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Biology

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

Summary

Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

Abstract

Ha aumentado el uso de modelos intestinales in vivo e in vitro para estudiar la fisiopatología de las enfermedades inflamatorias intestinales, para el cribado farmacológico de sustancias potencialmente beneficiosas y para los estudios de toxicidad de componentes alimentarios potencialmente nocivos. Cabe destacar que existe una demanda actual para el desarrollo de modelos in vitro basados en células que sustituyan a los modelos animales. Aquí, se presenta un protocolo para un modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de "tejido sano" utilizando líneas celulares con el doble beneficio de proporcionar simplicidad experimental (sistema estandarizado y fácilmente repetible) y complejidad fisiológica (enterocitos Caco-2 con un componente inmune de soporte de monocitos U937 y fibroblastos L929). El protocolo también incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de luz de equivalentes intestinales fijos, lo que proporciona la ventaja de analizar múltiples parámetros visuales a partir de un solo experimento. Para verificar la eficacia del modelo como sistema experimental se utilizan cortes teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) que muestran las células cilíndricas de Caco-2 formando una monocapa apretada y regular en tratamientos de control. Utilizando el gluten como componente alimentario proinflamatorio, los parámetros analizados en las secciones incluyen la reducción del grosor de la monocapa, así como la disrupción y el desprendimiento de la matriz subyacente (H&E), la disminución de la expresión de la proteína de unión estrecha como se muestra en la tinción de ocludina (cuantificable estadísticamente) y la activación inmune de las células U937 migratorias como se evidencia en la tinción del grupo de diferenciación 14 (CD14) y la diferenciación relacionada con CD11b en macrófagos. Como se muestra mediante el uso de lipopolisacáridos para simular la inflamación intestinal, los parámetros adicionales que se pueden medir son el aumento de la tinción de moco y la expresión de citocinas (como la midquina) que se pueden extraer del medio antes de la fijación. El modelo básico tridimensional (3D) de la mucosa intestinal y las secciones fijas pueden recomendarse para estudios de estado inflamatorio e integridad de la barrera con la posibilidad de analizar múltiples parámetros visuales cuantificables.

Introduction

La barrera epitelial intestinal, un revestimiento interno de una célula de espesor que contiene diferentes tipos de células epiteliales, constituye la primera barrera o interfaz defensiva física entre el medio externo e interno del cuerpo 1,2. Los enterocitos de tipo cilíndrico constituyen el tipo más abundante de células epiteliales. Estos son responsables de mantener la integridad de la barrera epitelial a través de las interacciones entre varios componentes de la barrera, incluidas las uniones estrechas (TJ), desempeñando un papel importante en el endurecimiento de la barrera 1,3. La estructura de la TJ consiste en proteínas de placa intracelular, como la zonula occludens (ZO) y la cingulina, que cooperan con las proteínas transmembrana, incluidas las ocludinas, las claudinas y las moléculas de adhesión de unión (JAM) que forman una estructura similar a una cremallera que une estrechamente a las células vecinas 3,4. Las proteínas transmembrana regulan la difusión paracelular pasiva de compuestos pequeños y excluyen las moléculas grandes tóxicas.

Los compuestos alimentarios potencialmente tóxicos y los contaminantes alimentarios estimulan la producción de citoquinas inflamatorias que alteran la permeabilidad epitelial, activando las células inmunitarias y causando inflamación crónica del tejido intestinal 5,6,7. Por el contrario, se ha informado que varios fitoquímicos antioxidantes y antiinflamatorios reducen la expresión de citocinas inflamatorias y mejoran la integridad de la barrera intestinal de TJ a través de la restauración de la expresión y el ensamblaje de la proteína TJ 4,6,8. Por lo tanto, la regulación de la integridad de la barrera epitelial por compuestos beneficiosos y dañinos ha visto un aumento en el uso de modelos in vivo e in vitro destinados a imitar la barrera intestinal para el cribado farmacéutico y los estudios de toxicidad. Esto es particularmente relevante dado el creciente interés en comprender la fisiopatología de las enfermedades intestinales intestinales (EII), la enterocolitis necrotizante y el cáncer, que pueden ser simuladas en modelos experimentales 8,9,10.

Ha habido una demanda para el desarrollo de modelos in vitro basados en células con el fin de lograr el objetivo de las "3R" en la experimentación con animales. Estos incluyen alternativas de reemplazo al uso de animales, reducción en el número de animales utilizados y refinamiento en la adopción de métodos que alivian la angustia 11,12,13. Además, los mecanismos moleculares, celulares y fisiológicos subyacentes entre los modelos humanos y murinos (siendo los roedores las especies más utilizadas) son distintivos, lo que lleva a la controversia sobre la eficacia de los modelos murinos como predictores en las respuestas humanas12,13. Entre las numerosas ventajas de los modelos in vitro de líneas celulares humanas se incluyen la experimentación restringida a objetivos, la observación directa y el análisis continuo13.

Las monocapas de tipo unicelular en cultivos bidimensionales (2D) han servido como modelos poderosos. Sin embargo, estos no pueden reproducir con precisión la complejidad fisiológica de los tejidos humanos 8,13,14. Como resultado, los sistemas de cultivo 3D se están desarrollando con mejoras cada vez mayores para recapitular la complejidad fisiológica de los tejidos intestinales sanos y enfermos como herramientas de evaluación de riesgos de próxima generación13,14. Estos modelos incluyen andamios 3D Transwell con diversas líneas celulares, cultivos de organoides y dispositivos microfluídicos (intestino en chip) que utilizan tanto líneas celulares como organoides (derivados de tejidos sanos y enfermos)8,13,14.

