Summary
Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.
Abstract
Tem havido um aumento no uso de modelos intestinais in vivo e in vitro para estudar a fisiopatologia de doenças inflamatórias intestinais, para a triagem farmacológica de substâncias potencialmente benéficas e para estudos de toxicidade de componentes alimentares potencialmente nocivos. De relevância, existe uma demanda atual para o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em células para substituir modelos animais. Aqui, um protocolo para um modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de "tecido saudável" usando linhagens celulares é apresentado com o duplo benefício de fornecer simplicidade experimental (sistema padronizado e facilmente repetível) e complexidade fisiológica (enterócitos Caco-2 com um componente imune de suporte de monócitos U937 e fibroblastos L929). O protocolo também inclui a inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos, proporcionando assim a vantagem de analisar múltiplos parâmetros visuais de um único experimento. Cortes corados pela hematoxilina e eosina (H&E) mostrando as células colunares do Caco-2 formando uma monocamada apertada e regular nos tratamentos controle são usados para verificar a eficácia do modelo como sistema experimental. Usando glúten como um componente alimentar pró-inflamatório, os parâmetros analisados a partir de cortes incluem espessura reduzida da monocamada, bem como ruptura e desprendimento da matriz subjacente (H&E), diminuição da expressão de proteínas de junção apertada como mostrado a partir da coloração de ocludina (quantificável estatisticamente) e ativação imunológica de células U937 migratórias, como evidenciado a partir da coloração de cluster de diferenciação 14 (CD14) e diferenciação relacionada a CD11b em macrófagos. Como demonstrado pelo uso de lipopolissacarídeo para simular a inflamação intestinal, parâmetros adicionais que podem ser medidos são o aumento da coloração de muco e a expressão de citocinas (como midkine) que podem ser extraídas do meio antes da fixação. O modelo básico tridimensional (3D) da mucosa intestinal e cortes fixos podem ser recomendados para estudos do estado inflamatório e integridade da barreira, com a possibilidade de analisar múltiplos parâmetros visuais quantificáveis.
Introduction
A barreira epitelial intestinal, um revestimento interno de uma célula de espessura contendo diferentes tipos de células epiteliais, constitui a primeira barreira ou interface física defensiva entre o meio externo e o meio interno do corpo 1,2. Os enterócitos do tipo colunar constituem o tipo mais abundante de células epiteliais. Estes são responsáveis pela manutenção da integridade da barreira epitelial por meio de interações entre vários componentes da barreira, incluindo as tight junctions (TJs), desempenhando um papel significativo no aperto da barreira 1,3. A estrutura do TJ consiste em proteínas da placa intracelular, como zonula occludens (ZO) e cingulina, cooperando com proteínas transmembrana, incluindo oclusinas, claudinas e moléculas de adesão juncional (JAMs) que formam uma estrutura semelhante a um zíper ligando firmemente as células vizinhas 3,4. As proteínas transmembrana regulam a difusão paracelular passiva de pequenos compostos e excluem moléculas grandes tóxicas.
Compostos alimentares potencialmente tóxicos e contaminantes alimentares estimulam a produção de citocinas inflamatórias que interrompem a permeabilidade epitelial, ativando células imunes e causando inflamação crônica do tecido intestinal 5,6,7. Em contraste, vários fitoquímicos antioxidantes e anti-inflamatórios têm sido relatados para reduzir a expressão de citocinas inflamatórias e aumentar a integridade da barreira intestinal de TJ através da restauração da expressão e montagem da proteína TJ 4,6,8. Assim, a regulação da integridade da barreira epitelial por compostos benéficos e nocivos tem visto um aumento no uso de modelos in vivo e in vitro com o objetivo de mimetizar a barreira intestinal para triagem farmacêutica e estudos de toxicidade. Isso é particularmente relevante dado o crescente interesse na compreensão da fisiopatologia das doenças intestinais intestinais (DII), enterocolite necrosante e câncer, que podem ser simuladas em modelos experimentais8,9,10.
Tem havido uma demanda para o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em células, a fim de atingir o objetivo dos "3Rs" em testes com animais. Entre elas, alternativas de substituição ao uso de animais, redução do número de animais utilizados e refinamento na adoção de métodos que aliviem o sofrimento 11,12,13. Além disso, os mecanismos moleculares, celulares e fisiológicos subjacentes entre modelos humanos e murinos (sendo os roedores a espécie mais utilizada) são distintos, levando a controvérsias quanto à eficácia dos modelos murinos como preditores de respostas humanas12,13. Inúmeras vantagens dos modelos in vitro de linhagem celular humana incluem experimentação com restrição de alvo, observação direta e análise contínua13.
Monocamadas do tipo célula única em culturas bidimensionais (2D) têm servido como modelos poderosos. No entanto, estes não conseguem reproduzir com precisão a complexidade fisiológica dos tecidos humanos 8,13,14. Como resultado, sistemas de cultura 3D estão sendo desenvolvidos com melhorias cada vez maiores para recapitular a complexidade fisiológica de tecidos intestinais saudáveis e doentes como caixas de ferramentas de avaliação de risco de última geração13,14. Esses modelos incluem scaffolds 3D Transwell com diversas linhagens celulares, culturas organoides e dispositivos microfluídicos (intestino-sobre-chip) usando linhagens celulares e organoides (derivados de tecidos saudáveis e doentes)8,13,14.
