Summary
Her beskriver vi konstruktionen af et grundlæggende tredimensionelt (3D) tarmcellelinjemodelsystem og en paraffinindlejringsprotokol til lysmikroskopisk evaluering af faste tarmækvivalenter. Farvning af udvalgte proteiner tillader analyse af flere visuelle parametre fra et enkelt eksperiment til potentiel anvendelse i prækliniske lægemiddelscreeningsundersøgelser.
Abstract
Der har været en stigning i brugen af in vivo - og in vitro-tarmmodeller til undersøgelse af patofysiologien af inflammatoriske tarmsygdomme, til farmakologisk screening af potentielt gavnlige stoffer og til toksicitetsundersøgelser af potentielt skadelige levnedsmiddelkomponenter. Af relevans er der en aktuel efterspørgsel efter udvikling af cellebaserede in vitro-modeller til erstatning af dyremodeller. Her præsenteres en protokol for en grundlæggende, "sundt væv" tredimensionel (3D) tarmækvivalent model ved hjælp af cellelinjer med den dobbelte fordel at give både eksperimentel enkelhed (standardiseret og let gentageligt system) og fysiologisk kompleksitet (Caco-2 enterocytter med en understøttende immunkomponent af U937 monocytter og L929 fibroblaster). Protokollen inkluderer også paraffinindlejring til lysmikroskopisk evaluering af faste tarmækvivalenter, hvilket giver fordelen ved at analysere flere visuelle parametre fra et enkelt eksperiment. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvede sektioner, der viser Caco-2 søjleformede celler, der danner et tæt og regelmæssigt monolag i kontrolbehandlinger, bruges til at verificere effektiviteten af modellen som et eksperimentelt system. Ved anvendelse af gluten som en proinflammatorisk fødevarekomponent inkluderer parametre analyseret fra sektioner reduceret monolagtykkelse samt forstyrrelse og løsrivelse fra den underliggende matrix (H&E), nedsat tæt forbindelsesproteinekspression som vist ved okklusionfarvning (kvantificerbar statistisk) og immunaktivering af migrerende U937-celler som det fremgår af klyngen af differentiering 14 (CD14) farvning og CD11b-relateret differentiering i makrofager. Som vist ved at bruge lipopolysaccharid til at simulere tarmbetændelse, er yderligere parametre, der kan måles, øget slimfarvning og cytokinekspression (såsom midkin), der kan ekstraheres fra mediet før fiksering. Den grundlæggende tredimensionelle (3D) tarmslimhindemodel og faste sektioner kan anbefales til inflammatoriske status- og barriereintegritetsundersøgelser med mulighed for at analysere flere visuelle kvantificerbare parametre.
Introduction
Den intestinale epitelbarriere, en encelle tyk indre foring, der indeholder forskellige typer epitelceller, udgør den første fysiske defensive barriere eller grænseflade mellem ydersiden og det indre miljø i kroppen 1,2. Enterocytter af kolonnetype udgør den mest rigelige type epitelceller. Disse er ansvarlige for at opretholde epitelbarriereintegritet gennem interaktioner mellem flere barrierekomponenter, herunder stramme kryds (TJ'er), der spiller en væsentlig rolle i barrierestramning 1,3. TJ-strukturen består af intracellulære plakproteiner, såsom zonula occludens (ZO) og cingulin, der samarbejder med transmembranproteiner, herunder occludiner, claudiner og junctional adhæsion molekyler (JAM'er), der danner lynlåslignende struktur, der tæt forbinder nabocellerne 3,4. De transmembranproteiner regulerer den passive paracellulære diffusion af små forbindelser og udelukker giftige store molekyler.
Potentielt giftige fødevareforbindelser og fødevareforurenende stoffer stimulerer inflammatorisk cytokinproduktion, der forstyrrer epitelpermeabiliteten, aktiverer immunceller og forårsager kronisk tarmvævsbetændelse 5,6,7. I modsætning hertil er forskellige antioxidant- og antiinflammatoriske fytokemikalier blevet rapporteret at reducere inflammatorisk cytokinekspression og forbedre tarm-TJ-barriereintegriteten gennem genoprettelse af TJ-proteinekspression og samling 4,6,8. Derfor har reguleringen af epitelbarrierens integritet af både gavnlige og skadelige forbindelser set en stigning i brugen af både in vivo- og in vitro-modeller, der sigter mod at efterligne tarmbarrieren til farmaceutisk screening og toksicitetsundersøgelser. Dette er især relevant i betragtning af den stigende interesse for at forstå patofysiologien af tarmsygdomme (IBD), nekrotiserende enterocolitis og kræft, som kan simuleres i eksperimentelle modeller 8,9,10.
Der har været efterspørgsel efter udvikling af cellebaserede in vitro-modeller for at nå målet om "3R'erne" i dyreforsøg. Disse omfatter erstatningsalternativer til brugen af dyr, reduktion i antallet af anvendte dyr og forfining i vedtagelsen af metoder, der lindrer nød 11,12,13. Desuden er de underliggende molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismer mellem humane og murinmodeller (gnavere er den mest anvendte art) karakteristiske, hvilket fører til kontroverser om effektiviteten af murine modeller som prædiktorer i humane reaktioner12,13. Talrige fordele ved in vitro humane cellelinjemodeller omfatter målbegrænsede eksperimenter, direkte observation og kontinuerlig analyse13.