El protocolo 3D de "tejido sano" equivalente intestinal presentado en el presente estudio se basó en lograr un equilibrio entre la complejidad fisiológica y la simplicidad experimental13. El modelo es representativo de un andamio 3D de Transwell, compuesto por tres líneas celulares (enterocitos [la línea Caco-2 del adenocarcinoma de colon de referencia] con un componente inmune de soporte [monocitos U937 y fibroblastos L929]), constituyendo un sistema estandarizado y fácilmente repetible aplicable para el cribado preliminar de moléculas dietéticas de interés sobre la integridad de la barrera epitelial intestinal y la respuesta inmunitaria. El protocolo incluye la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de la luz de la integridad de la barrera epitelial utilizando equivalentes intestinales fijos. La ventaja del enfoque actual es que se pueden teñir numerosas secciones de los tejidos incrustados para múltiples parámetros a partir de un solo experimento.

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Protocol

1. Preparación del modelo básico de mucosa intestinal reconstruida en 3D

NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril. Todas las etapas del procedimiento que impliquen el uso de la incubadora celular significan que los cultivos se incuban a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene un 5% deCO2 (a menos que se indique lo contrario en el protocolo).

  1. Preparación previa de las líneas celulares utilizadas en el sistema modelo intestinal
    1. Siembre células de fibroblastos de ratón L929 a una concentración de 5 x 105 en 5 mL del Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 2 mM de L-glutamina, 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) en un matraz F25 y cultive en una incubadora 4 días antes de la construcción de los modelos intestinales. Después de 48 h, retire el medio con una pipeta. A continuación, añadir medio fresco (5 ml) e incubar las células durante 48 h.
      NOTA: Las celdas deben tener un 80% de confluentes antes de ser utilizadas.
    2. Sembrar células de Caco-2 (concentración de 2 x10,6) en 10 mL de medio DMEM (con 10% de FBS y 1% de Pen-Strep) en un matraz de células F75 y cultivarlo en una incubadora 4 días antes de la construcción del modelo de mucosa intestinal. Después de 48 h, cambie el medio como se describe en el paso 1.1.1 y vuelva a incubar durante 48 h hasta una confluencia del 80%.
      NOTA: Las células deben estar en una fase de proliferación activa: ni demasiado dispersas ni demasiado confluentes. Se recomienda una confluencia del 50-60%. Las células no deben sembrarse el día anterior a la realización del modelo porque esto podría ralentizar la capacidad proliferativa de las células, que entonces no se arraigarían perfectamente en el modelo 3D reconstruido.
    3. Agregue células U937 que crecen en suspensión (concentración de 1 x 106) a 10 ml de medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (que contiene 2 mM de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 10% de FBS y 1% de Pen-Strep) en un matraz de células F75 2 días antes de la configuración del modelo, y colóquelo en una incubadora durante 48 h.
  2. Preparación de los insertos de placas de cocultivo de Transwell
    1. Seleccione una placa de 24 pocillos que contenga insertos con filtros de 0,4 μm.
      NOTA: El filtro de 0,4 μm es una opción estándar en los estudios de transporte de fármacos. No se recomiendan los tamaños de filtro de 3 μm y 8 μm para evitar posibles pérdidas de las células incrustadas en colágeno.
    2. Con una pipeta, hidrate los filtros Transwell (en lo sucesivo denominados insertos de membrana) con 500 μL de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks por debajo y por encima del inserto filtrante.
    3. Cierre la placa de pocillos múltiples y colóquela en una incubadora durante un mínimo de 2 h.
      NOTA: Los insertos de membrana pueden permanecer en el HBSS hasta 24 h. Esta operación se puede realizar el día anterior a la construcción del modelo. Es importante que los insertos de membrana estén completamente hidratados y que el filtro no se seque, ya que esto podría dificultar que la muestra se adhiera correctamente.
    4. Retire las placas de la incubadora después de 2 h (o 24 h). Aspire cuidadosamente el HBSS por encima y por debajo de los insertos de la membrana con una pipeta y déjelo secar durante 10 minutos.
  3. Preparación de la lámina propia de colágeno libre de células del sistema básico de modelo intestinal en 3D (DÍA 1)
    1. Prepare una solución de colágeno libre de células en un tubo estéril de 50 ml sobre hielo que contenga los siguientes componentes en DMEM: 10% de suero fetal bovino (FBS), 200 mM de L-glutamina, 1% de bicarbonato de sodio y 1,35 mg/ml de colágeno de cola de rata tipo 1.
      NOTA: Todos estos componentes deben mantenerse en hielo y añadirse al DMEM con puntas de pipeta refrigeradas. El colágeno de la cola de rata tipo 1 debe agregarse al final, ya que se polimeriza con el aumento de la temperatura y el pH. La cantidad de solución de colágeno libre de células preparada dependerá del número de equivalentes intestinales requeridos.
    2. Añadir 250 μL de la solución a cada inserto de la placa (por encima del filtro de membrana) para el número de equivalentes intestinales seleccionados y colocar la tapa sobre la placa de pocillos múltiples. Deje que la solución de colágeno se polimerice a temperatura ambiente (RT) debajo de la campana de flujo laminar.
      NOTA: Aparte de la transición a una fase más sólida, la polimerización también es evidente por un cambio de color de amarillo a rosa. La polimerización suele completarse en 10-15 minutos.
  4. Preparación, recuento celular y adición de células de fibroblastos (L929) y monocitos (U937) al sistema modelo (DÍA 1)
    1. Retire el cultivo celular L929 (paso 1.1.1) de la incubadora. Con una bomba de vacío, aspire el medio, reemplácelo con 5 ml de solución salina tampón fosfato estéril (PBS; sin Ca y Mg) y enjuague las células.
    2. Aspire el PBS con una bomba de vacío. Agregue 2 ml de una solución de tripsina-EDTA preparada previamente (0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA en PBS) y colóquela en una incubadora durante 3-5 minutos.
    3. Utilice un microscopio invertido (por ejemplo, un Eclipse Ts2, Nikon) para establecer si las células se están desprendiendo de la superficie de adhesión. Si esto ocurre, agregue inmediatamente 2 ml de DMEM (que contenga 10% de FBS) para bloquear la reacción de tripsina y enjuague las células.
    4. Transfiera la solución celular a un tubo estéril de 15 ml y centrifugue a 645 x g durante 5 min. Con una bomba de vacío, aspire el sobrenadante.
