellen die Anzahl der Replikate dar. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Truzzi et al.16 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Midkine-Expression. Midkine-Expression im Medium von 3D-intestinalen Äquivalenten (Caco-2 /U937/L929 Co-Kulturen) nach 24 h in den unbehandelten Kontroll- (CTRL) und Darmschleimhaut-Modellsystemen, die mit 1ng/mL Lipopolysaccharid exponiert wurden. Die Quantifizierung der Midkine-Expression wurde durch eine unidirektionale Varianz (ANOVA) bestimmt, deren Signifikanz als **** P < 0,0001 angegeben wurde. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Truzzi et al.16 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Aufbaus und der experimentellen Verwendung von Darmäquivalenten sowie der Fixierung und mikroskopischen Analyse von Parametern aus Gewebeschnitten. Das schematische Diagramm fasst den Aufbau der intestinalen Äquivalente und mögliche experimentelle Behandlungen zusammen, die diesen Modellen verabreicht werden können. Die Generierung mehrerer Gewebeschnitte aus einem einzigen Experiment ermöglicht die Analyse zahlreicher struktureller und immunrechtlicher Aspekte der Darmschleimhaut, wie in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier vorgestellte grundlegende rekonstruierte Modellsystem der Darmschleimhaut (Abbildung 6) kombiniert physiologische Komplexität (physiologisch relevantere 3D-Zellkulturen, die eine Caco-2-Monoschicht mit einem EZM-reichen Lamina-propria-Träger mit Fibroblasten und Monozyten enthalten) mit experimenteller Einfachheit (Verwendung kommerzieller humaner Zelllinien zur Herstellung eines standardisierten und leicht wiederholbaren Systems)13. Daher wird dieses Modellsystem als geeignete Alternative zu murinen Modellen angesehen, die darauf abzielen, die Wirkung potenzieller Arzneimittel/Nahrungsbestandteile auf die Integrität der Darmbarriere zu bewerten. In diesem Zusammenhang belegen frühere Artikel die Wirksamkeit des vorliegenden Zellkulturmodells bei der Prüfung sowohl potenziell nützlicher Verbindungen (plus Dosisabhängigkeit) als auch schädlicher Nahrungsbestandteile 7,16,17. Darüber hinaus können LPS oder alternative entzündungsfördernde Reagenzien (2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure oder Dextransulfat-Natrium) dem vorliegenden Darmschleimhautmodell hinzugefügt werden, um CED-Symptome zu simulieren. Auf diese Weise ist es potenziell möglich, die Ätiologie von Darmerkrankungen sowohl aus struktureller Sicht als auch aus der Expression von Zytokinen, wie z.B. pro-inflammatorischem MDK, das ein Marker für CED15 ist, zu untersuchen. Dieses grundlegende Modellsystem hat auch das Potenzial, Drogenscreenings für die breitere Bevölkerung durchzuführen. Obwohl das Modellsystem physiologisch komplexer ist als 2D-Modelle13,14, bestehen die Einschränkungen bei der Reproduktion komplexer menschlicher Physiologie durch das Fehlen eines mikrofluidischen Systems (fluidische Perfusion einer kontinuierlichen Nährstoffversorgung und Entfernung von Abfallprodukten sowie mechanischer Reize)8,14 und des Mikrobioms (Bewertung von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen bei Darmerkrankungen)8. 14. Anmelden
Der Vorteil der Verwendung des vorliegenden grundlegenden 3D-Darmschleimhautmodells in Kombination mit Paraffineinbettung zur lichtmikroskopischen Beurteilung der Integrität der Epithelbarriere besteht darin, dass mehrere Gewebeschnitte aus einem einzigen Experiment hergestellt werden können, wodurch die Analyse zahlreicher Parameter ermöglicht wird. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER)3 ist eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung der Integrität der Darmbarriere und wurde in Verbindung mit makromolekularen Permeabilitätsstudien 3,18 sowie in weit verbreiteten Studien zur Western-Blot-Bewertung der TJ-Proteinexpression verwendet. Die Western-Blot-Evaluierung liefert quantitative Einblicke in die Gesamtveränderungen der Proteinexpression, und TEER dient als quantitatives Maß für die Barriereintegrität. Stattdessen bietet die mikroskopische Auswertung ein wertvolles Werkzeug für die qualitative Visualisierung und Bewertung lokaler Proteinveränderungen und -interaktionen18.
