Summary
여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.
Abstract
염증성 장 질환의 병태생리학을 연구하고, 잠재적으로 유익한 물질의 약리학적 스크리닝을 위해, 잠재적으로 유해한 식품 성분에 대한 독성 연구를 위해 생체 내 및 체외 장 모델의 사용이 증가하고 있습니다. 관련하여, 동물 모델을 대체하기 위한 세포 기반 in vitro 모델의 개발에 대한 현재 수요가 있습니다. 여기서, 세포주를 사용하는 기본적인 "건강한 조직" 3차원(3D) 장 등가 모델에 대한 프로토콜은 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 시스템)과 생리학적 복잡성(U937 단핵구 및 L929 섬유아세포의 지지 면역 구성 요소를 가진 Caco-2 장세포)을 모두 제공하는 두 가지 이점을 제공합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩도 포함되어 있어 단일 실험에서 여러 시각적 매개변수를 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편은 대조군 처리에서 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 Caco-2 원주 세포를 보여주는 데 사용되어 실험 시스템으로서 모델의 효능을 검증합니다. 글루텐을 전염증성 식품 성분으로 사용하여 단층 두께 감소, 기저 매트릭스(H&E)로부터의 파괴 및 분리, 오클루딘 염색에서 볼 수 있듯이 밀착 접합 단백질 발현 감소(통계적으로 정량화 가능), 분화 14(CD14) 염색 클러스터 및 대식세포로의 CD11b 관련 분화에서 입증된 U937 세포 이동의 면역 활성화가 절편에서 분석된 매개변수가 포함됩니다. 장 염증을 시뮬레이션하기 위해 지질다당류를 사용하여 알 수 있듯이 측정할 수 있는 추가 매개변수는 고정 전에 배지에서 추출할 수 있는 점액 염색 증가 및 사이토카인 발현(예: 미드키네)입니다. 기본적인 3차원(3D) 장 점막 모델 및 고정 절편은 여러 시각적 정량화 가능한 매개변수를 분석할 수 있는 가능성과 함께 염증 상태 및 장벽 무결성 연구에 권장될 수 있습니다.
Introduction
서로 다른 유형의 상피 세포를 포함하는 1 세포 두께의 내부 내막인 장 상피 장벽은 신체의 외부와 내부 환경 사이의 첫 번째 물리적 방어 장벽 또는 인터페이스를 구성합니다 1,2. 원주형 장세포는 가장 풍부한 유형의 상피세포를 구성합니다. 이들은 단단한 접합부(TJ)를 포함한 여러 장벽 구성 요소 간의 상호 작용을 통해 상피 장벽 무결성을 유지하는 역할을 하며, 장벽 강화에 중요한 역할을 합니다 1,3. TJ 구조는 조눌라 오클루덴스(zonula occludens, ZO) 및 싱귤린(cingulin)과 같은 세포내 플라크 단백질로 구성되며, 오클루딘(occludin), 클라우딘(claudin) 및 접합 접착 분자(junctional adhesion molecule, JAM)를 포함한 막관통 단백질과 협력하여 인접 세포를 단단히 연결하는 지퍼 모양의 구조를 형성합니다 3,4. 막관통 단백질은 작은 화합물의 수동 세포주위 확산을 조절하고 독성이 있는 큰 분자를 배제합니다.
잠재적으로 독성이 있는 식품 화합물 및 식품 오염 물질은 상피 투과성을 방해하고 면역 세포를 활성화하며 만성 장 조직 염증을 유발하는 염증성 사이토카인 생성을 자극합니다 5,6,7. 대조적으로, 다양한 항산화 및 항염증 파이토케미컬은 TJ 단백질 발현 및 조립 복원을 통해 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고 장내 TJ 장벽 무결성을 향상시키는 것으로 보고되었습니다 4,6,8. 따라서 유익한 화합물과 유해 화합물 모두에 의한 상피 장벽 무결성 조절은 제약 스크리닝 및 독성 연구를 위한 장 장벽을 모방하는 것을 목표로 하는 생체 내 및 시험관 모델 모두의 사용이 증가하는 것을 보았습니다. 이는 장 질환(IBD), 괴사성 장염 및 암의 병태생리학을 이해하는 데 대한 관심이 증가함에 따라 특히 관련이 있으며, 이는 실험 모델8,9,10에서 시뮬레이션할 수 있습니다.