      NOTA: Es necesario tener cuidado de no alterar el pellet. El efecto del DMEM se probó en las células L929 y U937 y no se demostró que tuviera efectos adversos sobre el crecimiento.
    5. Agregue 1 ml de DMEM al gránulo y suspenda las células.
      NOTA: Las células deben estar suspendidas homogéneamente en la solución.
    6. Retire 20 μL de las células en DMEM y agregue 20 μL de solución de azul de tripano. Retire 20 μL de la mezcla y evalúe la densidad celular microscópicamente utilizando una cámara de recuento celular.
    7. Retire el cultivo celular U937 (paso 1.1.3) de la incubadora. Centrifugar la solución celular a 645 x g durante 5 min. Con una bomba de vacío, aspire el sobrenadante para evitar perturbar el pellet.
    8. Suspenda las células en 1 mL de RPMI. Al igual que con las células L929, asegúrese de que las células estén suspendidas homogéneamente en la solución.
    9. Del mismo modo, establezca la densidad celular como se indica en el paso 1.4.6.
    10. Prepare una solución de colágeno como se describe en el paso 1.3.1.
      NOTA: La cantidad de solución a realizar debe tener en cuenta 450 μL para cada inserto (o modelo).
    11. Preparar una solución de DMEM que contenga un recuento de 50.000 células L929 y 15.000 células U937, respectivamente, en un volumen de 50 μL para cada modelo equivalente intestinal que se vaya a construir.
      NOTA: El número de celdas es un factor crítico. Demasiadas de ambos tipos de células darían lugar a una lámina propia excesivamente llena de células que no estarían adecuadamente organizadas. Un número menor de fibroblastos (que generan colágeno) daría lugar a una lámina propia menos compacta, mientras que un número insuficiente de monocitos impediría la respuesta inmunitaria a los estímulos. Siempre que haya un recuento correcto de células dentro de cada alícuota de 50 μL, se puede preparar un volumen total de 600 μL para los 12 insertos de filtro presentes en cada placa de 24 pocillos.
    12. Añadir cada alícuota de 50 μl que contenga las células a 450 μl de solución de colágeno en el paso 1.4.10. Homogeneizar.
    13. Superponga la lámina propia de colágeno libre de células prerrecubierta con 500 μL de la solución celular que contiene colágeno para cada modelo.
      NOTA: Es importante agregar rápidamente los volúmenes a cada inserto y, como tal, es aconsejable limitar el número de modelos de mucosa intestinal reconstruidos a 12 o menos a la vez.
    14. Cierre la placa y colóquela en una incubadora durante 2 h para permitir que la solución se asiente.
  5. Preparación, recuento celular y adición de células epiteliales Caco-2 al modelo intestinal (DÍA 1)
    1. Retire el cultivo celular de Caco-2 (paso 1.1.2) de la incubadora. Repita los procedimientos del paso 1.4.1 utilizando 10 ml de PBS para el enjuague preliminar. A continuación, añadir 5 ml de una solución de tripsina-EDTA preparada previamente (0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA en PBS libres de Ca- y Mg) y colocar en una incubadora durante 5-8 min.
    2. Repita los pasos 1.4.3 (pero usando 5 ml de DMEM para bloquear la reacción de tripsina) hasta 1.4.6 para contar las células utilizando la cámara de recuento de células.
    3. Prepare una solución de DMEM para contener un recuento de 150.000 células de Caco-2 en 50 μL.
      NOTA: El número de celdas utilizadas es un punto crítico. Superar las 150.000 células podría dar lugar a una capa epitelial compacta y desorganizada, mientras que con muy poca (menos de 100.000), las células tienen dificultades para crecer y no cubren adecuadamente la membrana basal creando una capa epitelial intestinal discontinua. Asegúrese de que las células estén suspendidas de manera efectiva. La punta de una pipeta de 200 μL se puede utilizar para garantizar una distribución homogénea. Dado que se pueden construir 12 modelos en un momento dado, se puede preparar una solución celular de 600 μL.
    4. Después de las 2 h requeridas en el paso 1.4.14, añadir 50 μL de células de Caco-2 suspendidas en DMEM en el centro de cada membrana basal. Cierre la tapa de la placa de pocillos múltiples.
    5. Incubar bajo la campana de flujo laminar estéril durante 10 min. Luego transfiéralo a la incubadora durante 30 minutos.
    6. Prepare una solución de DMEM que contenga un 10% de FBS y un 1% de pluma/estreptococo.
      NOTA: Prepare una solución suficiente para usar un volumen de 1 ml por modelo.
    7. Agregue 500 μL del medio por encima del modelo reconstruido y 500 μL por debajo del filtro.
      NOTA: Se requiere cuidado al agregar el medio sobre el filtro para evitar desprender o estresar las celdas.
    8. Cierre el sistema de placas de pocillos múltiples y colóquelo en la incubadora.
  6. Preparación/formación y uso del modelo (DÍA 2 a DÍA 6)
    1. DÍA 2: Retire con cuidado la solución tanto por encima del modelo reconstruido como por debajo del filtro con una pipeta. Reemplácelo con 500 μL de DMEM nuevo (10% FBS y 1% Pen/Strep) por encima y por debajo del filtro, respectivamente.
    2. DÍA 3: Repita como se indica arriba en el paso 1.6.1.
    3. DÍA 4: Repita como se indica arriba en el paso 1.6.1.
      NOTA: Este modelo intestinal es un modelo celular estático; Por lo tanto, para favorecer la liberación de moléculas y el crecimiento y estimulación de las células, es muy importante que el medio se cambie todos los días.
    4. DÍA 5: En este punto, el modelo está completamente formado/desarrollado. Utilice estos modelos para estudios posteriores.
      NOTA: El mejor momento para usar el modelo es a los 5 días. Aunque las células se pueden mantener en una incubadora durante períodos más largos, cuanto más tiempo pasa, mayor es la probabilidad de que las células epiteliales crezcan de manera descontrolada, lo que resulta en una capa desorganizada y compacta que es difícil de usar.
    5. A los 5 días, incubar los modelos con componentes tóxicos (gluten o lipopolisacáridos [LPS]) o beneficiosos (polifenoles) de interés. Añádalos a la parte superior del modelo reconstruido suspendido en el medio DMEM.
      NOTA: La concentración adecuada de cada componente de interés debe calcularse y suspenderse en un medio DMEM. Los controles no tratados que contengan únicamente medio DMEM deben establecerse para su comparación con los modelos experimentales.
    6. Incubar los modelos control y experimental durante 24 h en una incubadora.
    7. DÍA 6: Retire el medio por encima y por debajo del filtro con una pipeta.
      NOTA: El medio se puede almacenar para pruebas posteriores de tipo ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para medir la liberación de citocinas inflamatorias. Para ello, el medio debe añadirse a viales estériles y almacenarse a -20 °C para su posterior análisis.