O protocolo 3D de "tecido saudável" equivalente intestinal apresentado no presente estudo baseou-se no equilíbrio entre complexidade fisiológica e simplicidade experimental13. O modelo é representativo de um arcabouço Transwell 3D, composto por três linhagens celulares (enterócitos [linhagem Caco-2 do adenocarcinoma de cólon padrão-ouro] com componente imune de suporte [monócitos U937 e fibroblastos L929]), constituindo um sistema padronizado e facilmente repetível aplicável para a triagem preliminar de moléculas dietéticas de interesse na integridade da barreira epitelial intestinal e resposta imune. O protocolo inclui a inclusão em parafina para avaliação microscópica da luz da integridade da barreira epitelial usando equivalentes intestinais fixos. A vantagem da presente abordagem é que numerosos cortes dos tecidos embutidos podem ser feitos para corar para múltiplos parâmetros a partir de um único experimento.
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Protocol
1. Preparação do modelo básico de mucosa intestinal reconstruída em 3D
OBS: Todo o procedimento deve ser realizado em capela de fluxo laminar estéril. Todas as etapas do procedimento que envolvem o uso da incubadora de células significam que as culturas são incubadas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 (salvo indicação em contrário no protocolo).
- Preparo prévio das linhagens celulares utilizadas no sistema modelo intestinal
- Sementes de fibroblastos de camundongo L929 na concentração de 5 x 105 em 5 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 2 mM de L-glutamina, 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep) em frasco F25 e cultura em estufa 4 dias antes da construção dos modelos intestinais. Após 48 h, retire o meio com uma pipeta. Em seguida, adicione meio fresco (5 mL) e incube as células por 48 h.
NOTA: As células devem ser 80% confluentes antes de serem usadas. - Sementes de células Caco-2 (concentração de 2 x 10,6) em 10 mL de meio DMEM (com 10% de SFB e 1% de Pen-Strep) em frasco de células F75 e cultura em estufa 4 dias antes da construção do modelo de mucosa intestinal. Após 48 h, trocar o meio conforme descrito no passo 1.1.1 e incubar por 48 h até uma confluência de 80%.
NOTA: As células devem estar em uma fase de proliferação ativa: não muito esparsas nem muito confluentes. Recomenda-se uma confluência de 50-60%. As células não devem ser semeadas no dia anterior à confecção do modelo, pois isso poderia diminuir a capacidade proliferativa das células, que não se enraízaria perfeitamente no modelo 3D reconstruído. - Adicionar células U937 que crescem em suspensão (concentração de 1 x 106) a 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contendo 2 mM de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio, 10% de FBS e 1% de Pen-Strep) em um frasco de células F75 2 dias antes da instalação do modelo e colocar em uma incubadora por 48 h.
- Sementes de fibroblastos de camundongo L929 na concentração de 5 x 105 em 5 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 2 mM de L-glutamina, 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep) em frasco F25 e cultura em estufa 4 dias antes da construção dos modelos intestinais. Após 48 h, retire o meio com uma pipeta. Em seguida, adicione meio fresco (5 mL) e incube as células por 48 h.
- Preparação das pastilhas da placa de co-cultura Transwell
- Selecione uma placa de 24 poços contendo pastilhas com filtros de 0,4 μm.
NOTA: O filtro de 0,4 μm é uma escolha padrão em estudos de transporte de drogas. Os filtros de 3 μm e 8 μm não são recomendados para evitar possíveis perdas das células emblocadas em colágeno. - Usando uma pipeta, hidrate os filtros Transwell (doravante denominados insertos de membrana) com 500 μL de Solução Salgada Balanceada de Hanks (HBSS) abaixo e acima da inserção do filtro.
- Feche a placa de poço múltiplo e coloque-a em uma incubadora por um mínimo de 2 h.
NOTA: As inserções de membrana podem permanecer no HBSS por até 24 h. Essa operação pode ser realizada no dia anterior à construção do modelo. É importante que as inserções da membrana estejam completamente hidratadas e que o filtro não seque, pois isso pode dificultar a aderência adequada da amostra. - Retire as placas da incubadora após 2 h (ou 24 h). Aspirar cuidadosamente o HBSS de cima e abaixo das inserções de membrana usando uma pipeta e deixá-lo secar por 10 min.
- Selecione uma placa de 24 poços contendo pastilhas com filtros de 0,4 μm.
- Preparo da lâmina própria de colágeno livre de células do sistema modelo intestinal 3D básico (DIA 1)
- Preparar uma solução de colágeno livre de células em um tubo estéril de 50 mL sobre gelo contendo os seguintes componentes em DMEM: Soro Fetal Bovino (SFB) a 10%, L-glutamina a 200 mM, bicarbonato de sódio a 1% e colágeno de cauda de rato Tipo 1 a 1,35 mg/mL.