동물 실험에서 "3R"의 목표를 달성하기 위해 세포 기반 in vitro 모델 개발에 대한 요구가 있었습니다. 여기에는 동물 사용에 대한 대체 대안, 사용되는 동물 수의 감소, 고통을 완화하는 방법 채택의 개선이 포함됩니다 11,12,13. 더욱이, 인간과 쥐 모델(설치류가 가장 널리 사용되는 종) 사이의 근본적인 분자, 세포 및 생리학적 메커니즘은 독특하여 인간 반응의 예측 변수로서 쥐 모델의 효능에 대한 논란을 불러일으킨다12,13. in vitro 인간 세포주 모델의 수많은 장점으로는 표적 제한 실험, 직접 관찰 및 연속 분석13이 있습니다.
2차원(2D) 배양에서 단세포형 단층은 강력한 모델 역할을 했습니다. 그러나 이들은 인체 조직의 생리학적 복잡성을 정확하게 재현할 수 없다 8,13,14. 그 결과, 3D 배양 시스템은 건강한 장 조직과 병든 장 조직 모두의 생리학적 복잡성을 차세대 위험 평가 도구 상자로 요약하기 위해 지속적으로 개선되어 개발되고 있습니다13,14. 이러한 모델에는 다양한 세포주를 가진 3D Transwell 스캐폴드, 오가노이드 배양 및 세포주와 오가노이드(건강한 조직과 병든 조직 모두에서 유래)를 모두 사용하는 미세유체 장치(intestine-on-chip)가 포함됩니다8,13,14.
본 연구에서 제시된 3D "건강한 조직" 장 등가 프로토콜은 생리학적 복잡성과 실험적 단순성 사이의 균형을 맞추는 것을 기반으로 했다13. 이 모델은 3개의 세포주(면역 성분[U937 단핵구 및 L929 섬유아세포]가 있는 장세포[대장 선암종 Caco-2 계열])로 구성된 3D Transwell 스캐폴드를 대표하며, 장 상피 장벽 무결성 및 면역 반응에 대한 관심 식이 분자의 예비 스크리닝에 적용할 수 있는 표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 구성합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물을 사용하여 상피 장벽 무결성의 광현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩이 포함됩니다. 현재 접근법의 장점은 단일 실험에서 여러 매개변수에 대해 묻힌 조직의 수많은 섹션을 염색할 수 있다는 것입니다.
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Protocol
1. 기본 3D 재구성 장 점막 모델 준비
알림: 전체 절차는 멸균 층류 후드에서 수행해야 합니다. 세포 인큐베이터 사용과 관련된 절차의 모든 단계는 배양액이 5%CO2 를 함유한 가습 분위기에서 37°C에서 배양됨을 의미합니다(프로토콜에 달리 명시되지 않는 한).
- 장 모델 시스템에 사용되는 세포주의 사전 준비
- F25 플라스크에 2mM L-글루타민, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 5mL에 5 x 105 농도의 L929 마우스 섬유아세포 세포를 종자하고 장 모델 제작 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48시간 후 피펫을 사용하여 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 배지(5mL)를 넣고 세포를 48시간 동안 더 배양합니다.
알림: 셀은 사용하기 전에 80% 합류해야 합니다. - F75 세포 플라스크에 10mL의 DMEM 배지(10% FBS 및 1% Pen-Strep 포함)에 Caco-2 세포(2 x 106 농도)를 종자하고 장 점막 모델 구축 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48시간 후 1.1.1단계에 설명된 대로 배지를 변경하고 48시간 동안 80%의 밀도로 추가로 배양합니다.