2. Inclusión en parafina de los modelos de mucosa intestinal reconstruidos

NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo bajo una campana de gases químicos. Cada paso y la respectiva asignación de tiempo deben cumplirse estrictamente. Por esta razón, es importante tener todos los reactivos preparados con anticipación.

  1. Ajuste la máquina de parafina a 58 °C para que esté lista para su uso.
  2. Transfiera los insertos de membrana a pocillos limpios con unos alicates en una placa estéril de 24 pocillos.
  3. Añadir 500 μL de formalina tamponada al 37% en PBS por encima del filtro y 1 mL por debajo del filtro. Cierre la tapa y déjela debajo de la campana de extracción de productos químicos durante 2 h a RT.
    NOTA: Como alternativa, se puede usar formalina tamponada al 4% en RT durante 1 h.
  4. Retire la formalina y agregue la solución de HBSS tanto por encima como por debajo del filtro. A continuación, retire el HBSS.
  5. Separe la lámina propia del inserto de la membrana.
    NOTA: Las células de la mucosa intestinal suelen desprenderse muy fácilmente del inserto de la membrana ya que no están unidas a esta última. Además, los dos compartimentos de la muestra (apical y basal) permanecen unidos, conservando la estructura 3D. Si, por alguna razón, no se desprenden fácilmente, será importante utilizar una hoja de bisturí desechable estéril para eliminar la mucosa intestinal del inserto de la membrana. El inserto de membrana se puede cortar, separándolo así del plástico. Tenga cuidado de no tocar nunca la muestra con el bisturí. El motivo para eliminar el inserto de membrana de las células incluidas en colágeno es que este filtro puede desprenderse en las fases posteriores de fijación o inclusión de parafina, lo que hace que las comparaciones entre modelos de mucosa intestinal sean desproporcionadas. Además, los insertos de membrana dentro de la sección incrustada tienen una consistencia diferente que puede interferir con el seccionamiento.
  6. Coloque los vasos de precipitados de 100 ml debajo de la campana de extracción química, cada uno correctamente etiquetado para incluir un sistema modelo de mucosa intestinal reconstruido que se está investigando. Añadir 25 ml de ETOH al 35% a cada vaso de precipitados y añadir la mucosa intestinal reconstruida. Incubar durante 10 min.
  7. Reemplace el etanol al 35% con 25 mL de etanol al 50% e incube durante 10 min.
  8. Reemplace el etanol al 50% con 25 ml de etanol al 70% e incube durante 10 min.
  9. Reemplace el etanol al 70% con 25 ml de etanol al 80% e incube durante 10 minutos.
  10. Reemplace el etanol al 80% con 25 ml de etanol al 95% e incube durante 10 min.
  11. Reemplace el etanol al 95% con 25 mL de etanol al 100% e incube durante 10 min.
  12. Reemplace el etanol al 100% con otro cambio de 25 ml de etanol al 100% e incube durante 10 min.
  13. Coloque vasos de precipitados de 100 ml debajo de la campana extractora, cada uno correctamente etiquetado para incluir un modelo bajo investigación. Agregue 50 ml de xileno o un agente aclarante histológico durante 10-20 min.
    NOTA: Se recomienda Histo-Clear (agente aclarante histológico) ya que el agente mejora la claridad y la vitalidad de las tinciones acidófilas. El tiempo de aclaramiento puede variar de una muestra de mucosa intestinal reconstruida a otra y debe comprobarse la transparencia de la apariencia cada 2-3 minutos.
  14. Tan pronto como las muestras estén transparentes, colóquelas en un soporte de casete de papel tisú de metal que luego se sumerge en parafina líquida dentro de la máquina calentada durante 45 minutos.
  15. Cambie la parafina y deje las muestras dentro de la máquina calentada durante 45 minutos más.
  16. Retire el soporte del casete de pañuelos y colóquelo sobre hielo para que se enfríe. Cuando los bloques de muestra enfriados se desprenden del soporte de metal, estos se pueden enfriar aún más a temperatura ambiente.
  17. Almacene los bloques en RT.
    NOTA: Si el objetivo es preparar secciones de inmediato, entonces los bloques se pueden colocar a 4 ° C para que se enfríen bien cuando se usen.
