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Biology

Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

Summary

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

Abstract

Il y a eu une augmentation de l’utilisation de modèles intestinaux in vivo et in vitro pour étudier la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales, pour le criblage pharmacologique de substances potentiellement bénéfiques et pour les études de toxicité sur des composants alimentaires potentiellement nocifs. Il est important de noter qu’il existe actuellement une demande pour le développement de modèles in vitro à base de cellules pour remplacer les modèles animaux. Ici, un protocole pour un modèle de base d’équivalent intestinal tridimensionnel (3D) de « tissu sain » utilisant des lignées cellulaires est présenté avec le double avantage d’offrir à la fois une simplicité expérimentale (système standardisé et facilement reproductible) et une complexité physiologique (entérocytes Caco-2 avec une composante immunitaire de soutien des monocytes U937 et des fibroblastes L929). Le protocole comprend également l’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes, offrant ainsi l’avantage d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience. Des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) montrant les cellules cylindriques Caco-2 formant une monocouche serrée et régulière dans les traitements témoins sont utilisées pour vérifier l’efficacité du modèle en tant que système expérimental. En utilisant le gluten comme composant alimentaire pro-inflammatoire, les paramètres analysés à partir des coupes comprennent une épaisseur de monocouche réduite, ainsi qu’une perturbation et un détachement de la matrice sous-jacente (H & E), une diminution de l’expression de la protéine de jonction serrée comme le montre la coloration à l’occludine (quantifiable statistiquement) et l’activation immunitaire des cellules U937 migrantes, comme en témoigne la coloration en grappe de différenciation 14 (CD14) et la différenciation liée à CD11b en macrophages. Comme le montre l’utilisation de lipopolysaccharides pour simuler l’inflammation intestinale, des paramètres supplémentaires qui peuvent être mesurés sont l’augmentation de la coloration du mucus et l’expression des cytokines (telles que la midkine) qui peuvent être extraites du milieu avant la fixation. Le modèle de base tridimensionnel (3D) de la muqueuse intestinale et les coupes fixes peuvent être recommandés pour les études de l’état inflammatoire et de l’intégrité de la barrière avec la possibilité d’analyser plusieurs paramètres visuels quantifiables.

Introduction

La barrière épithéliale intestinale, une paroi interne d’une cellule d’épaisseur contenant différents types de cellules épithéliales, constitue la première barrière défensive physique ou interface entre le milieu extérieur et le milieu interne du corps 1,2. Les entérocytes de type cylindrique constituent le type de cellules épithéliales le plus abondant. Ceux-ci sont responsables du maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale grâce à des interactions entre plusieurs composants de la barrière, y compris les jonctions serrées (TJ), jouant un rôle important dans le resserrement de la barrière 1,3. La structure TJ est constituée de protéines de plaque intracellulaire, telles que les occlusions zonules (ZO) et la cinguline, qui coopèrent avec des protéines transmembranaires, notamment les occlusines, les claudines et les molécules d’adhésion jonctionnelle (JAM) qui forment une structure en forme de fermeture éclair reliant étroitement les cellules voisines 3,4. Les protéines transmembranaires régulent la diffusion paracellulaire passive des petits composés et excluent les grosses molécules toxiques.

Les composés alimentaires potentiellement toxiques et les contaminants alimentaires stimulent la production de cytokines inflammatoires qui perturbent la perméabilité épithéliale, activant les cellules immunitaires et provoquant une inflammation chronique des tissus intestinaux 5,6,7. En revanche, divers composés phytochimiques antioxydants et anti-inflammatoires ont été signalés pour réduire l’expression des cytokines inflammatoires et améliorer l’intégrité de la barrière intestinale TJ grâce à la restauration de l’expression et de l’assemblage de la protéine TJ 4,6,8. Par conséquent, la régulation de l’intégrité de la barrière épithéliale par des composés bénéfiques et nocifs a vu une augmentation de l’utilisation de modèles in vivo et in vitro visant à imiter la barrière intestinale pour le dépistage pharmaceutique et les études de toxicité. Ceci est particulièrement pertinent compte tenu de l’intérêt croissant pour la compréhension de la physiopathologie des maladies intestinales de l’intestin (MICI), de l’entérocolite nécrosante et du cancer, qui peut être simulée dans les modèles expérimentaux 8,9,10.

Il y a eu une demande pour le développement de modèles in vitro cellulaires afin d’atteindre l’objectif des « 3R » dans l’expérimentation animale. Il s’agit notamment de solutions de remplacement à l’utilisation d’animaux, de la réduction du nombre d’animaux utilisés et de l’amélioration de l’adoption de méthodes qui atténuent la détresse 11,12,13. De plus, les mécanismes moléculaires, cellulaires et physiologiques sous-jacents entre les modèles humains et murins (les rongeurs étant l’espèce la plus utilisée) sont distincts, ce qui conduit à une controverse concernant l’efficacité des modèles murins en tant que prédicteurs des réponses humaines12,13. Parmi les nombreux avantages des modèles de lignées cellulaires humaines in vitro, citons l’expérimentation restreinte à la cible, l’observation directe et l’analyse continue13.

Les monocouches de type unicellulaire dans les cultures bidimensionnelles (2D) ont servi de modèles puissants. Cependant, ceux-ci ne peuvent pas reproduire avec précision la complexité physiologique des tissus humains 8,13,14. En conséquence, des systèmes de culture 3D sont en cours de développement avec des améliorations toujours croissantes pour récapituler la complexité physiologique des tissus intestinaux sains et malades en tant que boîtes à outils d’évaluation des risques de nouvelle génération13,14. Ces modèles comprennent des échafaudages Transwell 3D avec diverses lignées cellulaires, des cultures d’organoïdes et des dispositifs microfluidiques (intestin sur puce) utilisant à la fois des lignées cellulaires et des organoïdes (dérivés de tissus sains et malades)8,13,14.