알림: 세포는 활성 증식 단계에 있어야 합니다: 너무 희박하지도 너무 합류하지도 않아야 합니다. 50-60% 합류가 권장됩니다. 모델을 만들기 전날에는 세포를 파종해서는 안 되는데, 이는 세포의 증식 능력을 늦출 수 있기 때문이며, 이는 재구성된 3D 모델에 완벽하게 뿌리를 내리지 못할 수 있기 때문입니다. - 현탁액(농도 1 x 106)에서 자라는 U937 세포를 10mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지(2mM L-글루타민, 1% 피루브산나트륨, 1% FBS 및 1% Pen-Strep 포함)에 75 mL를 추가하고 모델 설정 2일 전에 인큐베이터에 48시간 동안 넣습니다.
- F25 플라스크에 2mM L-글루타민, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 5mL에 5 x 105 농도의 L929 마우스 섬유아세포 세포를 종자하고 장 모델 제작 4일 전에 인큐베이터에서 배양합니다. 48시간 후 피펫을 사용하여 배지를 제거합니다. 그런 다음 신선한 배지(5mL)를 넣고 세포를 48시간 동안 더 배양합니다.
- Transwell 공동 배양 플레이트 인서트 준비
- 0.4μm 필터가 있는 인서트가 포함된 24웰 플레이트를 선택합니다.
참고: 0.4μm 필터는 약물 수송 연구에서 표준 선택입니다. 3μm 및 8μm 필터 크기는 콜라겐 포매 세포의 손실을 방지하기 위해 권장되지 않습니다. - 피펫을 사용하여 필터 인서트 아래 및 위에 500μL의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)으로 Transwell 필터(이하 멤브레인 인서트라고 함)를 수화합니다.
- 멀티웰 플레이트를 닫고 최소 2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
알림: 멤브레인 인서트는 최대 24시간 동안 HBSS에 남아 있을 수 있습니다. 이 작업은 모델을 구성하기 전날에 수행할 수 있습니다. 멤브레인 인서트가 완전히 수화되고 필터가 건조되지 않는 것이 중요한데, 이는 샘플이 제대로 부착되기 어렵게 만들 수 있기 때문입니다. - 2시간(또는 24시간) 후에 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 피펫을 사용하여 멤브레인 삽입물 위와 아래에서 HBSS를 조심스럽게 흡입하고 10분 동안 건조시킵니다.
- 0.4μm 필터가 있는 인서트가 포함된 24웰 플레이트를 선택합니다.
- 기본 3D 장 모델 시스템의 cell-free collagen lamina propria 제조 (DAY 1)
- DMEM에 10% 소 태아 혈청(FBS), 200mM L-글루타민, 1% 중탄산나트륨 및 1.35mg/mL 유형 1 쥐꼬리 콜라겐 성분이 포함된 얼음 위의 50mL 멸균 튜브에 무세포 콜라겐 용액을 준비합니다.
참고: 이러한 모든 구성품은 얼음 위에 보관하고 냉각된 피펫 팁과 함께 DMEM에 추가해야 합니다. 유형 1 쥐 꼬리 교원질은 이것이 증가 온도 및 PH로 중합되기 때문에 마지막에 추가되어야 합니다. 준비된 cell-free collagen 용액의 양은 필요한 장내 등가물의 수에 따라 달라집니다. - 250μL의 용액을 각 플레이트 인서트(멤브레인 필터 위)에 추가하여 선택한 장내 등가물 수만큼 늘리고 멀티웰 플레이트 위에 뚜껑을 놓습니다. 콜라겐 용액이 층류 후드 아래의 실온(RT)에서 중합되도록 합니다.
참고: 보다 고체상으로의 전환 외에도 중합은 노란색에서 분홍색으로의 색상 변화에서도 분명합니다. 중합은 일반적으로 10-15분 이내에 완료됩니다.