  18. Corta secciones de 4 μm con un micrótomo.
  19. Coloque las secciones cortadas en portaobjetos y séquelas en un horno a 37 ° C durante 24 h.
  20. Las diapositivas están listas para su uso. Guárdelos en RT hasta que se realice la tinción histológica de H&E o la tinción de reacción inmunohistoquímica (tipo antígeno-anticuerpo).
    1. Para la tinción inmunohistoquímica, seleccionar los anticuerpos de interés (ya sea para el estudio de proteínas TJ como la ocludina o para la activación, migración y diferenciación de monocitos) y detectar la expresión (mediante tinción) utilizando kits comerciales.
    2. Del mismo modo, mida la mucosidad con el kit de tinción de azul alcián y ácido peryódico-Schiff (PAS).
    3. Cuantificar las proteínas TJ teñidas de interés, como la ocludina, calculando el porcentaje de píxeles positivos en las micrografías tomadas del microscopio.
    4. Analice las imágenes de las células utilizando un software de análisis de imágenes (por ejemplo, el software ImageJ2 [Wayne Rasband, versión 2.9.0/1.53t]).
      1. Para realizar el análisis de los píxeles, procese las imágenes digitales a 300 píxeles/pulgada y conviértalas a 8 bits. A continuación, procesa las imágenes binarias mediante el plugin Color Deconvolution para analizar la tinción de la proteína de interés, en este caso, la tinción roja permanente de la ocludina.
      2. Guarde la imagen seleccionada como un tiff y sométala a un procedimiento de "limpieza" para eliminar artefactos con un editor de gráficos (por ejemplo, Adobe PhotoshopCC [versión 20.0.4]).
      3. A partir de entonces, mida todos los campos de interés con la aplicación Analyze Particle of ImageJ2 e informe de los datos como el número de píxeles.
        NOTA: Cada experimento debe realizarse por triplicado con tres campos de réplica internos analizados para cada réplica. Para cuantificar la mucosidad, se puede aplicar el mismo principio de medición de los píxeles a las imágenes tomadas de las mucinas neutras teñidas de púrpura magenta y de la mucina ácida teñida de azul brillante, respectivamente.

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Representative Results

El primer aspecto importante es determinar la aceptabilidad de la mucosa intestinal equivalente básica en 3D con fines experimentales. Esto se realiza con la tinción más utilizada en los laboratorios de histología e histopatología, a saber, la hematoxilina (tiñe el material nuclear de color azul-púrpura intenso) y la eosina (tiñe el material citoplasmático de diferentes tonos de rosa). La tinción H&E se realiza primero en un control no tratado, que se cultiva en las mismas condiciones y plazos que los tratamientos experimentales. A partir de la visualización del patrón, la forma y la estructura de las células, el éxito de este sistema modelo de células intestinales está determinado por las células Caco-2 que forman una monocapa apretada y regular por encima de la lámina propia rica en matriz extracelular (MEC) después de 5 días (Figura 1A). Ejemplos de sistemas modelo que se considerarían inaceptables para análisis posteriores incluyen aquellos que muestran un crecimiento excesivo con capas epiteliales desorganizadas, como se muestra después de 10 días (Figura 1B). Un ejemplo adicional es una capa epitelial demasiado gruesa y desorganizada (Figura 1C), causada por la siembra de un exceso de células Caco-2 o por una incubación excesiva. La malformación (Figura 1D), atribuible a células de siembra que no estaban en una fase activa de proliferación, o a problemas en la preparación de la lámina propia o durante la fijación con parafina (las células se desprendieron o arruinaron), es también un ejemplo de una mucosa intestinal reconstruida inaceptable. Igualmente inaceptable es la falta de formación de capas epiteliales (Figura 1E), indicativa de la siembra de muy pocas células Caco-2 o problemas en la preparación de la lámina propia. Utilizando equivalentes intestinales 3D aceptables, a partir de los cuales se pueden generar múltiples secciones, se pueden investigar varios parámetros a partir de un solo experimento.