NOTA: Todos estes componentes devem ser mantidos no gelo e adicionados ao DMEM com ponteiras de pipeta resfriadas. O colágeno da cauda de rato tipo 1 deve ser adicionado por último, pois polimeriza com o aumento da temperatura e do pH. A quantidade de solução de colágeno livre de células preparada dependerá do número de equivalentes intestinais necessários. - Adicionar 250 μL da solução a cada inserção de placa (acima do filtro de membrana) para o número de equivalentes intestinais seleccionados e colocar a tampa sobre a placa de poço múltiplo. Permitir que a solução de colágeno se polimerize à temperatura ambiente (TR) sob a capela de fluxo laminar.
NOTA: Além da transição para uma fase mais sólida, a polimerização também é evidente a partir de uma mudança de cor de amarelo para rosa. A polimerização é geralmente concluída dentro de 10-15 min.
- Preparar uma solução de colágeno livre de células em um tubo estéril de 50 mL sobre gelo contendo os seguintes componentes em DMEM: Soro Fetal Bovino (SFB) a 10%, L-glutamina a 200 mM, bicarbonato de sódio a 1% e colágeno de cauda de rato Tipo 1 a 1,35 mg/mL.
- Preparação, contagem de células e adição de células de fibroblastos (L929) e monócitos (U937) ao sistema modelo (DIA 1)
- Remover a cultura de células L929 (passo 1.1.1) da incubadora. Usando uma bomba de vácuo, aspirar o meio, substituí-lo por 5 mL de solução salina tampão fosfato estéril (PBS; sem Ca e Mg) e enxaguar as células.
- Aspirar o PBS usando uma bomba de vácuo. Adicionar 2 mL de uma solução pré-preparada de tripsina-EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,02% em PBS) e colocar em incubadora por 3-5 min.
- Use um microscópio invertido (por exemplo, um Eclipse Ts2, Nikon) para estabelecer se as células estão se desprendendo da superfície de adesão. Se isso estiver ocorrendo, adicione imediatamente 2 mL de DMEM (contendo 10% de FBS) para bloquear a reação de tripsina e enxaguar as células.
- Transferir a solução celular para um tubo estéril de 15 mL e centrifugar a 645 x g por 5 min. Usando uma bomba de vácuo, aspirar o sobrenadante.
OBS: É necessário cuidado para não atrapalhar o pellet. O efeito do DMEM foi testado nas células L929 e U937 e não demonstrou ter efeitos adversos sobre o crescimento. - Adicionar 1 mL de DMEM ao pellet e suspender as células.
NOTA: As células devem ser homogeneamente suspensas na solução. - Remover 20 μL das células em DMEM e adicionar 20 μL de solução de azul de Trypan. Remover 20 μL da mistura e avaliar microscopicamente a densidade celular usando uma câmara de contagem de células.
- Remover a cultura de células U937 (passo 1.1.3) da incubadora. Centrifugar a solução da célula a 645 x g durante 5 minutos. Usando uma bomba de vácuo, aspirar o sobrenadante para evitar perturbar o pellet.
- Suspender as células em 1 mL de RPMI. Tal como acontece com as células L929, certifique-se de que as células estão homogeneamente suspensas na solução.
- Da mesma forma, estabelecer a densidade celular conforme relatado na etapa 1.4.6.
- Preparar uma solução de colagénio conforme descrito no passo 1.3.1.
NOTA: A quantidade de solução a ser feita deve levar em consideração 450 μL para cada pastilha (ou modelo). - Preparar uma solução de DMEM para conter uma contagem de 50.000 células L929 e 15.000 células U937, respectivamente, em um volume de 50 μL para cada modelo intestinal equivalente a ser construído.
Observação : o número de células é um fator crítico. Muitos de ambos os tipos celulares resultariam em uma lâmina própria excessivamente cheia de células que não seriam adequadamente organizadas. Um número inferior de fibroblastos (que geram colágeno) resultaria em uma lâmina própria menos compacta, enquanto poucos monócitos impediriam a resposta imune aos estímulos. Desde que a contagem correta de células esteja presente dentro de cada alíquota de 50 μL - um volume total de 600 μL pode ser preparado para as 12 pastilhas de filtro presentes em cada placa de 24 poços. - Adicionar cada alíquota de 50 μL contendo as células a 450 μL de solução de colagénio no passo 1.4.10. Homogeneizar.
- Sobrepor a lâmina própria de colágeno livre de células pré-revestida com 500 μL da solução celular contendo colágeno para cada modelo.
NOTA: É importante adicionar rapidamente os volumes a cada inserção e, como tal, é aconselhável limitar o número de modelos de mucosa intestinal reconstruída a 12 ou menos de cada vez. - Feche a placa e coloque-a em uma incubadora por 2 h para permitir que a solução se fixe.
- Preparação, contagem celular e adição de células epiteliais Caco-2 ao modelo intestinal (DIA 1)
- Retirar a cultura de células de Caco-2 (passo 1.1.2) da incubadora. Repetir os procedimentos do passo 1.4.1 utilizando 10 ml de PBS para lavagem preliminar. Em seguida, adicionar 5 mL de uma solução pré-preparada de tripsina-EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,02% em PBS livre de Ca e Mg) e colocar em uma incubadora por 5-8 min.