Le protocole équivalent intestinal 3D « tissu sain » présenté dans la présente étude était basé sur la recherche d’un équilibre entre la complexité physiologique et la simplicité expérimentale13. Le modèle est représentatif d’un échafaudage Transwell 3D, composé de trois lignées cellulaires (entérocytes [la lignée Caco-2 de référence de l’adénocarcinome du côlon] avec une composante immunitaire de soutien [monocytes U937 et fibroblastes L929]), constituant un système standardisé et facilement reproductible applicable au criblage préliminaire de molécules alimentaires d’intérêt sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale et la réponse immunitaire. Le protocole comprend l’enrobage de paraffine pour l’évaluation microscopique de l’intégrité de la barrière épithéliale à l’aide d’équivalents intestinaux fixes. L’avantage de l’approche actuelle est qu’il est possible de colorer de nombreuses sections des tissus intégrés pour plusieurs paramètres à partir d’une seule expérience.

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Protocol

1. Préparation du modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite en 3D

REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué dans une hotte à flux laminaire stérile. Toutes les étapes de la procédure impliquant l’utilisation de l’incubateur cellulaire signifient que les cultures sont incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 (sauf indication contraire dans le protocole).

  1. Préparation préalable des lignées cellulaires utilisées dans le système modèle intestinal
    1. Semez des cellules de fibroblastes de souris L929 à une concentration de 5 x 105 dans 5 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 2 mM de L-glutamine, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep) dans un flacon F25 et cultivez-le dans un incubateur 4 jours avant la construction des modèles intestinaux. Après 48 h, retirer le milieu à l’aide d’une pipette. Ajouter ensuite le milieu frais (5 ml) et incuber les cellules pendant 48 h.
      REMARQUE : Les cellules doivent être confluentes à 80% avant d’être utilisées.
    2. Semez des cellules Caco-2 (concentration de 2 x 106) dans 10 mL de milieu DMEM (avec 10 % de FBS et 1 % de Pen-Strep) dans un flacon de cellules F75 et cultivez-les dans un incubateur 4 jours avant la construction du modèle de muqueuse intestinale. Après 48 h, changer le milieu comme décrit à l’étape 1.1.1 et poursuivre l’incubation pendant 48 h jusqu’à une confluence de 80 %.
      NOTE : Les cellules doivent être dans une phase de prolifération active : ni trop clairsemées, ni trop confluentes. Une confluence de 50 à 60 % est recommandée. Les cellules ne doivent pas être semées la veille de la réalisation du modèle car cela pourrait ralentir la capacité proliférative des cellules, qui ne s’enracinerait alors pas parfaitement dans le modèle 3D reconstruit.
    3. Ajouter les cellules U937 qui se développent en suspension (concentration de 1 x 106) à 10 mL de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenant 2 mM de L-glutamine, 1 % de pyruvate de sodium, 10 % de FBS et 1 % de Pen-Strep) dans un flacon de cellules F75 2 jours avant la mise en place du modèle, et placer dans un incubateur pendant 48 h.
  2. Préparation des plaquettes de co-culture Transwell
    1. Choisissez une plaque à 24 puits contenant des inserts avec des filtres de 0,4 μm.
      REMARQUE : Le filtre de 0,4 μm est un choix standard dans les études sur le transport des médicaments. Les tailles de filtre de 3 μm et 8 μm ne sont pas recommandées pour éviter d’éventuelles pertes de cellules intégrées au collagène.
    2. À l’aide d’une pipette, hydrater les filtres Transwell (ci-après appelés inserts membranaires) avec 500 μL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks en dessous et au-dessus de l’insert filtrant.
    3. Fermez la plaque multi-puits et placez-la dans un incubateur pendant au moins 2 h.
      REMARQUE : Les inserts de membrane peuvent rester dans le HBSS jusqu’à 24 h. Cette opération peut être effectuée la veille de la construction du modèle. Il est important que les inserts membranaires soient complètement hydratés et que le filtre ne se dessèche pas, car cela pourrait rendre plus difficile l’adhérence correcte de l’échantillon.
    4. Retirez les plaques de l’incubateur après 2 h (ou 24 h). Aspirez soigneusement le HBSS par le haut et le dessous des inserts de membrane à l’aide d’une pipette et laissez-le sécher pendant 10 minutes.
  3. Préparation de la lame de collagène acellulaire du système de base du modèle intestinal 3D (JOUR 1)
    1. Préparez une solution de collagène acellulaire dans un tube stérile de 50 mL sur de la glace contenant les composants suivants dans le DMEM : 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 200 mM de L-glutamine, 1 % de bicarbonate de sodium et 1,35 mg/mL de collagène de queue de rat de type 1.
      REMARQUE : Tous ces composants doivent être conservés sur de la glace et ajoutés au DMEM avec des pointes de pipette refroidies. Le collagène de queue de rat de type 1 doit être ajouté en dernier car il polymérise avec l’augmentation de la température et du pH. La quantité de solution de collagène acellulaire préparée dépendra du nombre d’équivalents intestinaux nécessaires.
    2. Ajouter 250 μL de solution dans chaque insert de plaque (au-dessus du filtre à membrane) pour le nombre d’équivalents intestinaux sélectionnés et placer le couvercle sur la plaque multipuits. Laissez la solution de collagène polymériser à température ambiante (RT) sous la hotte à flux laminaire.
      REMARQUE : Outre le passage à une phase plus solide, la polymérisation est également évidente à partir d’un changement de couleur du jaune au rose. La polymérisation est généralement terminée en 10 à 15 minutes.
  4. Préparation, comptage cellulaire et ajout de cellules de fibroblastes (L929) et de monocytes (U937) au système modèle (JOUR 1)
    1. Retirez la culture cellulaire L929 (étape 1.1.1) de l’incubateur. À l’aide d’une pompe à vide, aspirez le milieu, remplacez-le par 5 mL de solution saline tampon phosphate stérile (PBS ; sans Ca ni Mg) et rincez les cellules.
    2. Aspirez le PBS à l’aide d’une pompe à vide. Ajouter 2 mL d’une solution de trypsine-EDTA préparée à l’avance (0,05 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA dans le PBS) et placer dans un incubateur pendant 3 à 5 minutes.
    3. Utilisez un microscope inversé (par exemple, un Eclipse Ts2, un Nikon) pour déterminer si les cellules se détachent de la surface d’adhérence. Si cela se produit, ajoutez immédiatement 2 mL de DMEM (contenant 10 % de FBS) pour bloquer la réaction de trypsine et rincez les cellules.
    4. Transférer la solution cellulaire dans un tube stérile de 15 mL et centrifuger à 645 x g pendant 5 min. À l’aide d’une pompe à vide, aspirer le surnageant.