Enkeltcelle-type monolag i todimensionelle (2D) kulturer har fungeret som kraftfulde modeller. Disse kan imidlertid ikke præcist reproducere den fysiologiske kompleksitet af humant væv 8,13,14. Som følge heraf udvikles 3D-kultursystemer med stadigt stigende forbedringer for at rekapitulere den fysiologiske kompleksitet af både sundt og sygt tarmvæv som næste generations risikovurderingsværktøjskasser13,14. Disse modeller inkluderer 3D Transwell-stilladser med forskellige cellelinjer, organoidkulturer og mikrofluidiske enheder (tarm-på-chip) ved hjælp af både cellelinjer og organoider (afledt af både sunde og syge væv)8,13,14.
3D "sundt væv" intestinal ækvivalent protokol præsenteret i denne undersøgelse var baseret på at finde en balance mellem fysiologisk kompleksitet og eksperimentel enkelhed13. Modellen er repræsentativ for et 3D Transwell-stillads, der består af tre cellelinjer (enterocytter [guldstandarden colon adenocarcinoma Caco-2-linje] med en understøttende immunkomponent [U937-monocytter og L929-fibroblaster]), der udgør et standardiseret og let gentageligt system, der kan anvendes til foreløbig screening af diætmolekyler af interesse for intestinal epitelbarriereintegritet og immunrespons. Protokollen inkluderer paraffinindlejring til lysmikroskopisk evaluering af epitelbarriereintegritet ved anvendelse af faste tarmækvivalenter. Fordelen ved den nuværende fremgangsmåde er, at adskillige sektioner af de indlejrede væv kan gøres til farvning for flere parametre fra et enkelt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af den grundlæggende 3D rekonstruerede tarmslimhindemodel
BEMÆRK: Hele proceduren skal udføres i en steril laminar strømningshætte. Alle trin i proceduren, der involverer anvendelse af celleinkubatoren, betyder, at kulturer inkuberes ved 37 °C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 (medmindre andet er angivet i protokollen).
- Forudgående forberedelse af cellelinjerne anvendt i tarmmodelsystemet
- Seed L929 musefibroblastceller i en koncentration på 5 x 105 i 5 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) indeholdende 2 mM L-glutamin, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep) i en F25-kolbe og kultur det i en inkubator 4 dage før konstruktionen af tarmmodellerne. Efter 48 timer fjernes mediet ved hjælp af en pipette. Derefter tilsættes frisk medium (5 ml), og inkuber cellerne yderligere i 48 timer.
BEMÆRK: Cellerne skal være 80% sammenflydende, før de bruges. - Frø Caco-2-celler (koncentration på 2 x 106) i 10 ml DMEM-medium (med 10% FBS og 1% Pen-Strep) i en F75-cellekolbe og kultur det i en inkubator 4 dage før konstruktionen af tarmslimhindemodellen. Efter 48 timer ændres substratet som beskrevet i trin 1.1.1, og substratet inkuberes yderligere i 48 timer til et sammenløb på 80 %.
BEMÆRK: Cellerne skal være i en aktiv prolifererende fase: ikke for sparsom eller for sammenflydende. En 50-60% sammenløb anbefales. Cellerne må ikke sås dagen før modellen, da dette kunne bremse cellernes proliferative kapacitet, som så ikke ville slå perfekt rod i den rekonstruerede 3D-model. - Tilsæt U937-celler, der vokser i suspension (koncentration på 1 x 106) til 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (indeholdende 2 mM L-glutamin, 1% natriumpyruvat, 10% FBS og 1% Pen-Strep) i en F75-cellekolbe 2 dage før modelopsætningen, og læg dem i en inkubator i 48 timer.
- Seed L929 musefibroblastceller i en koncentration på 5 x 105 i 5 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) indeholdende 2 mM L-glutamin, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep) i en F25-kolbe og kultur det i en inkubator 4 dage før konstruktionen af tarmmodellerne. Efter 48 timer fjernes mediet ved hjælp af en pipette. Derefter tilsættes frisk medium (5 ml), og inkuber cellerne yderligere i 48 timer.
- Fremstilling af Transwells kokulturpladeindsatser
- Vælg en plade med 24 brønde, der indeholder indsatser med 0,4 μm filtre.
BEMÆRK: 0,4 μm filteret er et standardvalg i lægemiddeltransportstudier. Filterstørrelserne 3 μm og 8 μm anbefales ikke for at forhindre eventuelle tab af de kollagenindlejrede celler. - Brug en pipette til at hydrere Transwell-filtrene (herefter kaldet membranindsatser) med 500 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) under og over filterindsatsen.
- Luk multibrøndpladen og læg den i en inkubator i mindst 2 timer.
BEMÆRK: Membranindsatserne kan forblive i HBSS i op til 24 timer. Denne operation kan udføres dagen før konstruktionen af modellen. Det er vigtigt, at membranindsatserne er helt hydreret, og at filteret ikke tørrer ud, da dette kan gøre det sværere for prøven at klæbe ordentligt. - Fjern pladerne fra inkubatoren efter 2 timer (eller 24 timer). Hbss suges forsigtigt ovenfra og under membranindsatserne ved hjælp af en pipette og lad den tørre i 10 minutter.
- Vælg en plade med 24 brønde, der indeholder indsatser med 0,4 μm filtre.