- Repita os passos 1.4.3 (mas utilizando 5 ml de DMEM para bloquear a reacção de tripsina) até 1.4.6 para contar as células utilizando a câmara de contagem celular.
- Preparar uma solução de DMEM para conter uma contagem de 150.000 células de Caco-2 em 50 μL.
Observação : o número de células usadas é um ponto crítico. Exceder 150.000 células poderia resultar em uma camada epitelial compacta desorganizada, enquanto com muito pouco (menos de 100.000), as células lutam para crescer e não cobrem adequadamente a membrana basal, criando uma camada epitelial intestinal descontínua. Certifique-se de que as células estão efetivamente suspensas. A ponta de uma pipeta de 200 μL pode ser usada para garantir uma distribuição homogênea. Dado que 12 modelos podem ser construídos a qualquer momento, uma solução de células de 600 μL pode ser preparada. - Após as 2 h requeridas na etapa 1.4.14, adicionar 50 μL de células Caco-2 suspensas em DMEM ao meio de cada membrana basal. Feche a tampa da placa de vários poços.
- Incubar sob a capela de fluxo laminar estéril por 10 min. Em seguida, transfira para a incubadora por 30 min.
- Preparar uma solução de DMEM contendo 10% FBS e 1% Pen/Strep.
NOTA: Prepare uma solução suficiente para utilizar um volume de 1 ml por modelo. - Adicionar 500 μL do meio acima do modelo reconstruído e 500 μL abaixo do filtro.
NOTA: É necessário cuidado ao adicionar o meio acima do filtro para evitar desprender ou estressar as células. - Feche o sistema de placas de poços múltiplos e coloque-o na incubadora.
- Preparação/formação e utilização do modelo (DIA 2 ao DIA 6)
- DIA 2: Retire cuidadosamente a solução tanto acima do modelo reconstruído quanto abaixo do filtro usando uma pipeta. Substitua por 500 μL frescos de DMEM fresco (10% FBS e 1% Pen/Strep) acima e abaixo do filtro, respectivamente.
- DIA 3: Repita como acima na etapa 1.6.1.
- DIA 4: Repetir como acima na etapa 1.6.1.
NOTA: Este modelo intestinal é um modelo celular estático; Portanto, para favorecer a liberação de moléculas e o crescimento e estimulação das células, é muito importante que o meio seja trocado todos os dias. - DIA 5: Neste ponto, o modelo está totalmente formado/desenvolvido. Use esses modelos para estudos posteriores.
OBS: O melhor momento para utilizar o modelo é em 5 dias. Embora as células possam ser mantidas em incubadora por períodos mais longos, quanto mais tempo passa, maior a probabilidade de que as células epiteliais cresçam de forma descontrolada, resultando em uma camada desorganizada e compacta e de difícil utilização. - Aos 5 dias, incubar os modelos com componentes tóxicos (glúten ou lipopolissacarídeo [LPS]) ou benéficos (polifenóis) de interesse. Adicione estes à porção superior do modelo reconstruído suspenso no meio DMEM.
NOTA: A concentração adequada de cada componente de interesse deve ser calculada e suspensa em meio DMEM. Devem ser criados controlos não tratados que contenham apenas meio DMEM para comparação com os modelos experimentais. - Incubar os modelos controle e experimental por 24 h em incubadora.
- DIA 6: Retire o meio acima e abaixo do filtro com uma pipeta.
NOTA: O meio pode ser armazenado para testes subsequentes do tipo ensaio imunoenzimático (ELISA) para medir a liberação de citocinas inflamatórias. Para este fim, o meio deve ser adicionado a frascos estéreis e armazenado a -20 ° C para análise posterior.
2. Incorporação parafínica dos modelos de mucosa intestinal reconstruída
NOTA: Todo o procedimento deve ser realizado sob uma capela de fumo química. Cada etapa e respectiva alocação de tempo devem ser rigorosamente cumpridas. Por esse motivo, é importante ter todos os reagentes preparados com antecedência.
- Ajuste a máquina de parafina para 58 °C para que esteja pronta para uso.
- Transfira as pastilhas de membrana para poços limpos usando um alicate em uma placa estéril de 24 poços.
- Adicionar 500 μL de formalina tamponada a 37% em PBS acima do filtro e 1 mL sob o filtro. Feche a tampa e deixe-a sob o exaustor de fumo químico durante 2 h no RT.
NOTA: Como alternativa, formalina tamponada a 4% pode ser usada em RT por 1 h. - Remova a formalina e adicione a solução de HBSS acima e abaixo do filtro. Em seguida, remova o HBSS.
- Desprenda a lâmina própria da inserção da membrana.