      REMARQUE : Des précautions sont nécessaires pour ne pas perturber la granulé. L’effet du DMEM a été testé sur les cellules L929 et U937 et il n’a pas été démontré qu’il avait des effets néfastes sur la croissance.
    5. Ajouter 1 mL de DMEM à la pastille et suspendre les cellules.
      REMARQUE : Les cellules doivent être en suspension de manière homogène dans la solution.
    6. Retirez 20 μL des cellules dans le DMEM et ajoutez 20 μL de solution de bleu de trypan. Retirez 20 μL du mélange et évaluez la densité cellulaire au microscope à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire.
    7. Retirez la culture cellulaire U937 (étape 1.1.3) de l’incubateur. Centrifuger la solution cellulaire à 645 x g pendant 5 min. À l’aide d’une pompe à vide, aspirez le surnageant pour éviter de perturber la pastille.
    8. Suspendez les cellules dans 1 mL de RPMI. Comme pour les cellules L929, assurez-vous que les cellules sont en suspension de manière homogène dans la solution.
    9. De même, établissez la densité cellulaire comme indiqué à l’étape 1.4.6.
    10. Préparez une solution de collagène comme décrit à l’étape 1.3.1.
      NOTA : La quantité de solution à préparer doit tenir compte de 450 μL pour chaque insert (ou modèle).
    11. Préparer une solution de DMEM pour contenir un nombre de 50 000 cellules L929 et 15 000 cellules U937, respectivement, dans un volume de 50 μL pour chaque modèle équivalent intestinal à construire.
      REMARQUE : Le nombre de cellules est un facteur critique. Un trop grand nombre des deux types de cellules se traduirait par une lamina propria excessivement pleine de cellules qui ne seraient pas organisées de manière adéquate. Un nombre inférieur de fibroblastes (qui génèrent du collagène) se traduirait par une lamina propria moins compacte, tandis qu’un nombre trop faible de monocytes entraverait la réponse immunitaire aux stimuli. À condition que le nombre correct de cellules soit présent dans chaque aliquote de 50 μL, un volume total de 600 μL peut être préparé pour les 12 inserts filtrants présents dans chaque plaque de 24 puits.
    12. Ajouter chaque aliquote de 50 μL contenant les cellules à 450 μL de solution de collagène à l’étape 1.4.10. Mélanger.
    13. Recouvrir la lame propria de collagène acellulaire pré-enrobée avec 500 μL de solution cellulaire contenant du collagène pour chaque modèle.
      REMARQUE : Il est important d’ajouter rapidement les volumes à chaque insert, et à ce titre, il est conseillé de limiter le nombre de modèles de muqueuse intestinale reconstruite à 12 ou moins à la fois.
    14. Fermez la plaque et placez-la dans un incubateur pendant 2 h pour permettre à la solution de prendre.
  5. Préparation, comptage cellulaire et ajout de cellules épithéliales Caco-2 au modèle intestinal (JOUR 1)
    1. Retirez la culture cellulaire Caco-2 (étape 1.1.2) de l’incubateur. Répétez les procédures de l’étape 1.4.1 en utilisant 10 mL de PBS pour le rinçage préalable. Ajoutez ensuite 5 mL d’une solution trypsine-EDTA préparée à l’avance (0,05 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA dans du PBS sans Ca et sans Mg) et placez-la dans un incubateur pendant 5 à 8 minutes.
    2. Répétez les étapes 1.4.3 (mais en utilisant 5 mL de DMEM pour bloquer la réaction à la trypsine) jusqu’à 1.4.6 pour compter les cellules à l’aide de la chambre de comptage cellulaire.
    3. Préparez une solution de DMEM pour contenir 150 000 cellules de Caco-2 dans 50 μL.
      REMARQUE : Le nombre de cellules utilisées est un point critique. Au-delà de 150 000 cellules, il peut en résulter une couche épithéliale compacte et désorganisée, tandis qu’avec trop peu (moins de 100 000), les cellules ont du mal à se développer et ne recouvrent pas adéquatement la membrane basale, créant ainsi une couche épithéliale intestinale discontinue. Assurez-vous que les cellules sont bien suspendues. La pointe d’une pipette de 200 μL permet d’assurer une distribution homogène. Étant donné que 12 modèles peuvent être construits à tout moment, une solution cellulaire de 600 μL peut être préparée.
    4. Après les 2 h requises à l’étape 1.4.14, ajouter 50 μL de cellules Caco-2 en suspension dans le DMEM au milieu de chaque membrane basale. Fermez le couvercle de la plaque multipuits.
    5. Incuber sous la hotte à flux laminaire stérile pendant 10 min. Transférez ensuite dans l’incubateur pendant 30 min.
    6. Préparez une solution de DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de stylo/streptocoque.
      REMARQUE : Préparez une solution suffisante pour utiliser un volume de 1 ml par modèle.
    7. Ajouter 500 μL du milieu au-dessus du modèle reconstruit et 500 μL sous le filtre.
      REMARQUE : Des précautions sont nécessaires lors de l’ajout du milieu au-dessus du filtre pour éviter de détacher ou de stresser les cellules.
    8. Fermez le système de plaques multi-puits et placez-le dans l’incubateur.
  6. Préparation/formation et utilisation du modèle (JOUR 2 à JOUR 6)
    1. JOUR 2 : Retirez délicatement la solution au-dessus du modèle reconstruit et au-dessous du filtre à l’aide d’une pipette. Remplacez-les par 500 μL de DMEM frais (10 % FBS et 1 % de stylo/streptocoque) au-dessus et au-dessous du filtre, respectivement.
    2. JOUR 3 : Répétez comme ci-dessus à l’étape 1.6.1.
    3. JOUR 4 : Répétez comme ci-dessus à l’étape 1.6.1.
      REMARQUE : Ce modèle intestinal est un modèle cellulaire statique ; Par conséquent, pour favoriser la libération de molécules et la croissance et la stimulation des cellules, il est très important que le milieu soit changé tous les jours.
    4. JOUR 5 : À ce stade, le modèle est entièrement formé/développé. Utilisez ces modèles pour d’autres études.
      REMARQUE : Le meilleur moment pour utiliser le modèle est à 5 jours. Bien que les cellules puissent être maintenues dans un incubateur pendant de plus longues périodes, plus le temps passe, plus la probabilité que les cellules épithéliales se développent de manière incontrôlée est grande, ce qui entraîne une couche non organisée et compacte difficile à utiliser.
    5. À 5 jours, incuber les modèles avec des composants toxiques (gluten ou lipopolysaccharide [LPS]) ou bénéfiques (polyphénols) d’intérêt. Ajoutez-les à la partie supérieure du modèle reconstruit suspendu dans le milieu DMEM.
      REMARQUE : La concentration appropriée de chaque composant d’intérêt doit être calculée et mise en suspension dans un milieu DMEM. Des témoins non traités contenant uniquement du milieu DMEM doivent être mis en place pour la comparaison avec les modèles expérimentaux.
    6. Incuber les modèles témoins et expérimentaux pendant 24 h dans un incubateur.
    7. JOUR 6 : Retirez le milieu au-dessus et au-dessous du filtre à l’aide d’une pipette.
      REMARQUE : Le milieu peut être stocké pour des tests ultérieurs de type test immuno-enzymatique (ELISA) pour mesurer la libération de cytokines inflammatoires. À cette fin, le milieu doit être ajouté à des flacons stériles et stocké à -20 ° C pour une analyse plus approfondie.