- DMEM에 10% 소 태아 혈청(FBS), 200mM L-글루타민, 1% 중탄산나트륨 및 1.35mg/mL 유형 1 쥐꼬리 콜라겐 성분이 포함된 얼음 위의 50mL 멸균 튜브에 무세포 콜라겐 용액을 준비합니다.
- 섬유아세포(L929) 및 단핵구(U937) 세포의 준비, 세포 계수 및 모델 시스템에 추가(DAY 1)
- 인큐베이터에서 L929 세포 배양(1.1.1단계)을 제거합니다. 진공 펌프를 사용하여 배지를 흡입하고 5mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, Ca 및 Mg 제외)로 교체하고 세포를 헹굽니다.
- 진공 펌프를 사용하여 PBS를 흡입합니다. 미리 준비된 트립신-EDTA 용액 2mL(PBS의 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA)를 넣고 인큐베이터에 3-5분 동안 넣습니다.
- 도립 현미경(예: Eclipse Ts2, Nikon)을 사용하여 세포가 접착 표면에서 분리되는지 여부를 확인합니다. 이 경우 즉시 2mL의 DMEM(10% FBS 함유)을 추가하여 트립신 반응을 차단하고 세포를 헹굽니다.
- 세포 용액을 멸균 15mL 튜브에 옮기고 645 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 진공 펌프를 사용하여 상층액을 흡입합니다.
알림: 펠릿을 방해하지 않도록 주의해야 합니다. DMEM의 효과는 L929 및 U937 세포에서 테스트되었으며 성장에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. - 펠릿에 DMEM 1mL를 추가하고 세포를 현탁시킵니다.
알림: 세포는 용액에 균질하게 부유해야 합니다. - DMEM에서 세포 20μL를 제거하고 트리판 블루 용액 20μL를 추가합니다. 혼합물 20μL를 제거하고 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 밀도를 현미경으로 평가합니다.
- 인큐베이터에서 U937 세포 배양(1.1.3단계)을 제거합니다. 세포 용액을 645 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 진공 펌프를 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 상층액을 흡입합니다.
- 세포를 1mL의 RPMI에 현탁시킵니다. L929 세포와 마찬가지로 세포가 용액에 균질하게 부유하는지 확인하십시오.
- 마찬가지로, 1.4.6단계에서 보고한 대로 셀 밀도를 설정합니다.
- 1.3.1 단계에서 설명한대로 콜라겐 용액을 준비합니다.
알림: 만들 용액의 양은 각 인서트(또는 모델)에 대해 450μL를 고려해야 합니다. - 구성할 각 장 등가 모델에 대해 50μL의 부피에 각각 50,000개의 L929 세포 및 15,000개의 U937 세포를 포함하는 DMEM 용액을 준비합니다.
참고: 셀 수는 중요한 요소입니다. 두 가지 세포 유형이 너무 많으면 적절하게 조직되지 않은 세포로 과도하게 가득 찬 판막이 생성됩니다. 섬유아세포(콜라겐 생성)의 수가 적으면 박판(lamina propria)이 덜 조밀해지는 반면, 단핵구가 너무 적으면 자극에 대한 면역 반응을 방해합니다. 각 50μL 부분 표본 내에 정확한 수의 세포가 존재하는 경우 각 24웰 플레이트에 있는 12개의 필터 삽입물에 대해 총 600μL의 부피를 준비할 수 있습니다. - 1.4.10단계에서 세포를 포함하는 각 50μL 부분 표본을 450μL의 콜라겐 용액에 추가합니다. 잘 섞는다.
- 각 모델에 대해 500μL의 콜라겐 함유 세포 용액으로 사전 코팅된 cell-free collagen lamina propria를 오버레이합니다.
참고: 각 삽입물에 볼륨을 빠르게 추가하는 것이 중요하므로 재건된 장 점막 모델의 수를 한 번에 12개 이하로 제한하는 것이 좋습니다. - 플레이트를 닫고 용액이 굳을 수 있도록 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다.