NOTA: As células da mucosa intestinal geralmente se desprendem muito facilmente da inserção da membrana, pois não estão ligadas a esta última. Além disso, os dois compartimentos da amostra (apical e basal) permanecem fixados, mantendo a estrutura 3D. Se, por algum motivo, eles não estiverem prontamente destacados, será importante usar uma lâmina de bisturi descartável estéril para remover a mucosa intestinal da inserção da membrana. A inserção da membrana pode ser cortada, desprendendo-a assim do plástico. Tenha cuidado para nunca tocar a amostra com o bisturi. O motivo para a remoção da inserção da membrana das células emblocadas em colágeno é que esse filtro pode se desprender nas fases subsequentes de fixação ou inclusão em parafina, tornando desproporcionais as comparações entre modelos de mucosa intestinal. Além disso, as inserções de membrana dentro da seção embutida têm uma consistência diferente, o que pode interferir na secção. - Coloque os copos de 100 mL sob o exaustor químico, cada um corretamente marcado para incluir um sistema modelo de mucosa intestinal reconstruída sob investigação. Adicionar 25 mL de ETOH a 35% a cada copo e, em seguida, adicionar a mucosa intestinal reconstruída. Incubar por 10 min.
- Substitua o etanol a 35% por 25 mL de etanol a 50% e incube por 10 min.
- Substitua o etanol a 50% por 25 mL de etanol a 70% e incube por 10 min.
- Substitua o etanol 70% por 25 mL de etanol 80% e incube por 10 min.
- Substitua o etanol 80% por 25 mL de etanol 95% e incube por 10 min.
- Substitua o etanol 95% por 25 mL de etanol 100% e incube por 10 min.
- Substitua o etanol 100% por mais 25 mL de etanol 100% e incube por 10 min.
- Coloque os copos de 100 mL sob o exaustor, cada um corretamente rotulado para incluir um modelo sob investigação. Adicionar 50 mL de xileno ou um agente de limpeza histológica por 10-20 min.
NOTA: Histo-Clear (agente de limpeza histológica) é recomendado, pois o agente aumenta a clareza e a vibração das manchas acidofílicas. O tempo de clareamento pode variar de uma amostra de mucosa intestinal reconstruída para outra e deve ser verificado quanto à transparência na aparência a cada 2-3 min. - Assim que as amostras estiverem transparentes, coloque-as em um suporte de de tecido metálico que é então imerso em parafina líquida dentro da máquina aquecida por 45 min.
- Troque a parafina e deixe as amostras dentro da máquina aquecida por mais 45 min.
- Retire o suporte de de tecido e coloque no gelo para esfriar. Quando os blocos de amostra resfriados se desprendem do suporte de metal, estes podem ser resfriados à temperatura ambiente.
- Guarde os blocos no RT.
NOTA: Se o objetivo é preparar seções imediatamente, então os blocos podem ser colocados a 4 ° C para que eles sejam bem resfriados quando usados. - Corte cortes de 4 μm usando um micrótomo.
- Coloque as seções cortadas em lâminas e seque-as em forno a 37°C por 24 h.
- Os slides estão prontos para uso. Armazená-los em RT até realizar a coloração histológica H&E ou a coloração imuno-histoquímica (tipo antígeno-anticorpo).
- Para a coloração imuno-histoquímica, selecionar os anticorpos de interesse (seja para o estudo de proteínas TJ, como a ocludina, seja para ativação, migração e diferenciação de monócitos) e detectar a expressão (via coloração) usando kits comerciais.
- Da mesma forma, meça o muco usando o kit de coloração Alcian blue e ácido periódico de Schiff (PAS).
- Quantificar as proteínas TJ coradas de interesse, como a ocludina, calculando a porcentagem de pixels positivos em micrografias retiradas do microscópio.
- Analise fotos das células usando um software de análise de imagens (por exemplo, software ImageJ2 [Wayne Rasband, versão 2.9.0/1.53t]).
- Para realizar a análise dos pixels, processe as imagens digitais para 300 pixels/polegada e converta-as para 8 bits. Em seguida, processe as imagens binárias pelo plugin Color Deconvolution para analisar a coloração da proteína de interesse, neste caso, a coloração vermelha permanente da ocludina.
- Salve a imagem selecionada como tiff e submeta-a a um procedimento de "limpeza" para eliminar artefatos com um editor gráfico (por exemplo, Adobe PhotoshopCC [versão 20.0.4]).
- Depois disso, meça todos os campos de interesse com o aplicativo Analyze Particle of ImageJ2 e relate os dados como o número de pixels.
OBS: Cada experimento deve ser realizado em triplicata, com três campos internos de réplica analisados para cada repetição. Para quantificar o muco, o mesmo princípio de medição dos pixels pode ser aplicado às imagens obtidas das mucinas neutras coradas de magenta roxo e do muco ácido corado de azul brilhante, respectivamente.