2. Enrobage à la paraffine des modèles de muqueuse intestinale reconstruite

REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué sous une hotte chimique. Chaque étape et le temps alloué doivent être strictement respectés. Pour cette raison, il est important que tous les réactifs soient préparés à l’avance.

  1. Réglez la machine à paraffine à 58 °C pour qu’elle soit prête à l’emploi.
  2. Transférez les inserts de membrane sur des puits propres à l’aide d’une pince dans une plaque stérile à 24 puits.
  3. Ajouter 500 μL de formol tamponné à 37 % dans du PBS au-dessus du filtre et 1 mL sous le filtre. Fermez le couvercle et laissez-le sous la hotte chimique pendant 2 h à RT.
    REMARQUE : Comme alternative, le formol tamponné à 4% peut être utilisé à RT pendant 1 h.
  4. Retirez le formol et ajoutez la solution HBSS au-dessus et au-dessous du filtre. Retirez ensuite le HBSS.
  5. Détachez la lamina propria de l’insert de la membrane.
    REMARQUE : Les cellules de la muqueuse intestinale se détachent généralement très facilement de l’insert membranaire car elles ne sont pas attachées à cette dernière. De plus, les deux compartiments de l’échantillon (apical et basal) restent attachés, conservant la structure 3D. Si, pour une raison quelconque, ils ne se détachent pas facilement, il sera important d’utiliser une lame de scalpel jetable stérile pour retirer la muqueuse intestinale de l’insert membranaire. L’insert de membrane peut être coupé, ce qui le détache du plastique. Veillez à ne jamais toucher l’échantillon avec le scalpel. Le motif du retrait de l’insert membranaire des cellules enrobées de collagène est que ce filtre peut se détacher dans les phases ultérieures de fixation ou d’enrobage de paraffine, ce qui rend les comparaisons entre les modèles de muqueuse intestinale disproportionnées. De plus, les inserts de membrane à l’intérieur de la section encastrée ont une consistance différente, ce qui peut interférer avec la section.
  6. Placez les béchers de 100 ml sous la hotte chimique, chacun correctement étiqueté pour inclure un système modèle de muqueuse intestinale reconstruit à l’étude. Ajouter 25 mL d’ETOH à 35 % dans chaque bécher, puis ajouter la muqueuse intestinale reconstruite. Incuber pendant 10 min.
  7. Remplacer l’éthanol à 35 % par 25 mL d’éthanol à 50 % et incuber pendant 10 minutes.
  8. Remplacer l’éthanol à 50 % par 25 mL d’éthanol à 70 % et incuber pendant 10 minutes.
  9. Remplacer l’éthanol à 70 % par 25 mL d’éthanol à 80 % et incuber pendant 10 minutes.
  10. Remplacer l’éthanol à 80 % par 25 mL d’éthanol à 95 % et incuber pendant 10 minutes.
  11. Remplacer l’éthanol à 95 % par 25 mL d’éthanol à 100 % et incuber pendant 10 min.
  12. Remplacer l’éthanol à 100 % par un autre changement de 25 ml d’éthanol à 100 % et incuber pendant 10 minutes.
  13. Placez des béchers de 100 ml sous la hotte, chacun correctement étiqueté pour inclure un modèle à l’étude. Ajouter 50 mL de xylène ou un agent de clarification histologique pendant 10 à 20 minutes.
    REMARQUE : Histo-Clear (agent de nettoyage histologique) est recommandé car l’agent améliore la clarté et l’éclat des taches acidophiles. Le temps d’élimination peut varier d’un échantillon de muqueuse intestinale reconstruite à l’autre et doit être vérifié pour la transparence de l’apparence toutes les 2-3 minutes.
  14. Dès que les échantillons sont transparents, placez-les dans un porte-cassette métallique qui est ensuite immergé dans de la paraffine liquide à l’intérieur de la machine chauffée pendant 45 min.
  15. Changez la paraffine et laissez les échantillons à l’intérieur de la machine chauffée pendant 45 minutes supplémentaires.
  16. Retirez le porte-cassette de mouchoirs et placez-le sur de la glace pour qu’il refroidisse. Lorsque les blocs d’échantillons refroidis se détachent du support métallique, ils peuvent être refroidis à température ambiante.
  17. Stockez les blocs à RT.
    REMARQUE : Si l’objectif est de préparer les sections immédiatement, les blocs peuvent être placés à 4 ° C afin qu’ils soient bien refroidis lors de leur utilisation.
  18. Découpez des sections de 4 μm à l’aide d’un microtome.
  19. Placez les sections coupées sur des lames et séchez-les dans un four à 37 ° C pendant 24 h.