- Fremstilling af cellefri kollagen lamina propria i det grundlæggende 3D tarmmodelsystem (DAG 1)
- Forbered en cellefri kollagenopløsning i et 50 ml sterilt rør på is, der indeholder følgende komponenter i DMEM: 10% føtalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin, 1% natriumbicarbonat og 1,35 mg / ml type 1 rottehalekollagen.
BEMÆRK: Alle disse komponenter skal opbevares på is og tilsættes DMEM med afkølede pipettespidser. Type 1 rottehalekollagen skal tilsættes sidst, da dette polymeriserer med stigende temperatur og pH. Mængden af cellefri kollagenopløsning, der fremstilles, afhænger af antallet af intestinale ækvivalenter, der kræves. - Der tilsættes 250 μL af opløsningen til hver indlægsplade (over membranfilteret) for det valgte antal tarmækvivalenter, og låget anbringes over multibrøndpladen. Lad kollagenopløsningen polymerisere ved stuetemperatur (RT) under laminar flowhætten.
BEMÆRK: Bortset fra overgangen til en mere solid fase er polymerisering også tydelig ved en ændring i farve fra gul til pink. Polymerisering er normalt afsluttet inden for 10-15 minutter.
- Forbered en cellefri kollagenopløsning i et 50 ml sterilt rør på is, der indeholder følgende komponenter i DMEM: 10% føtalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin, 1% natriumbicarbonat og 1,35 mg / ml type 1 rottehalekollagen.
- Forberedelse, celletælling og tilsætning af fibroblastceller (L929) og monocytceller (U937) til modelsystemet (DAG 1)
- L929-cellekulturen (trin 1.1.1) fjernes fra inkubatoren. Brug en vakuumpumpe til at aspirere mediet, erstatte det med 5 ml sterilt fosfatbuffersaltvand (PBS; uden Ca og Mg) og skylle cellerne.
- Opsug PBS ved hjælp af en vakuumpumpe. Tilsæt 2 ml af en forberedt trypsin-EDTA-opløsning (0,05% trypsin og 0,02% EDTA i PBS) og læg i en inkubator i 3-5 minutter.
- Brug et omvendt mikroskop (for eksempel en Eclipse Ts2, Nikon) til at fastslå, om cellerne løsner sig fra vedhæftningsoverfladen. Hvis dette sker, tilsættes straks 2 ml DMEM (indeholdende 10% FBS) for at blokere trypsinreaktionen og skylle cellerne.
- Overfør celleopløsningen til et sterilt 15 ml glas og centrifuger ved 645 x g i 5 min. Opsug supernatanten ved hjælp af en vakuumpumpe.
BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre pelleten. Effekten af DMEM blev testet på L929- og U937-cellerne og viste sig ikke at have negative virkninger på væksten. - Tilsæt 1 ml DMEM til pelleten og suspender cellerne.
BEMÆRK: Cellerne skal suspenderes homogent i opløsningen. - Fjern 20 μL af cellerne i DMEM og tilsæt 20 μL Trypan blå opløsning. Fjern 20 μL af blandingen, og evaluer celletætheden mikroskopisk ved hjælp af et celletællekammer.
- U937-cellekulturen (trin 1.1.3) fjernes fra inkubatoren. Centrifuger celleopløsningen ved 645 x g i 5 min. Opsug supernatanten ved hjælp af en vakuumpumpe for at undgå at forstyrre pelletsen.
- Suspender cellerne i 1 ml RPMI. Som med L929-cellerne skal du sørge for, at cellerne er homogent suspenderet i opløsningen.
- På samme måde bestemmes celletætheden som rapporteret i trin 1.4.6.
- Der fremstilles en kollagenopløsning som beskrevet i trin 1.3.1.
BEMÆRK: Mængden af opløsning, der skal fremstilles, skal tage højde for 450 μL for hvert skær (eller model). - Der fremstilles en opløsning af DMEM, som skal indeholde et antal på henholdsvis 50.000 L929-celler og 15.000 U937-celler i et volumen på 50 μL for hver tarmækvivalent model, der skal konstrueres.
BEMÆRK: Antallet af celler er en kritisk faktor. For mange af begge celletyper ville resultere i en lamina propria overdrevent fuld af celler, der ikke ville være tilstrækkeligt organiseret. Et ringere antal fibroblaster (som genererer kollagen) ville resultere i en mindre kompakt lamina propria, mens for få monocytter ville hæmme immunresponset på stimuli. Forudsat at det korrekte antal celler er til stede inden for hver 50 μL alikvote - kan der fremstilles et samlet volumen på 600 μL for de 12 filterindsatser, der findes i hver 24 brøndplade. - Hver 50 μL delprøve indeholdende cellerne tilsættes til 450 μL kollagenopløsning i trin 1.4.10. Bland grundigt.
- Overlejr den præcoatede cellefri kollagen lamina propria med 500 μL af den kollagenholdige celleopløsning til hver model.
BEMÆRK: Det er vigtigt hurtigt at tilføje volumenerne til hvert indlæg, og som sådan anbefales det at begrænse antallet af rekonstruerede tarmslimhindemodeller til 12 eller færre ad gangen. - Luk pladen og læg den i en inkubator i 2 timer for at lade opløsningen hærde.
- Forberedelse, celletælling og tilsætning af epitel-Caco-2 celler til tarmmodellen (DAG 1)
- Caco-2-cellekulturen (trin 1.1.2) fjernes fra inkubatoren. Procedurerne gentages fra trin 1.4.1 med 10 ml PBS til indledende skylning. Derefter tilsættes 5 ml af en forberedt trypsin-EDTA-opløsning (0,05% trypsin og 0,02% EDTA i Ca- og Mg-fri PBS) og anbringes i en inkubator i 5-8 min.