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Representative Results
O primeiro aspecto importante é determinar a aceitabilidade da mucosa intestinal equivalente 3D básica para fins experimentais. Esta é realizada com a coloração mais utilizada nos laboratórios de histologia e histopatologia, a saber, hematoxilina (cora material nuclear de cor azul-púrpura profunda) e eosina (cora material citoplasmático variando tons de rosa). A coloração H&E é realizada primeiramente em um controle não tratado, que é cultivado nas mesmas condições e prazos dos tratamentos experimentais. A partir da visualização do padrão, forma e estrutura das células, o sucesso desse sistema modelo de células intestinais é determinado pela formação de uma monocamada firme e regular acima da lâmina própria rica em matriz extracelular (MEC) após 5 dias (Figura 1A). Exemplos de sistemas-modelo que seriam considerados inaceitáveis para análises posteriores incluem aqueles que mostram crescimento excessivo com camadas epiteliais desorganizadas, como mostrado após 10 dias (Figura 1B). Um exemplo adicional é uma camada epitelial muito espessa e desorganizada (Figura 1C), causada pela semeadura do excesso de células Caco-2 ou por uma incubação excessiva. A malformação (Figura 1D), atribuível tanto a células semeadoras que não estavam em fase ativa de proliferação, quanto a problemas na preparação da lâmina própria ou durante a fixação com parafina (as células se desprenderam/arruinaram), também é um exemplo de inaceitável reconstrução da mucosa intestinal. Igualmente inaceitável é a falta de formação da camada epitelial (Figura 1E), indicativa de semeadura de poucas células Caco-2 ou problemas na preparação da lâmina própria. Usando equivalentes intestinais 3D aceitáveis, a partir dos quais várias seções podem ser geradas, vários parâmetros podem então ser investigados a partir de um único experimento.
Dos vários parâmetros que podem ser analisados, a integridade da barreira em resposta a indutores pró-inflamatórios pode ser visualizada, e as proteínas TJ coradas e quantificadas e comparadas com sistemas modelo de controle não tratados. Demonstramos aqui o efeito pró-inflamatório de 40 μg/mL de proteína total de trigo de uma fonte de trigo duro comalto teor de glúten7, tanto sobre a integridade celular quanto sobre o conteúdo de proteína ocludina TJ (Figura 2A). Usando a coloração histológica H&E, o sistema modelo controle mostra as células colunares do Caco-2 formando uma monocamada apertada e regular. Em contraste, o efeito da amostra de proteína contendo glúten mostrou causar ruptura da monocamada, com coloração de eosina mais inespecífica (Figura 2A). Além disso, a espessura da camada epitelial pode ser medida e mostra-se significativamente reduzida após exposição ao glúten pró-inflamatório (Figura 2A,B). Usando um anticorpo para ocludina (conjugado à coloração de cromogênio vermelho), a proteína ocludina pôde ser visualizada e quantificada. O conteúdo de proteína ocludina significativamente maior foi evidente no grupo controle em comparação com a mucosa intestinal exposta à proteína do glúten por 24 h (Figura 2A,C).
Os equivalentes intestinais compostos por um componente imune (representados por monócitos U937) também são ideais para investigar os efeitos de indutores pró-inflamatórios na ativação, migração e diferenciação de monócitos em macrófagos. Mais uma vez, utilizando 40 μg/mL de proteína total do trigo extraída de uma fonte de trigo com alto teor de glúten, a ativação pró-inflamatória dos monócitos U937 na lâmina própria foi evidenciada a partir da coloração CD14 acoplada ao vermelho rápido (Figura 3A). A ativação é detectada a partir do aumento da expressão desta glicoproteína de membrana corada de vermelho em monócitos e macrófagos. O aumento da proteína CD14 também foi detectado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), que cora verde sob imunofluorescência. A migração foi evidenciada a partir da presença de células U937 ativadas próximas à monocamada Caco-2. Onde a monocamada havia se rompido, as células U937 tinham entrado dentro da monocamada de células Caco-2 (Figura 3A). Não houve evidência de migração de monócitos corados por CD14 no grupo controle (Figura 3A). A diferenciação de monócitos em macrófagos é identificável a partir do marcador CD11b. Nenhuma coloração para CD11b foi evidente no grupo controle com cromogênio vermelho ou FITC (Figura 3B). Em vez disso, nos tecidos expostos ao glúten, macrófagos CD11b foram observados tanto na lâmina própria rica em MEC quanto na monocamada de Caco-2 rompida (Figura 3B).
Usando LPS para simular inflamação intestinal, mostramos aqui que também é possível usar este sistema modelo para investigar mucina ácida e mucopolissacarídeos produzidos pelas células Caco-2 no tratamento não tratado e no tratamento com LPS, respectivamente (Figura 4A). Usando a coloração Alcian blue e PAS, o muco ácido é corado de azul brilhante, e as mucinas neutras são coradas de roxo-magenta, respectivamente. A extensão da coloração do muco pode ser igualmente quantificada e mostra-se significativamente induzida sob desafio de 1 ng/mL LPS (Figura 4B). Além disso, antes da fixação, o meio pode ser removido para investigar a produção de citocinas pró-inflamatórias. Embora numerosas citocinas excretoras possam ser medidas, neste caso em particular, a midkine (MDK) foi selecionada. O MDK é um marcador inflamatório endógeno induzido pelo fator de transcrição, fator nuclear kappa-intensificador de cadeias leves da via de células B ativadas (NF-κB), e também está associado a doenças inflamatórias das célulasintestinais15. Sob o desafio LPS, a RDM é significativamente induzida em comparação com o controle (Figura 5).