  20. Les diapositives sont prêtes à l’emploi. Conservez-les à l’hôpital jusqu’à ce que vous effectuiez une coloration histologique H&E ou une coloration de réaction immuno-histochimique (type antigène-anticorps).
    1. Pour la coloration immuno-histochimique, sélectionner les anticorps d’intérêt (soit pour l’étude des protéines TJ telles que l’occludine, soit pour l’activation, la migration et la différenciation des monocytes) et détecter l’expression (via la coloration) à l’aide de kits commerciaux.
    2. De même, mesurez le mucus à l’aide du kit de coloration au bleu Alcian et à l’acide périodique de Schiff (PAS).
    3. Quantifier les protéines TJ d’intérêt colorées, telles que l’occludine, en calculant le pourcentage de pixels positifs sur les micrographies prises au microscope.
    4. Analyser les images des cellules à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (p. ex., le logiciel ImageJ2 [Wayne Rasband, version 2.9.0/1.53t]).
      1. Pour effectuer l’analyse des pixels, traitez les images numériques à 300 pixels/pouce et convertissez-les en 8 bits. Ensuite, traitez les images binaires par le plugin Color Deconvolution pour analyser la coloration de la protéine d’intérêt, dans ce cas, la coloration rouge permanente de l’occludine.
      2. Enregistrez l’image sélectionnée au format tiff et soumettez-la à une procédure de « nettoyage » pour éliminer les artefacts à l’aide d’un éditeur graphique (par exemple, Adobe PhotoshopCC [version 20.0.4]).
      3. Par la suite, mesurez tous les champs d’intérêt avec l’application Analyser les particules d’ImageJ2 et rapportez les données sous forme de nombre de pixels.
        REMARQUE : Chaque expérience doit être réalisée en trois exemplaires, avec trois champs de répétition internes analysés pour chaque répétition. Pour quantifier le mucus, le même principe de mesure des pixels peut être appliqué aux images prises des mucines neutres colorées en violet-magenta et du mucus acide coloré en bleu vif, respectivement.

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Representative Results

Le premier aspect important est de déterminer l’acceptabilité de la muqueuse intestinale équivalente 3D de base à des fins expérimentales. Ceci est réalisé avec la coloration la plus largement utilisée dans les laboratoires d’histologie et d’histopathologie, à savoir l’hématoxyline (colore la matière nucléaire de couleur bleu-violet profond) et l’éosine (colore la matière cytoplasmique de différentes nuances de rose). La coloration H&E est d’abord réalisée sur un témoin non traité, qui est cultivé dans les mêmes conditions et dans les mêmes délais que les traitements expérimentaux. À partir de la visualisation du motif, de la forme et de la structure des cellules, le succès de ce système de modèle de cellules intestinales est déterminé par la formation par les cellules Caco-2 d’une monocouche serrée et régulière au-dessus de la lamina propria riche en matrice extracellulaire (MEC) après 5 jours (Figure 1A). Parmi les exemples de systèmes modèles qui seraient jugés inacceptables pour des analyses plus poussées, mentionnons ceux qui montrent une croissance excessive avec des couches épithéliales désorganisées, comme le montre le montre après 10 jours (figure 1B). Un autre exemple est une couche épithéliale trop épaisse et désorganisée (Figure 1C), causée soit par l’ensemencement de cellules Caco-2 en excès, soit par une incubation excessive. La malformation (Figure 1D), attribuable soit à l’ensemencement de cellules qui n’étaient pas en phase active de prolifération, soit à des problèmes de préparation de la lamina propria ou lors de la fixation à la paraffine (les cellules se sont détachées/ruinées), est également un exemple de muqueuse intestinale reconstruite inacceptable. Tout aussi inacceptable est l’absence de formation de la couche épithéliale (Figure 1E), ce qui indique l’ensemencement d’un trop petit nombre de cellules Caco-2 ou des problèmes dans la préparation de la lamina propria. À l’aide d’équivalents intestinaux 3D acceptables, à partir desquels plusieurs sections peuvent être générées, divers paramètres peuvent ensuite être étudiés à partir d’une seule expérience.