- Gentag trin 1.4.3 (men ved hjælp af 5 ml DMEM for at blokere trypsinreaktionen) til 1.4.6 for at tælle cellerne ved hjælp af celletællingskammeret.
- Forbered en opløsning af DMEM til at indeholde et antal på 150.000 Caco-2-celler i 50 μL.
BEMÆRK: Antallet af anvendte celler er et kritisk punkt. Overskridelse af 150.000 celler kan resultere i et kompakt uorganiseret epitellag, mens cellerne med for lidt (mindre end 100.000) kæmper for at vokse og ikke dækker kældermembranen tilstrækkeligt, hvilket skaber et diskontinuerligt tarmepitellag. Sørg for, at cellerne er effektivt suspenderet. Spidsen af en 200 μL pipette kan bruges til at sikre en homogen fordeling. Da 12 modeller kan konstrueres på et givet tidspunkt, kan der fremstilles en 600 μL celleopløsning. - Efter de 2 timer, der kræves i trin 1.4.14, tilsættes 50 μL Caco-2-celler suspenderet i DMEM til midten af hver kældermembran. Luk låget på multibrøndpladen.
- Inkuber under den sterile laminære strømningshætte i 10 min. Overfør derefter til inkubatoren i 30 minutter.
- Forbered en DMEM-opløsning indeholdende 10% FBS og 1% Pen/Strep.
BEMÆRK: Forbered en tilstrækkelig opløsning til at bruge en volumen på 1 ml pr. model. - Der tilsættes 500 μL af substratet over den rekonstruerede model og 500 μL under filteret.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når du tilføjer mediet over filteret for at undgå at løsne eller stresse cellerne. - Luk multibrøndpladesystemet og læg det i inkubatoren.
- Modelforberedelse/-dannelse og -anvendelse (DAG 2 til DAG 6)
- DAG 2: Fjern forsigtigt opløsningen både over den rekonstruerede model og under filteret ved hjælp af en pipette. Udskift med frisk 500 μL frisk DMEM (10% FBS og 1% Pen/Strep) over og under filteret.
- DAG 3: Gentag som ovenfor i trin 1.6.1.
- DAG 4: Gentag som ovenfor i trin 1.6.1.
BEMÆRK: Denne tarmmodel er en statisk cellulær model; For at favorisere frigivelsen af molekyler og vækst og stimulering af celler er det derfor meget vigtigt, at mediet ændres hver dag. - DAG 5: På dette tidspunkt er modellen fuldt udformet/udviklet. Brug disse modeller til videre undersøgelser.
BEMÆRK: Det bedste tidspunkt at bruge modellen er på 5 dage. Selvom cellerne kan opretholdes i en inkubator i længere perioder, jo mere tid der går, jo større er sandsynligheden for, at epitelcellerne kan vokse på en ukontrolleret måde, hvilket resulterer i et uorganiseret og kompakt lag, der er vanskeligt at bruge. - Efter 5 dage inkuberes modellerne med enten giftige (gluten eller lipopolysaccharid [LPS]) eller gavnlige komponenter (polyphenoler) af interesse. Tilføj disse til den øverste del af den rekonstruerede model, der er suspenderet i DMEM-mediet.
BEMÆRK: Den passende koncentration af hver komponent af interesse skal beregnes og suspenderes i et DMEM-medium. Ikke-behandlede kontroller, der kun indeholder DMEM-medium, skal opstilles til sammenligning med forsøgsmodellerne. - Inkuber kontrol- og eksperimentelle modeller i 24 timer i en inkubator.
- DAG 6: Fjern mediet over og under filteret med en pipette.
BEMÆRK: Mediet kan opbevares til efterfølgende enzymbundet immunosorbentassay (ELISA)-type test for at måle frigivelsen af inflammatoriske cytokiner. Til dette formål skal substratet tilsættes til sterile hætteglas og opbevares ved -20 ° C til yderligere analyse.
2. Paraffinindlejring af de rekonstruerede tarmslimhindemodeller
BEMÆRK: Hele proceduren skal udføres under en kemisk damphætte. Hvert trin og respektive tidstildeling skal overholdes nøje. Af denne grund er det vigtigt at have alle reagenser forberedt på forhånd.
- Indstil paraffinmaskinen til 58 °C, så den er klar til brug.
- Overfør membranindsatserne til rene brønde ved hjælp af en tang i en steril plade med 24 brønde.
- Der tilsættes 500 μL 37% bufret formalin i PBS over filteret og 1 ml under filteret. Luk låget, og lad det stå under kemikaliedamphætten i 2 timer ved RT.
BEMÆRK: Som et alternativ kan 4% bufret formalin anvendes ved RT i 1 time. - Fjern formalinet og tilsæt HBSS-opløsning både over og under filteret. Fjern derefter HBSS.
- Fjern lamina propria fra membranindsatsen.