Die mikroskopische Auswertung eines Modells mit einer Immunkomponente ermöglicht die Visualisierung von Immunantworten, wie z.B. die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen und die Migration aktivierter Monozyten in der EZM, wie hier durch CD14- und CD11b-Färbung gezeigt. Die Identifizierung kann durch Immunhistochemie und/oder Immunfluoreszenzfärbung an einzelnen Gewebeschnitten erfolgen, wie für CD14 und CD11b in Abbildung 3 gezeigt wurde. Die Immunhistochemie ermöglicht die strukturelle Darstellung des rekonstruierten Darmschleimhautgewebes als Ganzes. Darüber hinaus ist es möglich, sowohl die Zellkerne als auch das Zytoplasma in Zellen zu identifizieren. Im Gegensatz dazu erlaubt die konfokale Immunfluoreszenz nicht, das Gewebe als Ganzes zu sehen (nur die interessierenden Marker und DAPI-gefärbte Kerne). Es liefert jedoch ein sehr sauberes Bild, bei dem die Hintergrundfarbe eliminiert wird. Dies hat den Vorteil, dass es eine größere Präzision beim Nachweis der Positivität oder Negativität der Marker und damit die Berechnung von Unterschieden in der Farbintensität ermöglicht (z. B. ein Marker, der in einer Zelle stärker exprimiert wird als in einer anderen). Möglicherweise könnte das Ausmaß der Migration der CD14-Monozyten aus dem Inneren der Lamina propria in die Caco-2-Monoschicht auch aus mehreren Replikatbildern abgeschätzt werden, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden. Nichtsdestotrotz zeigten sich Hinweise auf eine Entzündung durch das Vorhandensein von CD14- und CD11b-gefärbten Zellen.
Ein Bereich von 20–40 μg Gesamtprotein wird von den meisten Laboratorien für Western Blotverwendet 19. Die Quantifizierung zahlreicher Gap-Junction-Proteine (Occludin, Claudin, Zonulin und E-Caderin) kann durch immunhistochemische und/oder fluoreszierende Färbung an einzelnen Gewebeschnitten erfolgen, wobei jeweils deutlich weniger Protein benötigt wird. Gleichzeitig kann im selben Experiment die Integrität der Epithelschicht als Reaktion auf Verbindungen auch anhand des Musters, der Form und der Struktur von Zellen mit H&E-Färbung visualisiert werden.
Die Wirksamkeit einer einfachen 3D-rekonstruierten Darmschleimhaut für den Einsatz bei der Färbung von Schleimproduktion, TJ-Proteinen und Proteinen, die aus Immunantworten hergestellt werden, hängt von der Überwindung kritischer Schritte ab, insbesondere beim Aufbau des Modellsystems und bei der Gewebefixierung. In Bezug auf die Modellkonstruktion ist die Verwendung des richtigen Zusammenflusses und das Seeding der korrekten Anzahl von Caco-2-Zellen (angegeben durch die Anmerkungen im Protokoll) von grundlegender Bedeutung. Zu viele Zellen oder ein falscher Zusammenfluss würden zu einer dicken und unorganisierten Epithelschicht führen. Stattdessen würden zu wenige Zellen entweder zu einer verminderten oder fehlenden Bildung von Epithelschichten führen. Ebenso grundlegend bei der Aussaat ist der korrekte Zellzusammenfluss und die Anzahl der L929- und U937-Zellen in der EZM sowie der richtige Umgang mit dem Kollagen während der Vorbereitung. Überschüssige Zellen oder eine schnelle Polymerisation des Kollagens würden zu einer kompakten und missgebildeten EZM führen, die sich wiederum auf die Struktur der darüber liegenden Epithelzellen auswirkt. Ebenso würden zu wenige kollagenbildende L929-Zellen zu einer falschen Konsistenz der EZM führen, während zu wenige U937-Monozyten eine Immunantwort nicht begünstigen würden. Wichtig ist auch, dass die Zellen nach 5 Tagen zum Experimentieren verwendet werden, da eine längere Inkubation zu einem übermäßigen Zellwachstum führen würde, was zu einer kompakten Epithelschicht führen würde. Da dem vorliegenden Design ein mikrofluidisches System fehlt und es sich um ein statisches Darmzellmodell handelt, ist es außerdem sehr wichtig, dass das Medium jeden Tag gewechselt wird, um die Freisetzung von Molekülen und das Wachstum und die Stimulation von Zellen zu begünstigen. In Bezug auf das Fixierungsprotokoll ist die Clearing-Phase kritisch, und da die Zeit, die benötigt wird, bis das Gewebe in Paraffin transparent wird, variieren kann, muss jedes Darmschleimhautsystem während dieser Phase genau beobachtet werden. Während des gesamten Fixierungsvorgangs muss beim Umgang mit diesen Modellen Vorsicht walten gelassen werden, um sie nicht zu beschädigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Modelle unter strikter Einhaltung der kritischen Punkte bei der Konstruktion und Fixierung der grundlegenden 3D-Darmäquivalente zahlreiche Gewebeschnitte für die Bewertung mehrerer Parameter in pharmazeutischen Screening- und Toxizitätsstudien bereitstellen können.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Dank an die Umberto Veronesi Stiftung für ein Stipendium zur Unterstützung der Arbeit von Forschern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
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