Parmi les différents paramètres qui peuvent être analysés, l’intégrité de la barrière en réponse aux inducteurs pro-inflammatoires peut être visualisée, et les protéines TJ colorées et quantifiées et comparées à des systèmes modèles de contrôle non traités. Nous démontrons ici l’effet pro-inflammatoire de 40 μg/mL de protéines de blé total provenant d’une source de blé dur à haute teneur en gluten7, à la fois sur l’intégrité cellulaire et sur la teneur en protéines d’occludine TJ (Figure 2A). À l’aide de la coloration histologique H&E, le système de modèle de contrôle montre que les cellules cylindriques Caco-2 forment une monocouche serrée et régulière. En revanche, il a été démontré que l’effet de l’échantillon de protéine contenant du gluten provoquait une perturbation de la monocouche, avec une coloration à l’éosine plus non spécifique (Figure 2A). De plus, l’épaisseur de la couche épithéliale peut être mesurée et il est démontré qu’elle est considérablement réduite après exposition au gluten pro-inflammatoire (Figure 2A,B). À l’aide d’un anticorps dirigé contre l’occludine (conjugué à la coloration chromogène rouge), la protéine occludine a pu être visualisée et quantifiée. Une teneur significativement plus élevée en protéine occludine était évidente dans le groupe témoin par rapport à la muqueuse intestinale exposée à la protéine de gluten pendant 24 h (Figure 2A,C).

Les équivalents intestinaux composés d’une composante immunitaire (représentée par les monocytes U937) sont également idéaux pour étudier les effets des inducteurs pro-inflammatoires sur l’activation, la migration et la différenciation des monocytes en macrophages. Encore une fois, en utilisant 40 μg/mL de protéines de blé totales extraites d’une source de blé à forte teneur en gluten, l’activation pro-inflammatoire des monocytes U937 dans la lamina propria a été mise en évidence par la coloration rapide au CD14 couplé au rouge (figure 3A). L’activation est détectée à partir de l’expression accrue de cette glycoprotéine membranaire colorée en rouge sur les monocytes et les macrophages. Une augmentation de la protéine CD14 a également été détectée avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), qui colore en vert sous l’immunofluorescence. La migration a été mise en évidence par la présence de cellules U937 activées à proximité de la monocouche Caco-2. Là où la monocouche s’était rompue, il a été démontré que les cellules U937 étaient entrées dans la monocouche cellulaire Caco-2 (Figure 3A). Il n’y avait aucun signe de migration des monocytes colorés par CD14 dans le groupe témoin (Figure 3A). La différenciation des monocytes en macrophages est identifiable à partir du marqueur CD11b. Aucune coloration CD11b n’a été mise en évidence dans le groupe témoin avec chromogène rouge ou FITC (Figure 3B). Au lieu de cela, dans les tissus exposés au gluten, des macrophages CD11b ont été observés à la fois dans la lamina propria riche en ECM et dans la monocouche de Caco-2 rompue (Figure 3B).