BEMÆRK: Cellerne i tarmslimhinden løsner sig normalt meget let fra membranindsatsen, da de ikke er fastgjort til sidstnævnte. Derudover forbliver de to prøverum (apikale og basale) fastgjort og bevarer 3D-strukturen. Hvis de af en eller anden grund ikke let løsnes, vil det være vigtigt at bruge et sterilt engangsskalpelblad til at fjerne tarmslimhinden fra membranindsatsen. Membranindsatsen kan skæres og dermed løsnes fra plasten. Pas på aldrig at røre prøven med skalpellen. Motivet for at fjerne membranindsatsen fra de kollagenindlejrede celler er, at dette filter kan løsne sig i de efterfølgende fikserings- eller paraffinindlejringsfaser, hvilket gør sammenligninger mellem tarmslimhindemodeller uforholdsmæssige. Desuden har membranindsatserne i den indlejrede sektion en anden konsistens, som kan forstyrre sektioneringen. - Anbring de 100 ml bægerglas under den kemiske damphætte, hver korrekt mærket til at omfatte et rekonstrueret tarmslimhindemodelsystem, der undersøges. Der tilsættes 25 ml 35% ETOH til hvert bægerglas, og derefter tilsættes den rekonstruerede tarmslimhinde. Inkuber i 10 min.
- Udskift 35% ethanol med 25 ml 50% ethanol og inkuber i 10 min.
- Udskift 50% ethanol med 25 ml 70% ethanol og inkuber i 10 min.
- Udskift 70% ethanol med 25 ml 80% ethanol og inkuber i 10 min.
- Udskift 80% ethanol med 25 ml 95% ethanol og inkuber i 10 min.
- Udskift 95% ethanol med 25 ml 100% ethanol og inkuber i 10 min.
- Udskift 100% ethanol med en anden 25 ml ændring af 100% ethanol og inkuber i 10 min.
- Anbring 100 ml bægerglas under stinkhætten, hver korrekt mærket til at omfatte en model, der undersøges. Tilsæt 50 ml xylen eller et histologisk clearingmiddel i 10-20 min.
BEMÆRK: Histo-Clear (histologisk clearingmiddel) anbefales, da midlet forbedrer klarheden og livligheden af acidofile pletter. Clearingtiden kan variere fra en rekonstrueret tarmslimhindeprøve til en anden og skal kontrolleres for gennemsigtighed i udseende hvert 2.-3. minut. - Så snart prøverne er gennemsigtige, anbringes de i en metalvævskassetteholder, som derefter nedsænkes i flydende paraffin inde i den opvarmede maskine i 45 minutter.
- Skift paraffinen, og lad prøverne være inde i den opvarmede maskine i yderligere 45 minutter.
- Fjern vævskassetteholderen, og læg den på is for at køle af. Når de afkølede prøveblokke løsner sig fra metalholderen, kan disse afkøles yderligere ved stuetemperatur.
- Opbevar blokkene på RT.
BEMÆRK: Hvis målet er at forberede sektioner med det samme, kan blokkene placeres ved 4 ° C, så de afkøles godt, når de bruges. - Skær 4 μm sektioner ved hjælp af et mikrotom.
- Placer de skårne sektioner på dias og tør dem i en ovn ved 37 ° C i 24 timer.
- Lysbillederne er klar til brug. Opbevar dem ved RT, indtil de udfører enten H&E histologisk farvning eller immunhistokemisk reaktionsfarvning (antigen-antistoftype).
- Til immunhistokemisk farvning skal du vælge antistoffer af interesse (enten til undersøgelse af TJ-proteiner såsom occludin eller til monocytaktivering, migration og differentiering) og detektere ekspression (via farvning) ved hjælp af kommercielle sæt.
- På samme måde måles slim ved hjælp af Alcian blå og periodisk syre-Schiff (PAS) farvningssæt.
- Kvantificer de farvede TJ-proteiner af interesse, såsom occludin, ved at beregne procentdelen af positive pixels på mikrografier taget fra mikroskopet.
- Analysér billeder af cellerne ved hjælp af billedanalysesoftware (f.eks. ImageJ2-software [Wayne Rasband, version 2.9.0/1.53t]).
- For at udføre analysen af pixels skal du behandle de digitale billeder til 300 pixels / tommer og konvertere dem til 8 bit. Behandl derefter de binære billeder ved hjælp af Color Deconvolution-plugin for at analysere farvningen af proteinet af interesse, i dette tilfælde den permanente røde farvning af okklusion.
- Gem det valgte billede som en tiff, og underkast det en "oprydningsprocedure" for at fjerne artefakter med en grafikeditor (f.eks. Adobe PhotoshopCC [version 20.0.4]).
- Derefter måles alle interesseområder med applikationen Analyze Particle of ImageJ2, og rapporter dataene som antallet af pixels.