- 준비, 세포 계수 및 장 모델에 상피 Caco-2 세포 추가(DAY 1)
- 인큐베이터에서 Caco-2 세포 배양(단계 1.1.2)을 제거합니다. 예비 헹굼을 위해 10mL의 PBS를 사용하여 1.4.1단계의 절차를 반복합니다. 그런 다음 미리 준비된 트립신-EDTA 용액 5mL(Ca- 및 Mg-free PBS의 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA)를 넣고 인큐베이터에 5-8분 동안 넣습니다.
- 1.4.3단계(트립신 반응을 차단하기 위해 5mL의 DMEM 사용)를 1.4.6단계까지 반복하여 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 50μL에 150,000개의 Caco-2 세포를 포함하는 DMEM 용액을 준비합니다.
알림: 사용된 셀의 수는 임계점입니다. 150,000개의 세포를 초과하면 조밀하고 무질서한 상피층이 형성될 수 있는 반면, 100,000개 미만으로 너무 적으면 세포가 성장하기 어렵고 기저막을 적절하게 덮지 못하여 불연속적인 장 상피층을 형성합니다. 셀이 효과적으로 일시 중단되었는지 확인합니다. 200 μL 피펫의 팁은 균일한 분포를 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 주어진 시간에 12개의 모델을 구성할 수 있다는 점을 감안할 때 600μL 셀 용액을 준비할 수 있습니다. - 단계 1.4.14에서 요구되는 2시간 후, DMEM에 현탁된 Caco-2 세포 50μL를 각 기저막의 중간에 추가합니다. 멀티웰 플레이트의 뚜껑을 닫습니다.
- 멸균 층류 후드 아래에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 30분 동안 인큐베이터로 옮깁니다.
- 10% FBS 및 1% Pen/Strep가 포함된 DMEM 용액을 준비합니다.
참고: 모델당 1mL 용량을 사용할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다. - 재구성된 모델 위에 500μL의 배지를 추가하고 필터 아래에 500μL를 추가합니다.
알림: 필터 위에 매체를 추가할 때 셀이 분리되거나 스트레스를 받지 않도록 주의해야 합니다. - 멀티웰 플레이트 시스템을 닫고 인큐베이터에 넣습니다.
- 모델 준비/형성 및 사용(DAY 2 - DAY 6)
- 2일차: 피펫을 사용하여 재구성된 모델 위와 필터 아래 모두에서 용액을 조심스럽게 제거합니다. 필터 위와 아래에 각각 500μL의 신선한 DMEM(10% FBS 및 1% Pen/Strep)으로 교체합니다.
- 3일차: 1.6.1단계에서 위와 같이 반복합니다.
- 4일차: 1.6.1단계에서 위와 같이 반복합니다.
참고: 이 장 모델은 정적 세포 모델입니다. 따라서 분자의 방출과 세포의 성장 및 자극을 촉진하기 위해서는 매일 배지를 바꾸는 것이 매우 중요합니다. - 5일차: 이 시점에서 모델이 완전히 형성/개발되었습니다. 추가 연구를 위해 이러한 모델을 사용하십시오.
알림: 모델을 사용하기에 가장 좋은 시기는 5일입니다. 세포는 인큐베이터에서 더 오랜 기간 동안 유지될 수 있지만 시간이 지날수록 상피 세포가 통제되지 않은 방식으로 성장할 가능성이 커져 사용하기 어려운 조직화되지 않고 조밀한 층이 될 수 있습니다. - 5일째 되는 시점에 독성(글루텐 또는 지질다당류[LPS]) 또는 관심 있는 유익한 성분(폴리페놀)으로 모델을 배양합니다. DMEM 매체에 매달린 재구성된 모델의 상단 부분에 추가합니다.
참고: 관심 있는 각 성분의 적절한 농도를 계산하고 DMEM 배지에 현탁해야 합니다. DMEM 배지만 포함하는 처리되지 않은 대조군은 실험 모델과 비교하기 위해 설정해야 합니다. - 대조군 및 실험 모델을 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
- 6일차: 피펫으로 필터 위와 아래의 매체를 제거합니다.