De los diversos parámetros que se pueden analizar, se puede visualizar la integridad de la barrera en respuesta a los inductores proinflamatorios, y las proteínas TJ se tiñen y cuantifican y se comparan con los sistemas modelo de control no tratados. Aquí demostramos el efecto proinflamatorio de 40 μg/mL de proteína total de trigo de una fuente de trigo duro con un alto contenido de gluten7, tanto en la integridad celular como en el contenido de proteína ocludina TJ (Figura 2A). Utilizando la tinción histológica de H&E, el sistema del modelo de control muestra que las células columnares de Caco-2 forman una monocapa compacta y regular. Por el contrario, se demostró que el efecto de la muestra de proteína que contenía gluten causaba una alteración de la monocapa, con más tinción de eosina inespecífica (Figura 2A). Además, se puede medir el grosor de la capa epitelial y se ha demostrado que se reduce significativamente después de la exposición al gluten proinflamatorio (Figura 2A,B). Utilizando un anticuerpo contra la ocludina (conjugado con tinción de cromógeno rojo), se pudo visualizar y cuantificar la proteína ocludina. Se evidenció un contenido significativamente mayor de proteína ocludina en el grupo control en comparación con la mucosa intestinal expuesta a la proteína del gluten durante 24 h (Figura 2A,C).

Los equivalentes intestinales compuestos por un componente inmune (representado por monocitos U937) también son ideales para investigar los efectos de los inductores proinflamatorios en la activación, migración y diferenciación de monocitos en macrófagos. Una vez más, utilizando 40 μg/mL de proteína total de trigo extraída de una fuente de trigo con un alto contenido de gluten, la activación proinflamatoria de los monocitos U937 en la lámina propia fue evidente a partir de la tinción rápida de CD14 acoplada al rojo (Figura 3A). La activación se detecta a partir del aumento de la expresión de esta glicoproteína de membrana teñida de rojo en monocitos y macrófagos. También se detectó un aumento de la proteína CD14 con el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que se tiñe de verde bajo inmunofluorescencia. La migración se evidenció a partir de la presencia de células U937 activadas cerca de la monocapa Caco-2. Donde la monocapa se había roto, se demostró que las células U937 habían entrado dentro de la monocapa de células Caco-2 (Figura 3A). No hubo evidencia de migración de monocitos teñidos con CD14 en el grupo control (Figura 3A). La diferenciación de los monocitos en macrófagos es identificable a partir del marcador CD11b. No se evidenció tinción de CD11b en el grupo control con cromógeno rojo o FITC (Figura 3B). En cambio, en los tejidos expuestos al gluten, se observaron macrófagos CD11b tanto en la lámina propia rica en MEC como dentro de la monocapa de Caco-2 rota (Figura 3B).