BEMÆRK: Hvert eksperiment skal udføres i tre eksemplarer med tre interne replikationsfelter analyseret for hver replikat. Til kvantificering af slim kan det samme princip for måling af pixels anvendes på billederne taget af henholdsvis lilla-magenta-farvede neutrale muciner og lyse blåfarvede sure slim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første vigtige aspekt er at bestemme acceptabiliteten af den grundlæggende 3D intestinale ækvivalente slimhinde til eksperimentelle formål. Dette udføres med den mest anvendte plet i histologi- og histopatologilaboratorier, nemlig hæmatoxylin (pletter nukleart materiale dyb blålilla farve) og eosin (pletter cytoplasmatisk materiale varierende nuancer af pink). H&E-farvningen udføres først på en ubehandlet kontrol, som dyrkes under samme forhold og tidsramme som de eksperimentelle behandlinger. Fra visualisering af cellernes mønster, form og struktur bestemmes succesen af dette tarmcellemodelsystem ved, at Caco-2-cellerne danner et tæt og regelmæssigt monolag over den ekstracellulære matrix (ECM) rige lamina propria efter 5 dage (figur 1A). Eksempler på modelsystemer, der ville blive anset for uacceptable til yderligere analyser, omfatter dem, der viser overdreven vækst med uorganiserede epitellag, som vist efter 10 dage (figur 1B). Et yderligere eksempel er et epitellag, der er for tykt og uorganiseret (figur 1C), forårsaget enten af såning af overskydende Caco-2-celler eller en overdreven inkubation. Misdannelse (figur 1D), der enten kan tilskrives såceller, der ikke var i en aktiv proliferationsfase, eller problemer med fremstilling af lamina propria eller under fiksering med paraffin (celler blev løsrevet/ødelagt), er også et eksempel på en uacceptabel rekonstrueret tarmslimhinde. Tilsvarende uacceptabelt er manglen på dannelse af epitellag (figur 1E), hvilket tyder på såning af for få Caco-2-celler eller problemer med fremstilling af lamina propria. Ved hjælp af acceptable 3D-tarmækvivalenter, hvorfra flere sektioner kan genereres, kan forskellige parametre derefter undersøges fra et enkelt eksperiment.
Af de forskellige parametre, der kan analyseres, kan barriereintegritet som reaktion på proinflammatoriske induktorer visualiseres, og TJ-proteiner farves og kvantificeres og sammenlignes med ubehandlede kontrolmodelsystemer. Her demonstrerer vi den proinflammatoriske effekt af 40 μg/ml totalt hvedeprotein fra en hård hvedekilde med et højt glutenindhold7, på både cellulær integritet såvel som TJ-okklusionproteinindhold (figur 2A). Ved hjælp af H&E histologisk farvning viser kontrolmodelsystemet, at Caco-2 søjleformede celler danner et tæt og regelmæssigt monolag. I modsætning hertil viste effekten af den glutenholdige proteinprøve sig at forårsage forstyrrelse af monolaget med mere uspecifik eosinfarvning (figur 2A). Desuden kan tykkelsen af epitellaget måles og viser sig at være signifikant reduceret efter eksponering for proinflammatorisk gluten (figur 2A, B). Ved hjælp af et antistof mod occludin (konjugeret til rød kromogenfarvning) kunne okklusionprotein visualiseres og kvantificeres. Signifikant højere occludinproteinindhold var tydeligt i kontrolgruppen sammenlignet med tarmslimhinden udsat for glutenprotein i 24 timer (figur 2A, C).
De intestinale ækvivalenter bestående af en immunkomponent (repræsenteret af U937-monocytter) er også ideelle til at undersøge virkningerne af proinflammatoriske induktorer på monocytaktivering, migration og differentiering i makrofager. Endnu en gang var proinflammatorisk aktivering af U937-monocytter i lamina propria ved hjælp af 40 μg / ml total hvedeprotein ekstraheret fra en hvedekilde med et højt glutenindhold tydelig ved hurtig rød koblet CD14-farvning (figur 3A). Aktivering detekteres fra den øgede ekspression af dette rødfarvede membranglycoprotein på monocytter og makrofager. Forhøjet CD14-protein blev også påvist med fluoresceinisothiocyanat (FITC), som pletter grønt under immunfluorescens. Migration blev påvist ved tilstedeværelsen af aktiverede U937-celler tæt på Caco-2-monolaget. Hvor monolaget var bristet, viste U937-cellerne sig at være kommet ind i Caco-2-cellemonolaget (figur 3A). Der var ingen tegn på CD14-farvet monocytmigration i kontrolgruppen (figur 3A). Differentieringen af monocytter i makrofager kan identificeres ud fra markøren CD11b. Ingen CD11b-farvning var tydelig i kontrolgruppen med hverken rødt kromogen eller FITC (figur 3B). I stedet blev der i vævene udsat for gluten observeret CD11b-makrofager både i de ECM-rige lamina propria og inden for det bristede Caco-2-monolag (figur 3B).
Ved hjælp af LPS til at simulere tarmbetændelse viser vi her, at det også er muligt at bruge dette modelsystem til at undersøge sure mucin og mucopolysaccharider produceret af Caco-2-cellerne i henholdsvis den ubehandlede kontrol og LPS-behandlingen (figur 4A). Ved anvendelse af Alcian blå og PAS farvning farves surt slim lyseblåt, og neutrale muciner er henholdsvis farvet lilla-magenta. Omfanget af slimfarvning kan ligeledes kvantificeres og viser sig at være signifikant induceret under 1 ng/ml LPS-provokation (figur 4B). Desuden kan mediet fjernes før fiksering for at undersøge proinflammatorisk cytokinproduktion. Selvom adskillige udskillelsescytokiner kan måles, blev midkin (MDK) i dette særlige tilfælde valgt. MDK er en endogen inflammatorisk markør induceret af transkriptionsfaktoren, nuklear faktor kappa-lyskædeforstærker af aktiveret B-celle (NF-κB) vej, og er også forbundet med inflammatoriske sygdomme i tarmceller15. Under LPS-udfordringen induceres MDK signifikant sammenlignet med kontrollen (figur 5).