Figura 1: Equivalentes intestinais 3D de controle não tratados. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de equivalentes intestinais 3D controle não tratados (co-culturas Caco-2 /U937/L929) por 24 h como verificação da eficácia do modelo básico de mucosa intestinal 3D para fins experimentais. (A) Um modelo experimental aceitável é comparado a modelos inaceitáveis, mostrando (B) crescimento epitelial excessivo e camadas desorganizadas após 10 dias, (C) espessura e desorganização epitelial excessivas, (D) malformação e (E) nenhuma camada de células epiteliais. A barra de escala em cada imagem é igual a 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Equivalentes intestinais 3D tratados. (A) Coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e expressão de ocludina de equivalentes intestinais 3D (co-culturas Caco-2 /U937/L929) expostas por 24 h a 40 μg/mL de proteína total de uma mistura moderna de trigo com alto teor de glúten em comparação com o controle (CTRL). A barra de escala em cada imagem é igual a 50 μm. (B) Quantificação da espessura da célula Caco-2 e (C) coloração cromogênica vermelho-ocludina. As diferenças significativas foram determinadas pela variância one-way (ANOVA) e representadas como *** 0,0001< P < 0,001. Os pontos pretos representam o número de réplicas. Esse número foi adaptado com permissão de Truzzi et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Coloração CD14 e CD11B. Coloração CD14 de monócitos U937 e macrófagos diferenciados por CD11B U937 em equivalentes intestinais 3D (co-culturas Caco-2/U937/L929) expostos a proteína não adicionada (controle [CTRL]) ou 40 μg/mL de proteína total de uma mistura moderna de trigo rica em glúten após um período de 24 h. Para a coloração de CD14 e CD11b, o vermelho rápido foi usado como cromógeno e os núcleos foram contracorados com eosina. A barra de escala em cada imagem é igual a 20 μm. As colorações de CD14 e CD11b com isotiocianato de fluoresceína (verde) também foram mostradas por imunofluorescência. Os núcleos foram contracorados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). A barra de escala em cada imagem é igual a 50 μm. As setas indicam a presença de monócitos (células CD14 positivas) e macrófagos (células CD11b positivas). Esse número foi adaptado com permissão de Truzzi et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração hematoxilina e eosina (H&E) e expressão de muco a partir da coloração Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff Stain (PAS). (A) Células Caco-2 em equivalentes intestinais 3D básicos (co-culturas Caco-2 /U937/L929) após 24 h nos sistemas modelo equivalente não tratado e mucosa intestinal reconstruída expostos a lipopolissacarídeo 1 ng/mL. A barra de escala em cada imagem é igual a 50 μm. (B) A quantificação da expressão do muco foi determinada pela variância (ANOVA) one-way com significância relatada como **** P < 0,0001. Os pontos pretos representam o número de réplicas. Essa figura foi adaptada com permissão de Truzzi et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Expressão de Midkine. Expressão de midkine em meio de equivalentes intestinais 3D (co-culturas Caco-2 /U937/L929) após 24 h nos sistemas modelo controle não tratado (CTRL) e mucosa intestinal expostos a lipopolissacarídeo 1ng/mL. A quantificação da expressão de midkine foi determinada por variância (ANOVA) one-way com significância relatada como **** P < 0,0001. Essa figura foi adaptada com permissão de Truzzi et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diagrama esquemático representando a construção e uso experimental de equivalentes intestinais, bem como a fixação e análises microscópicas dos parâmetros dos cortes teciduais. O diagrama esquemático resume a construção dos equivalentes intestinais e possíveis tratamentos experimentais que podem ser administrados a esses modelos. A geração de múltiplos cortes teciduais a partir de um único experimento permite a análise de inúmeros aspectos estruturais e imunológicos da mucosa intestinal, como ilustrado na Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruída aqui apresentado (Figura 6) combina complexidade fisiológica (culturas de células 3D mais relevantes fisiologicamente contendo uma monocamada de Caco-2 com um suporte de lâmina própria rico em MEC contendo fibroblastos e monócitos) com simplicidade experimental (usando linhagens celulares humanas comerciais para produzir um sistema padronizado e facilmente repetível)13. Como tal, este sistema modelo é considerado uma alternativa adequada aos modelos murinos destinados a avaliar o efeito de potenciais fármacos/componentes alimentares na integridade da barreira intestinal. A esse respeito, artigos anteriores comprovam a eficácia do presente modelo de cultura celular em testar tanto compostos potencialmente benéficos (mais dose dependente) quanto componentes nocivos de alimentos 7,16,17. Além disso, LPS ou reagentes pró-inflamatórios alternativos (ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico ou dextran sulfato de sódio) podem ser adicionados ao presente modelo de mucosa intestinal para simular sintomas de DII. Dessa forma, é potencialmente possível estudar a etiologia das doenças intestinais tanto do aspecto estrutural quanto da expressão de citocinas, como a MDK pró-inflamatória, que é um marcador daDII15. Esse sistema de modelo básico também tem potencial de triagem de drogas para a população em geral. Embora o sistema modelo seja fisiologicamente mais complexo do que os modelos 2D13,14, as limitações na reprodução da fisiologia humana complexa incluem a ausência tanto de um sistema microfluídico (perfusão fluídica de fornecimento contínuo de nutrientes e remoção de resíduos, bem como de estímulos mecânicos)8,14 quanto do microbioma (avaliando interações hospedeiro-microbioma em doenças intestinais)8, 14º.