Utilizando LPS para simular la inflamación intestinal, aquí mostramos que también es posible utilizar este sistema modelo para investigar la mucina ácida y los mucopolisacáridos producidos por las células Caco-2 en el control no tratado y en el tratamiento con LPS, respectivamente (Figura 4A). Usando azul alcián y tinción PAS, la mucosidad ácida se tiñe de azul brillante y las mucinas neutras se tiñen de púrpura-magenta, respectivamente. La extensión de la tinción de moco se puede cuantificar de manera similar y se muestra que se induce significativamente bajo una provocación de LPS de 1 ng/mL (Figura 4B). Además, antes de la fijación, se puede retirar el medio para investigar la producción de citoquinas proinflamatorias. Aunque se pueden medir numerosas citocinas excretoras, en este caso en particular, se seleccionó la midquina (MDK). El MDK es un marcador inflamatorio endógeno inducido por la vía del factor de transcripción, factor nuclear kappa-light-chain-enhancer de las células B activadas (NF-κB), y también se asocia con enfermedades inflamatorias de las células intestinales15. Bajo el desafío de LPS, MDK se induce significativamente en comparación con el control (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Equivalentes intestinales 3D de control no tratados. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de equivalentes intestinales 3D de control no tratados (cocultivos Caco-2 / U937 / L929) durante 24 h como verificación de la eficacia del modelo básico de mucosa intestinal 3D con fines experimentales. (A) Se compara un modelo experimental aceptable con modelos inaceptables, que muestran (B) crecimiento epitelial excesivo y capas desorganizadas después de 10 días, (C) grosor epitelial excesivo y desorganización, (D) malformación y (E) ausencia de capa de células epiteliales. La barra de escala en cada imagen es igual a 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Equivalentes intestinales 3D tratados. (A) Tinción de hematoxilina y eosina (H&E), y expresión de ocludina de equivalentes intestinales 3D (cocultivos Caco-2 / U937 / L929) expuestos durante 24 h a 40 μg / mL de proteína total de una mezcla de trigo moderno con alto contenido de gluten en comparación con el control (CTRL). La barra de escala en cada imagen es igual a 50 μm. (B) Cuantificación del espesor de las células de Caco-2 y (C) tinción de cromógeno rojo oclusivo. Las diferencias significativas se determinaron mediante varianza de una vía (ANOVA) y se representaron como *** 0,0001< P < 0,001. Los puntos negros representan el número de réplicas. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Truzzi et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Tinción de CD14 y CD11B. Tinción con CD14 de monocitos U937 y macrófagos diferenciados CD11B U937 en equivalentes intestinales 3D (cocultivos Caco-2/U937/L929) expuestos a proteínas no añadidas (control [CTRL]) ni a 40 μg/mL de proteína total de una mezcla de trigo moderno con alto contenido de gluten después de un período de 24 h. Para la tinción de CD14 y CD11b, se utilizó el rojo rápido como cromógeno y los núcleos se contratiñeron con eosina. La barra de escala en cada imagen es igual a 20 μm. También se mostró tinción de CD14 y CD11b con isotiocianato de fluoresceína (verde) bajo inmunofluorescencia. Los núcleos se contratiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La barra de escala de cada imagen es igual a 50 μm. Las flechas indican la presencia de monocitos (células CD14 positivas) y macrófagos (células CD11b positivas). Esta figura ha sido adaptada con permiso de Truzzi et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y expresión de moco a partir de la tinción con azul alcián/tinción de Schiff con ácido peryódico (PAS). (A) Células de Caco-2 en equivalentes intestinales 3D básicos (cocultivos de Caco-2 / U937 / L929) después de 24 h en los sistemas modelo de mucosa intestinal equivalentes no tratados y reconstruidos expuestos a lipopolisacáridos de 1 ng/mL. La barra de escala en cada imagen es igual a 50 μm. (B) La cuantificación de la expresión de moco se determinó mediante varianza de un factor (ANOVA) con significación informada como **** P < 0.0001. Los puntos negros representan el número de réplicas. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Truzzi et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Expresión de Midkine. Expresión de midkine en el medio de equivalentes intestinales 3D (cocultivos Caco-2 /U937/L929) después de 24 h en los sistemas control no tratado (CTRL) y modelo de mucosa intestinal expuestos a lipopolisacáridos de 1ng/mL. La cuantificación de la expresión de midkine se determinó mediante varianza de un factor (ANOVA) con una significancia informada como **** P < 0.0001. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Truzzi et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Diagrama esquemático que representa la construcción y el uso experimental de los equivalentes intestinales, así como la fijación y el análisis microscópico de los parámetros de las secciones de tejido. El diagrama esquemático resume la construcción de los equivalentes intestinales y los posibles tratamientos experimentales que se pueden administrar a estos modelos. La generación de múltiples secciones de tejido a partir de un solo experimento permite el análisis de numerosos aspectos estructurales e inmunológicos de la mucosa intestinal, como se ilustra en la Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruida que se presenta aquí (Figura 6) combina la complejidad fisiológica (cultivos celulares 3D más relevantes desde el punto de vista fisiológico que contienen una monocapa de Caco-2 con un soporte de lámina propia rica en MEC que contiene fibroblastos y monocitos) con la simplicidad experimental (utilizando líneas celulares humanas comerciales para producir un sistema estandarizado y fácilmente repetible)13. Como tal, este sistema modelo se considera una alternativa adecuada a los modelos murinos destinados a evaluar el efecto de posibles medicamentos/componentes alimentarios sobre la integridad de la barrera intestinal. En este sentido, artículos anteriores corroboran la eficacia del modelo de cultivo celular actual en el ensayo tanto de compuestos potencialmente beneficiosos (más dependencia de la dosis) como de componentes alimentarios nocivos 7,16,17. Además, se pueden añadir LPS o reactivos proinflamatorios alternativos (ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico o sulfato de dextrano sódico) al modelo actual de mucosa intestinal para simular los síntomas de la EII. De este modo, es potencialmente posible estudiar la etiología de las enfermedades intestinales tanto desde el punto de vista estructural como desde la expresión de citoquinas, como la MDK proinflamatoria, que es un marcador de EII15. Este sistema modelo básico también tiene un potencial de detección de drogas para la población en general. Aunque el sistema modelo es fisiológicamente más complejo que los modelos 2D13,14, las limitaciones en la reproducción de la fisiología humana compleja incluyen la ausencia tanto de un sistema microfluídico (perfusión fluídica de un suministro continuo de nutrientes y eliminación de productos de desecho, así como de estímulos mecánicos)8,14 como del microbioma (evaluación de las interacciones huésped-microbioma en enfermedades intestinales)8, 14.

La ventaja de utilizar el presente modelo básico de mucosa intestinal en 3D en combinación con la inclusión en parafina para la evaluación microscópica de la luz de la integridad de la barrera epitelial es que se pueden realizar varias secciones de tejido a partir de un solo experimento, lo que permite el análisis de numerosos parámetros. La resistencia eléctrica transepitelial (TEER)3 es un método comúnmente utilizado para evaluar la integridad de la barrera intestinal y se ha utilizado juntocon estudios de permeabilidad macromolecular3,18, así como estudios ampliamente divulgados sobre la evaluación de la expresión de la proteína TJ en Western blot.  La evaluación de Western blot proporciona información cuantitativa sobre los cambios generales en la expresión de proteínas, y TEER sirve como una medida cuantitativa de la integridad de la barrera. En cambio, la evaluación microscópica proporciona una herramienta valiosa para la visualización cualitativa y la evaluación de los cambios e interacciones locales de las proteínas18.