Figur 1: Ubehandlede kontrol 3D intestinale ækvivalenter. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af ubehandlede kontrol 3D intestinale ækvivalenter (Caco-2 /U937/L929 co-kulturer) i 24 timer som en verifikation af effektiviteten af den grundlæggende 3D tarmslimhindemodel til eksperimentelle formål. (A) En acceptabel eksperimentel model sammenlignes med uacceptable modeller, der viser overdreven (B) epitelvækst og uorganiserede lag efter 10 dage, (C) overdreven epiteltykkelse og uorganisering, (D) misdannelse og (E) intet epitelcellelag. Skalabjælken i hvert billede svarer til 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Behandlede 3D intestinale ækvivalenter. (A) Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning og okklusionekspression af 3D tarmækvivalenter (Caco-2 /U937/L929 co-kulturer) eksponeret i 24 timer til 40 μg/ml totalt protein fra en høj glutenholdig moderne hvedeblanding sammenlignet med kontrollen (CTRL). Skalabjælken i hvert billede svarer til 50 μm. (B) Kvantificering af Caco-2 celletykkelse og (C) okklusion-rød kromogenfarvning. Signifikante forskelle blev bestemt ved envejsvarians (ANOVA) og repræsenteret som *** 0,0001< P < 0,001. De sorte prikker repræsenterer antallet af replikater. Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Truzzi et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: CD14 og CD11B farvning. CD14-farvning af U937-monocytter og CD11B U937-differentierede makrofager i 3D-tarmækvivalenter (Caco-2/U937/L929-cokulturer) udsat for intet tilsat protein (kontrol [CTRL]) eller 40 μg/ml totalprotein fra en høj glutenholdig moderne hvedeblanding efter en periode på 24 timer. Til CD14- og CD11b-farvning blev hurtig rød brugt som kromogen, og kerner blev modfarvet med eosin. Skalabjælken i hvert billede svarer til 20 μm. CD14- og CD11b-farvning med fluoresceinisothiocyanat (grøn) blev også vist under immunfluorescens. Kernerne blev modfarvet med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Skalabjælken i hvert billede er lig med 50 μm. Pile angiver tilstedeværelsen af monocytter (CD14-positive celler) og makrofager (CD11b-positive celler). Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Truzzi et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning og slimekspression fra Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff Stain (PAS) farvning. (A) Caco-2-celler i basiske 3D-tarmækvivalenter (Caco-2 /U937/L929 co-kulturer) efter 24 timer i de ubehandlede ækvivalente og rekonstruerede tarmslimhindemodelsystemer udsat for 1 ng/ml lipopolysaccharid. Skalabjælken i hvert billede er lig med 50 μm. (B) Kvantificering af slimekspression blev bestemt ved envejsvarians (ANOVA) med signifikans rapporteret som **** P < 0,0001. De sorte prikker repræsenterer antallet af replikater. Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Truzzi et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Midkine-udtryk. Midkinekspression i mediet af 3D intestinale ækvivalenter (Caco-2 /U937/L929 co-kulturer) efter 24 timer i de ubehandlede kontrol- (CTRL) og tarmslimhindemodelsystemer udsat for 1ng/ml lipopolysaccharid. Kvantificering af midkinekspression blev bestemt ved envejsvarians (ANOVA) med signifikans rapporteret som **** P < 0,0001. Denne figur er tilpasset med tilladelse fra Truzzi et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Skematisk diagram, der repræsenterer konstruktion og eksperimentel anvendelse af tarmækvivalenter samt fiksering og mikroskopiske analyser af parametre fra vævssektioner. Det skematiske diagram opsummerer konstruktionen af tarmækvivalenterne og mulige eksperimentelle behandlinger, der kan administreres til disse modeller. Dannelsen af flere vævssektioner fra et enkelt eksperiment gør det muligt at analysere adskillige strukturelle og immune aspekter af tarmslimhinden, som illustreret i figur 1, figur 2, figur 3 og figur 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det grundlæggende rekonstruerede tarmslimhindemodelsystem, der præsenteres her (figur 6), kombinerer fysiologisk kompleksitet (mere fysiologisk relevante 3D-cellekulturer indeholdende et Caco-2-monolag med en ECM-rig lamina propria-støtte indeholdende fibroblaster og monocytter) med eksperimentel enkelhed (ved hjælp af kommercielle humane cellelinjer til fremstilling af standardiseret og let gentageligt system)13. Som sådan anses dette modelsystem for at være et egnet alternativ til murinmodeller, der har til formål at evaluere effekten af potentielle lægemidler/fødevarekomponenter på tarmbarriereintegriteten. I denne henseende underbygger tidligere artikler effektiviteten af den nuværende cellekulturmodel til test af både potentielt gavnlige forbindelser (plus dosisafhængighed) såvel som skadelige fødevarekomponenter 7,16,17. Desuden kan LPS eller alternative proinflammatoriske reagenser (2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre eller dextransulfatnatrium) tilsættes til den nuværende tarmslimhindemodel for at simulere IBD-symptomer. Dermed er det potentielt muligt at studere tarmsygdommes ætiologi fra et strukturelt aspekt såvel som fra ekspressionen af cytokiner, såsom proinflammatorisk MDK, som er en markør for IBD15. Dette grundlæggende modelsystem har også et eventuelt lægemiddelscreeningspotentiale for den bredere befolkning. Selvom modelsystemet er fysiologisk mere komplekst end 2D-modeller13,14, omfatter begrænsningerne i reproduktion af kompleks menneskelig fysiologi fraværet af både et mikrofluidisk system (fluidisk perfusion af en kontinuerlig tilførsel af næringsstoffer og fjernelse af affaldsprodukter samt mekaniske stimuli)8,14 og mikrobiomet (evaluering af værtsmikrobiominteraktioner i tarmsygdomme)8, 14.