A vantagem de usar o presente modelo básico de mucosa intestinal 3D em combinação com a inclusão em parafina para avaliação microscópica luminosa da integridade da barreira epitelial é que vários cortes teciduais podem ser feitos a partir de um único experimento, permitindo a análise de vários parâmetros. A resistência elétrica transepitelial (TEER)3 é um método comumente utilizado para avaliar a integridade da barreira intestinal e tem sido utilizado em conjunto com estudos de permeabilidademacromolecular3,18, bem como estudos amplamente divulgados sobre a avaliação da expressão da proteína TJ por Western blot. A avaliação de Western blot fornece informações quantitativas sobre mudanças gerais na expressão de proteínas, e o TEER serve como uma medida quantitativa da integridade da barreira. Em vez disso, a avaliação microscópica fornece uma ferramenta valiosa para a visualização qualitativa e avaliação das alterações e interações proteicas locais18.
A avaliação microscópica de um modelo com componente imune permite a visualização de respostas imunes, como a diferenciação de monócitos em macrófagos e a migração de monócitos ativados na MEC, como demonstrado pelas colorações CD14 e CD11b. A identificação pode ser feita por imunohistoquímica e/ou coloração por imunofluorescência em cortes teciduais individuais, como foi demonstrado para CD14 e CD11b na Figura 3. A imuno-histoquímica permite a visualização estrutural do tecido da mucosa intestinal reconstruído como um todo. Além disso, é possível identificar tanto o núcleo quanto o citoplasma nas células. Em contraste, a imunofluorescência confocal não permite que o tecido seja visto como um todo (apenas os marcadores de interesse e núcleos corados com DAPI). No entanto, ele fornece uma imagem muito limpa, onde a cor de fundo é eliminada. A vantagem disso é que permite maior precisão na evidenciação da positividade ou negatividade dos marcadores e, como tal, o cálculo de eventuais diferenças na intensidade da cor (por exemplo, um marcador que é mais expresso em uma célula do que em outra). Potencialmente, a extensão da migração dos monócitos CD14 de dentro da lâmina própria para a monocamada de Caco-2 também pode ser estimada a partir de múltiplas imagens replicadas obtidas em vários momentos. No entanto, evidências de inflamação foram evidentes pela presença de células coradas com CD14 e CD11b.
Uma faixa de 20 a 40 μg de proteína total é usada pela maioria dos laboratórios para western blotting19. A quantificação de numerosas proteínas de junções comunicantes (ocludina, claudina, zonulina e E-caderina) pode ser realizada por coloração imunoistoquímica e/ou fluorescente em cortes individuais de tecido, respectivamente, necessitando de significativamente menos proteínas. Concomitantemente, a partir do mesmo experimento, a integridade da camada epitelial em resposta aos compostos também pode ser visualizada a partir do padrão, forma e estrutura das células com coloração H&E.
A eficácia de uma mucosa intestinal básica reconstruída em 3D para uso na coloração da produção de muco, proteínas TJ e proteínas produzidas a partir de respostas imunes depende da superação de etapas críticas, particularmente na construção do sistema modelo e durante a fixação tecidual. Em relação à construção do modelo, utilizar a confluência correta e semear o número correto de células Caco-2 (indicado pelas notas do protocolo), respectivamente, é fundamental. O excesso de células ou uma confluência incorreta resultaria em uma camada epitelial espessa e desorganizada. Em vez disso, poucas células resultariam em uma redução ou falta de formação de camada epitelial. Igualmente fundamental na semeadura é a correta confluência celular e o número de células L929 e U937 na MEC, bem como o correto manuseio do colágeno durante o preparo. O excesso de células ou a rápida polimerização do colágeno resultariam em uma MEC compacta e malformada, impactando na estrutura das células epiteliais acima. Da mesma forma, poucas células L929 formadoras de colágeno resultariam em uma consistência incorreta da MEC, enquanto poucos monócitos U937 não favoreceriam uma resposta imune. Também é importante que as células sejam usadas para experimentação após 5 dias, pois uma incubação prolongada resultaria em crescimento celular excessivo, resultando em uma camada epitelial compacta. Além disso, dado que o presente desenho carece de um sistema microfluídico e é representativo de um modelo celular intestinal estático, para favorecer a liberação de moléculas e o crescimento e estimulação das células, é muito importante que o meio seja trocado diariamente. Em relação ao protocolo de fixação, a fase de clareamento é crítica e, como o tempo necessário para que os tecidos fiquem transparentes em parafina pode variar, cada sistema da mucosa intestinal deve ser observado atentamente durante essa fase. Durante todo o procedimento de fixação, deve-se ter cuidado no manuseio desses modelos, a fim de evitar danificá-los.
Em conclusão, desde que se preste estrita adesão aos pontos críticos na construção e fixação dos equivalentes intestinais 3D básicos, os modelos podem fornecer numerosos cortes teciduais para a avaliação de múltiplos parâmetros em estudos de triagem farmacêutica e toxicidade.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecimentos à Fundação Umberto Veronesi por uma bolsa de apoio ao trabalho de pesquisadores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
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