En utilisant le LPS pour simuler l’inflammation intestinale, nous montrons ici qu’il est également possible d’utiliser ce système modèle pour étudier la mucine acide et les mucopolysaccharides produits par les cellules Caco-2 dans le contrôle non traité et le traitement LPS, respectivement (Figure 4A). En utilisant le bleu Alcian et la coloration PAS, le mucus acide est coloré en bleu vif et les mucines neutres sont colorées en violet-magenta, respectivement. L’étendue de la coloration du mucus peut également être quantifiée et il est démontré qu’elle est induite de manière significative sous une provocation LPS de 1 ng/mL (Figure 4B). De plus, avant la fixation, le milieu peut être retiré pour étudier la production de cytokines pro-inflammatoires. Bien que de nombreuses cytokines excrétrices puissent être mesurées, dans ce cas particulier, la midkine (MDK) a été sélectionnée. MDK est un marqueur inflammatoire endogène induit par le facteur de transcription, facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer de la voie des lymphocytes B activés (NF-κB), et est également associé à des maladies inflammatoires des cellules intestinales15. Dans le cadre du défi LPS, la MDK est significativement induite par rapport au témoin (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Équivalents intestinaux 3D de contrôle non traités. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) d’équivalents intestinaux 3D témoins non traités (co-cultures Caco-2/U937/L929) pendant 24 h pour vérifier l’efficacité du modèle 3D de base de la muqueuse intestinale à des fins expérimentales. (A) Un modèle expérimental acceptable est comparé à des modèles inacceptables, montrant (B) une croissance épithéliale excessive et des couches désorganisées après 10 jours, (C) une épaisseur et une désorganisation épithéliales excessives, (D) une malformation et (E) aucune couche de cellules épithéliales. La barre d’échelle de chaque image est égale à 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Équivalents intestinaux 3D traités. (A) Coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) et expression de l’occludine d’équivalents intestinaux 3D (co-cultures Caco-2/U937/L929) exposées pendant 24 h à 40 μg/mL de protéines totales provenant d’un mélange de blé moderne à haute teneur en gluten par rapport au témoin (CTRL). La barre d’échelle dans chaque image est égale à 50 μm. (B) Quantification de l’épaisseur des cellules Caco-2 et (C) coloration chromogène rouge occlusine. Les différences significatives ont été déterminées par une variance à un facteur (ANOVA) et représentées par *** 0,0001< P < 0,001. Les points noirs représentent le nombre de répétitions. Cette figure a été adaptée avec la permission de Truzzi et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Coloration CD14 et CD11B. Coloration CD14 des monocytes U937 et des macrophages différenciés CD11B U937 dans des équivalents intestinaux 3D (co-cultures Caco-2/U937/L929) exposés à aucune protéine ajoutée (témoin [CTRL]) ou à 40 μg/mL de protéines totales provenant d’un mélange de blé moderne à haute teneur en gluten après une période de 24 h. Pour la coloration CD14 et CD11b, le rouge rapide a été utilisé comme chromogène et les noyaux ont été contre-colorés avec de l’éosine. La barre d’échelle dans chaque image est égale à 20 μm. La coloration CD14 et CD11b avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (vert) a également été montrée sous immunofluorescence. Les noyaux ont été contre-colorés avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). La barre d’échelle de chaque image est égale à 50 μm. Les flèches indiquent la présence de monocytes (cellules CD14 positives) et de macrophages (cellules CD11b positives). Cette figure a été adaptée avec la permission de Truzzi et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) et expression du mucus à partir de la coloration au bleu d’Alcian et à l’acide périodique de Schiff (PAS). (A) Cellules Caco-2 dans des équivalents intestinaux 3D basiques (co-cultures Caco-2 / U937 / L929) après 24 h dans les systèmes modèles de muqueuse intestinale équivalents non traités et reconstruits exposés à 1 ng / mL de lipopolysaccharide . La barre d’échelle dans chaque image est égale à 50 μm. (B) La quantification de l’expression du mucus a été déterminée par une variance à un facteur (ANOVA) avec une signification rapportée comme **** P < 0,0001. Les points noirs représentent le nombre de répétitions. Cette figure a été adaptée avec l’autorisation de Truzzi et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Expression de Midkine. Expression de midkine dans le milieu d’équivalents intestinaux 3D (co-cultures Caco-2 / U937 / L929) après 24 h dans les systèmes témoins non traités (CTRL) et les systèmes modèles de muqueuse intestinale exposés à 1 ng / mL de lipopolysaccharide . La quantification de l’expression de midkine a été déterminée par la variance à un facteur (ANOVA) avec une signification rapportée comme **** P < 0,0001. Cette figure a été adaptée avec l’autorisation de Truzzi et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Schéma de principe représentant la construction et l’utilisation expérimentale d’équivalents intestinaux, ainsi que la fixation et l’analyse microscopique des paramètres à partir de coupes de tissus. Le diagramme schématique résume la construction des équivalents intestinaux et les traitements expérimentaux possibles qui peuvent être administrés à ces modèles. La génération de plusieurs coupes de tissus à partir d’une seule expérience permet d’analyser de nombreux aspects structurels et immunitaires de la muqueuse intestinale, comme illustré dans les figures 1, 2, 3 et 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le système modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite présenté ici (Figure 6) combine la complexité physiologique (cultures cellulaires 3D plus pertinentes sur le plan physiologique contenant une monocouche Caco-2 avec un support de lamina propria riche en MEC contenant des fibroblastes et des monocytes) et la simplicité expérimentale (utilisation de lignées cellulaires humaines commerciales pour produire un système standardisé et facilement reproductible)13. En tant que tel, ce système modèle est considéré comme une alternative appropriée aux modèles murins visant à évaluer l’effet des médicaments/composants alimentaires potentiels sur l’intégrité de la barrière intestinale. À cet égard, des articles antérieurs confirment l’efficacité du modèle actuel de culture cellulaire dans le test à la fois de composés potentiellement bénéfiques (plus la dépendance à la dose) ainsi que de composants alimentaires nocifs 7,16,17. De plus, le LPS ou d’autres réactifs pro-inflammatoires (acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique ou sulfate de dextran sodique) peuvent être ajoutés au modèle actuel de muqueuse intestinale pour simuler les symptômes des MICI. Ce faisant, il est potentiellement possible d’étudier l’étiologie des maladies intestinales d’un point de vue structurel ainsi que de l’expression de cytokines, telles que la MDK pro-inflammatoire, qui est un marqueur de la MICI15. Ce système modèle de base a également un potentiel éventuel de dépistage des drogues pour l’ensemble de la population. Bien que le système modèle soit physiologiquement plus complexe que les modèles 2D13,14, les limites de la reproduction d’une physiologie humaine complexe comprennent l’absence à la fois d’un système microfluidique (perfusion fluidique d’un apport continu de nutriments et élimination des déchets ainsi que des stimuli mécaniques)8,14 et du microbiome (évaluation des interactions hôte-microbiome dans les maladies intestinales)8, Débloquer le niveau 14.

L’avantage d’utiliser le modèle de base de la muqueuse intestinale en 3D en combinaison avec l’enrobage de paraffine pour l’évaluation microscopique de l’intégrité de la barrière épithéliale est que plusieurs coupes de tissu peuvent être réalisées à partir d’une seule expérience, ce qui permet d’analyser de nombreux paramètres. La résistance électrique transépithéliale (TEER)3 est une méthode couramment utilisée pour évaluer l’intégrité de la barrière intestinale et a été utilisée en conjonction avec des études de perméabilité macromoléculaire 3,18, ainsi qu’avec des études largement rapportées sur l’évaluation par transfert Western de l’expression de la protéine TJ.  L’évaluation par transfert Western fournit des informations quantitatives sur les changements globaux dans l’expression des protéines, et le TEER sert de mesure quantitative de l’intégrité de la barrière. Au lieu de cela, l’évaluation microscopique fournit un outil précieux pour la visualisation qualitative et l’évaluation des changements et des interactions protéiques locaux18.