참고: 이 배지는 염증성 사이토카인의 방출을 측정하기 위한 후속 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 유형 테스트를 위해 보관할 수 있습니다. 이를 위해 배지를 멸균 바이알에 첨가하고 추가 분석을 위해 -20°C에서 보관해야 합니다.
2. 재건된 장 점막 모델의 파라핀 임베딩
알림: 전체 절차는 화학 흄 후드 아래에서 수행해야 합니다. 각 단계와 해당 시간 할당은 엄격하게 준수되어야 합니다. 이러한 이유로 모든 시약을 미리 준비하는 것이 중요합니다.
- 파라핀 기계를 사용할 수 있도록 58°C로 설정합니다.
- 멤브레인 인서트를 옮겨 멸균 24웰 플레이트에서 플라이어를 사용하여 웰을 청소합니다.
- 필터 위의 PBS에 500μL의 37% 완충 포르말린을 추가하고 필터 아래에 1mL를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 상온에서 2시간 동안 화학 흄 후드 아래에 그대로 둡니다.
참고: 대안으로 4% 완충 포르말린을 RT에서 1시간 동안 사용할 수 있습니다. - 포르말린을 제거하고 필터 위와 아래에 HBSS 용액을 추가합니다. 그런 다음 HBSS를 제거합니다.
- 멤브레인 인서트에서 lamina propria를 분리합니다.
참고: 장 점막의 세포는 일반적으로 막 삽입물에 부착되지 않기 때문에 매우 쉽게 분리됩니다. 또한 두 개의 시료 격실(정점 및 기저)은 부착된 상태로 유지되어 3D 구조를 유지합니다. 어떤 이유로 쉽게 분리되지 않으면 멸균 일회용 메스 블레이드를 사용하여 멤브레인 삽입물에서 장 점막을 제거하는 것이 중요합니다. 멤브레인 인서트를 절단하여 플라스틱에서 분리할 수 있습니다. 샘플을 메스로 만지지 않도록 주의하십시오. 콜라겐이 포집된 세포에서 멤브레인 삽입물을 제거하는 이유는 이 필터가 후속 고정 또는 파라핀 포매 단계에서 분리되어 장 점막 모델 간의 비교가 불균형해질 수 있기 때문입니다. 더욱이, 매립된 단면 내의 멤브레인 삽입물은 절편을 방해할 수 있는 다른 일관성을 가지고 있습니다. - 100mL 비커를 화학 흄 후드 아래에 놓고 각각 조사 중인 하나의 재건된 장 점막 모델 시스템을 포함하도록 올바르게 라벨링합니다. 각 비커에 35% ETOH 25mL를 첨가한 다음 재건된 장 점막을 추가합니다. 10분 동안 배양합니다.
- 35% 에탄올을 50% 에탄올 25mL로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
- 50% 에탄올을 70% 에탄올 25mL로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
- 70% 에탄올을 25mL의 80% 에탄올로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
- 80% 에탄올을 25mL의 95% 에탄올로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
- 95% 에탄올을 100% 에탄올 25mL로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
- 100% 에탄올을 100% 에탄올의 또 다른 25mL 변화로 교체하고 10분 동안 배양합니다.
- 흄 후드 아래에 100mL 비커를 놓고 각각 조사 중인 모델 하나를 포함하도록 올바르게 라벨을 붙입니다. 50mL의 크실렌 또는 조직학적 투명화제를 10-20분 동안 추가합니다.
참고: Histo-Clear(조직학적 투명화제)는 친산성 염색제의 투명도와 생동감을 향상시키기 때문에 권장됩니다. 투명화 시간은 재건된 장 점막 샘플마다 다를 수 있으며 2-3분마다 외관의 투명도를 확인해야 합니다. - 샘플이 투명해지면 금속 티슈 카세트 홀더에 넣은 다음 가열된 기계 내부의 액체 파라핀에 45분 동안 담급니다.