Fordelen ved at anvende den nuværende grundlæggende 3D-tarmslimhindemodel i kombination med paraffinindlejring til lysmikroskopisk evaluering af epitelbarriereintegritet er, at flere vævssektioner kan fremstilles fra et enkelt eksperiment, hvilket muliggør analyse af adskillige parametre. Transepitelial elektrisk modstand (TEER)3 er en almindeligt anvendt metode til vurdering af tarmbarriereintegritet og er blevet anvendt i forbindelse med makromolekylære permeabilitetsundersøgelser 3,18 samt bredt rapporterede undersøgelser af Western blot-evaluering af TJ-proteinekspression. Western blot-evaluering giver kvantitativ indsigt i overordnede ændringer i proteinekspression, og TEER fungerer som et kvantitativt mål for barriereintegritet. I stedet giver mikroskopisk evaluering et værdifuldt værktøj til kvalitativ visualisering og vurdering af lokale proteinændringer og interaktioner18.
Mikroskopisk evaluering af en model med en immunkomponent tillader visualisering af immunresponser, såsom differentiering af monocytter i makrofager og migration af aktiverede monocytter i ECM, som demonstreret her ved CD14 og CD11b farvning. Identifikation kan foretages via immunhistokemi og/eller immunfluorescensfarvning på individuelle vævssektioner, som det blev vist for CD14 og CD11b i figur 3. Immunhistokemi tillader strukturel visualisering af det rekonstruerede tarmslimhindevæv som helhed. Desuden er det muligt at identificere både kernerne og cytoplasmaet i celler. I modsætning hertil tillader konfokal immunofluorescens ikke, at vævet ses som en helhed (kun markørerne af interesse og DAPI-farvede kerner). Det giver dog et meget rent billede, hvor baggrundsfarven elimineres. Fordelen ved dette er, at det tillader større præcision i at bevise markørernes positivitet eller negativitet og som sådan beregningen af eventuelle forskelle i farveintensitet (for eksempel en markør, der udtrykkes mere i en celle end i en anden). Potentielt kan omfanget af migration af CD14-monocytterne fra lamina propria til Caco-2-monolaget også estimeres ud fra flere replikate billeder taget på forskellige tidspunkter. Ikke desto mindre var tegn på inflammation tydelig fra tilstedeværelsen af både CD14 og CD11b farvede celler.
Et interval på 20-40 μg total protein anvendes af de fleste laboratorier til western blotting19. Kvantificeringen af talrige gap junction-proteiner (occludin, claudin, zonulin og E-caderin) kan udføres ved henholdsvis immunohistokemisk og/eller fluorescerende farvning på individuelle vævssektioner, hvilket kræver signifikant mindre protein. Samtidig kan epitellagets integritet som reaktion på forbindelser fra det samme eksperiment også visualiseres ud fra mønsteret, formen og strukturen af celler med H&E-farvning.
Effekten af en grundlæggende 3D-rekonstrueret tarmslimhinde til brug ved farvning af slimproduktion, TJ-proteiner og proteiner produceret af immunresponser afhænger af at overvinde kritiske trin, især i opbygningen af modelsystemet og under vævsfiksering. Med hensyn til modelkonstruktion er det grundlæggende at bruge den korrekte sammenflugt og såning af det korrekte antal Caco-2-celler (angivet med noterne i protokollen). For mange celler eller en forkert sammenløb ville resultere i et tykt og uorganiseret epitellag. I stedet vil for få celler resultere i enten en reduceret eller manglende dannelse af epitellag. Lige så grundlæggende ved såning er den korrekte cellesammenløb og antallet af L929- og U937-celler i ECM samt den korrekte håndtering af kollagen under tilberedningen. Overskydende celler eller hurtig polymerisering af kollagen ville resultere i en kompakt og misdannet ECM, hvilket igen påvirker strukturen af epitelcellerne ovenfor. Tilsvarende ville for få kollagendannende L929-celler resultere i en forkert konsistens af ECM, mens for få U937-monocytter ikke ville favorisere et immunrespons. Det er også vigtigt, at celler bruges til eksperimentering efter 5 dage, da en langvarig inkubation ville resultere i overdreven cellevækst, hvilket resulterer i et kompakt epitellag. Da det nuværende design mangler et mikrofluidisk system og er repræsentativt for en statisk intestinal cellulær model, for at favorisere frigivelsen af molekyler og vækst og stimulering af celler, er det meget vigtigt, at mediet ændres hver dag. Med hensyn til fikseringsprotokollen er clearingfasen kritisk, og da den tid, der kræves for vævene at blive gennemsigtige i paraffin, kan variere, skal hvert tarmslimhindesystem observeres nøje i denne fase. Under hele fikseringsproceduren skal man være forsigtig med at håndtere disse modeller for at undgå at beskadige dem.
Konklusionen er, at forudsat at der betales streng overholdelse af de kritiske punkter i konstruktionen og fikseringen af de grundlæggende 3D-tarmækvivalenter, kan modellerne tilvejebringe adskillige vævssektioner til evaluering af flere parametre i farmaceutiske screenings- og toksicitetsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Tak til Umberto Veronesi Foundation for et stipendium, der støtter forskerarbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