L’évaluation microscopique d’un modèle à composante immunitaire permet de visualiser les réponses immunitaires, telles que la différenciation des monocytes en macrophages et la migration des monocytes activés dans l’ECM, comme le montre ici la coloration CD14 et CD11b. L’identification peut être faite par immunohistochimie et/ou coloration par immunofluorescence sur des coupes de tissus individuelles, comme cela a été montré pour CD14 et CD11b dans la figure 3. L’immunohistochimie permet de visualiser la structure du tissu de la muqueuse intestinale reconstruite dans son ensemble. De plus, il est possible d’identifier à la fois les noyaux et le cytoplasme dans les cellules. En revanche, l’immunofluorescence confocale ne permet pas de voir le tissu dans son ensemble (seulement les marqueurs d’intérêt et les noyaux colorés par DAPI). Cependant, il fournit une image très propre où la couleur d’arrière-plan est éliminée. L’avantage est qu’il permet une plus grande précision dans la mise en évidence de la positivité ou de la négativité des marqueurs et, par conséquent, le calcul des différences d’intensité de couleur (par exemple, un marqueur qui s’exprime davantage dans une cellule que dans une autre). Potentiellement, l’étendue de la migration des monocytes CD14 de l’intérieur de la lamina propria vers la monocouche Caco-2 pourrait également être estimée à partir de multiples images répliquées prises à différents moments. Néanmoins, des signes d’inflammation étaient évidents à partir de la présence de cellules colorées CD14 et CD11b.

Une fourchette de 20 à 40 μg de protéines totales est utilisée par la majorité des laboratoires pour le western blot19. La quantification de nombreuses protéines de jonction lacunaire (occludine, claudine, zonuline et E-cadérine) peut être réalisée par coloration immunohistochimique et/ou fluorescente sur des coupes de tissus individuelles, nécessitant respectivement beaucoup moins de protéines. Parallèlement, à partir de la même expérience, l’intégrité de la couche épithéliale en réponse aux composés peut également être visualisée à partir du motif, de la forme et de la structure des cellules avec coloration H&E.

L’efficacité d’une muqueuse intestinale reconstruite en 3D de base pour une utilisation dans la coloration de la production de mucus, des protéines TJ et des protéines produites à partir des réponses immunitaires dépend du dépassement des étapes critiques, en particulier dans la construction du système modèle et lors de la fixation tissulaire.  En ce qui concerne la construction du modèle, l’utilisation de la confluence correcte et l’ensemencement du nombre correct de cellules Caco-2 (indiquées par les notes du protocole), respectivement, sont fondamentales. Un trop grand nombre de cellules ou une confluence incorrecte entraînerait une couche épithéliale épaisse et désorganisée. Au lieu de cela, trop peu de cellules entraîneraient une réduction ou une absence de formation de la couche épithéliale. La confluence cellulaire correcte et le nombre de cellules L929 et U937 dans l’ECM sont tout aussi fondamentaux lors de l’ensemencement, ainsi que la manipulation correcte du collagène pendant la préparation. Un excès de cellules ou une polymérisation rapide du collagène entraînerait une ECM compacte et malformée, ce qui aurait un impact sur la structure des cellules épithéliales situées au-dessus. De même, trop peu de cellules L929 formant du collagène entraîneraient une consistance incorrecte de l’ECM, tandis que trop peu de monocytes U937 ne favoriseraient pas une réponse immunitaire. Il est également important que les cellules soient utilisées pour l’expérimentation après 5 jours, car une incubation prolongée entraînerait une croissance cellulaire excessive résultant en une couche épithéliale compacte. De plus, étant donné que la conception actuelle n’a pas de système microfluidique et qu’elle est représentative d’un modèle cellulaire intestinal statique, pour favoriser la libération de molécules et la croissance et la stimulation des cellules, il est très important que le milieu soit changé tous les jours. En ce qui concerne le protocole de fixation, la phase de nettoyage est critique et étant donné que le temps nécessaire pour que les tissus deviennent transparents dans la paraffine peut varier, chaque système de muqueuse intestinale doit être observé de près pendant cette phase. Tout au long de la procédure de fixation, des précautions doivent être prises lors de la manipulation de ces modèles afin de ne pas les endommager.

En conclusion, à condition de respecter strictement les points critiques dans la construction et la fixation des équivalents intestinaux 3D de base, les modèles peuvent fournir de nombreuses coupes de tissus pour l’évaluation de multiples paramètres dans le criblage pharmaceutique et les études de toxicité.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Merci à la Fondation Umberto Veronesi pour une bourse de soutien aux travaux des chercheurs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcian Blue/PAS kit ScyTek Laboratories, Inc. APS-1, APS-2 kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solution Thermo Fisher 15250061 cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells ATCC ATCC HTB-37 cell line
Citro-Histo-Clear Limonene based Histoline laboratories R0050CITRO reagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) GIBCO 11965092 cell colture reagent
Embedding Center Histoline laboratories TEC2900 instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO A5256701 cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO 12350039 cell colture reagent
Human Midkine ELISA kit Cohesion Biosciences CEK1270 kit ELISA
Inverted microscope Eclipse Ts2, Nikon MFA34100 microscope
L929 mouse fibroblasts ATCC ATCC ®-CCL1 cell line
LC3-II Novus Biologicals NB910-40752SuperNovusPack antibody
L-Glutamine GIBCO A2916801 cell colture reagent
Occludin Novus Biologicals NBP1-87402 antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C Histoline laboratories R0040 PLUS instrument for paraffin embedding
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070063 cell colture reagent
rat tail collagen type I GIBCO A1048301 cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) GIBCO 21870076 cell colture reagent
Sodium pyruvate GIBCO 11360070 cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter Thermo Fisher TF-CACC2FL cell counting instrument
Transwell Costar Corning 3413 plastic for cell colture
Trypsin GIBCO 15090046 cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line ATCC ATCC CRL-1593.2 cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit ScyTek Laboratories, Inc. AMH080 kit for immunohistochemical staining

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References

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Truzzi, F., Dilloo, S., Chang, X., Whittaker, A., D'Amen, E., Dinelli, G. Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component. J. Vis. Exp. (199), e65484, doi:10.3791/65484 (2023).

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