La evaluación microscópica de un modelo con un componente inmune permite la visualización de respuestas inmunes, como la diferenciación de monocitos en macrófagos y la migración de monocitos activados en la MEC, como se demuestra aquí mediante la tinción de CD14 y CD11b. La identificación se puede realizar mediante inmunohistoquímica y/o tinción con inmunofluorescencia en secciones individuales de tejido, como se mostró para CD14 y CD11b en la Figura 3. La inmunohistoquímica permite la visualización estructural del tejido mucosa intestinal reconstruido en su conjunto. Además, es posible identificar tanto los núcleos como el citoplasma en las células. Por el contrario, la inmunofluorescencia confocal no permite ver el tejido como un todo (solo los marcadores de interés y los núcleos teñidos con DAPI). Sin embargo, proporciona una imagen muy limpia donde se elimina el color de fondo. La ventaja de esto es que permite una mayor precisión en la evidencia de la positividad o negatividad de los marcadores y, como tal, el cálculo de cualquier diferencia en la intensidad del color (por ejemplo, un marcador que se expresa más en una celda que en otra). Potencialmente, el grado de migración de los monocitos CD14 desde el interior de la lámina propia a la monocapa de Caco-2 también podría estimarse a partir de múltiples imágenes replicadas tomadas en varios puntos de tiempo. No obstante, la evidencia de inflamación fue evidente por la presencia de células teñidas con CD14 y CD11b.

La mayoría de los laboratorios utilizan un rango de 20 a 40 μg de proteína total para la Western blot19. La cuantificación de numerosas proteínas de unión gap (ocludina, claudina, zonulina y E-caderina) se puede realizar mediante tinción inmunohistoquímica y/o fluorescente en secciones individuales de tejido, lo que requiere respectivamente una cantidad significativamente menor de proteína. Al mismo tiempo, a partir del mismo experimento, también se puede visualizar la integridad de la capa epitelial en respuesta a los compuestos a partir del patrón, la forma y la estructura de las células con tinción de H&E.

La eficacia de una mucosa intestinal básica reconstruida en 3D para su uso en la tinción de la producción de moco, las proteínas TJ y las proteínas producidas a partir de respuestas inmunitarias depende de la superación de los pasos críticos, particularmente en la construcción del sistema modelo y durante la fijación del tejido.  En cuanto a la construcción del modelo, es fundamental utilizar la confluencia correcta y sembrar el número correcto de células Caco-2 (indicado por las notas del protocolo), respectivamente. Demasiadas células o una confluencia incorrecta darían lugar a una capa epitelial gruesa y desorganizada. En cambio, un número insuficiente de células daría lugar a una reducción o a la ausencia de formación de capas epiteliales. Igualmente fundamental en la siembra es la correcta confluencia celular y el número de células L929 y U937 en la MEC, así como el correcto manejo del colágeno durante la preparación. El exceso de células o la polimerización rápida del colágeno darían lugar a una MEC compacta y malformada, lo que a su vez afectaría a la estructura de las células epiteliales anteriores. Del mismo modo, muy pocas células L929 formadoras de colágeno darían lugar a una consistencia incorrecta de la MEC, mientras que muy pocos monocitos U937 no favorecerían una respuesta inmunitaria. También es importante que las células se utilicen para la experimentación después de 5 días, ya que una incubación prolongada daría lugar a un crecimiento celular excesivo que daría lugar a una capa epitelial compacta. Además, dado que el presente diseño carece de un sistema microfluídico y es representativo de un modelo celular intestinal estático, para favorecer la liberación de moléculas y el crecimiento y estimulación de las células, es muy importante que el medio se cambie cada día. En cuanto al protocolo de fijación, la fase de aclaramiento es crítica y dado que el tiempo necesario para que los tejidos se vuelvan transparentes en parafina puede variar, cada sistema de la mucosa intestinal debe ser observado de cerca durante esta fase. A lo largo del procedimiento de fijación, se debe tener cuidado al manipular estos modelos para evitar dañarlos.

En conclusión, siempre que se respete estrictamente los puntos críticos en la construcción y fijación de los equivalentes intestinales básicos en 3D, los modelos pueden proporcionar numerosas secciones de tejido para la evaluación de múltiples parámetros en el cribado farmacéutico y los estudios de toxicidad.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Gracias a la Fundación Umberto Veronesi por una beca de apoyo al trabajo de los investigadores.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue/PAS kit ScyTek Laboratories, Inc. APS-1, APS-2 kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solution Thermo Fisher 15250061 cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells ATCC ATCC HTB-37 cell line
Citro-Histo-Clear Limonene based Histoline laboratories R0050CITRO reagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO 11965092 cell colture reagent
Embedding Center Histoline laboratories TEC2900 instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO A5256701 cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 12350039 cell colture reagent
Human Midkine ELISA kit Cohesion Biosciences CEK1270 kit ELISA
Inverted microscope Eclipse Ts2, Nikon MFA34100 microscope
L929 mouse fibroblasts ATCC ATCC ®-CCL1 cell line
LC3-II Novus Biologicals NB910-40752SuperNovusPack antibody
L-Glutamine GIBCO A2916801 cell colture reagent
Occludin Novus Biologicals NBP1-87402 antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C Histoline laboratories R0040 PLUS instrument for paraffin embedding
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
rat tail collagen type I GIBCO A1048301 cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) GIBCO 21870076 cell colture reagent
Sodium pyruvate GIBCO 11360070 cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher TF-CACC2FL cell counting instrument
Transwell Costar Corning 3413 plastic for cell colture
Trypsin GIBCO 15090046 cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line ATCC ATCC CRL-1593.2 cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit ScyTek Laboratories, Inc. AMH080 kit for immunohistochemical staining

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References

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Truzzi, F., Dilloo, S., Chang, X., Whittaker, A., D'Amen, E., Dinelli, G. Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component. J. Vis. Exp. (199), e65484, doi:10.3791/65484 (2023).

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