- 파라핀을 교체하고 샘플을 가열된 기계 내부에 45분 더 둡니다.
- 티슈 카세트 홀더를 제거하고 얼음 위에 올려 식힙니다. 냉각된 샘플 블록이 금속 홀더에서 분리되면 실온에서 추가로 냉각될 수 있습니다.
- 블록을 RT에 저장합니다.
알림: 단면을 즉시 준비하는 것이 목적이라면 블록을 4 ° C에 배치하여 사용할 때 잘 냉각되도록 할 수 있습니다. - 마이크로톰을 사용하여 4μm 절편을 절단합니다.
- 절단 된 부분을 슬라이드에 놓고 37 ° C의 오븐에서 24 시간 동안 건조시킵니다.
- 슬라이드를 사용할 준비가 되었습니다. H&E 조직학적 염색 또는 면역-조직화학 반응 염색(항원-항체 유형)을 수행할 때까지 RT에 보관합니다.
- 면역조직화학적 염색의 경우, 관심 항체(오클루딘과 같은 TJ 단백질 연구 또는 단핵구 활성화, 이동 및 분화)를 선택하고 상용 키트를 사용하여 발현(염색을 통해)을 검출합니다.
- 마찬가지로, Alcian blue 및 주기적 acid-Schiff(PAS) 염색 키트를 사용하여 점액을 측정합니다.
- 현미경에서 채취한 현미경 사진에서 양성 픽셀의 백분율을 계산하여 occludin과 같은 염색된 관심 TJ 단백질을 정량화합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ2 소프트웨어[Wayne Rasband, 버전 2.9.0/1.53t])를 사용하여 세포의 사진을 분석합니다.
- 픽셀 분석을 수행하려면 디지털 이미지를 300픽셀/인치로 처리하고 8비트로 변환합니다. 그런 다음 Color Deconvolution 플러그인으로 바이너리 이미지를 처리하여 관심 단백질의 염색(이 경우 오클루딘의 영구적인 적색 염색)을 분석합니다.
- 선택한 사진을 tiff로 저장하고 그래픽 편집기(예: Adobe PhotoshopCC [버전 20.0.4])로 아티팩트를 제거하기 위해 "정리" 절차를 거칩니다.
- 그런 다음 ImageJ2의 입자 분석 응용 프로그램을 사용하여 관심 있는 모든 필드를 측정하고 데이터를 픽셀 수로 보고합니다.
참고: 각 실험은 각 반복실험에 대해 분석된 세 개의 내부 반복실험 필드를 사용하여 삼중으로 수행해야 합니다. 점액을 정량화하기 위해 픽셀을 측정하는 동일한 원리를 보라색 자홍색으로 염색된 중성 점액과 밝은 파란색으로 염색된 산성 점액을 각각 촬영한 이미지에 적용할 수 있습니다.
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Representative Results
첫 번째 중요한 측면은 실험 목적으로 기본 3D 장 등가 점막의 수용 가능성을 결정하는 것입니다. 이것은 조직학 및 조직 병리학 실험실에서 가장 널리 사용되는 염색, 즉 hematoxylin (핵 물질을 짙은 파란색-보라색으로 염색) 및 eosin (분홍색의 다양한 음영으로 세포질 물질을 염색)으로 수행됩니다. H&E 염색은 먼저 처리되지 않은 대조군에서 수행되며, 실험적 처리와 동일한 조건 및 시간 프레임에서 배양됩니다. 세포의 패턴, 모양 및 구조를 시각화하여 이 장 세포 모델 시스템의 성공 여부는 Caco-2 세포가 5일 후 세포외 기질(ECM)이 풍부한 라미나 프로프리아(lamina propria) 위에 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 것으로 결정됩니다(그림 1A). 추가 분석에 적합하지 않은 것으로 간주되는 모델 시스템의 예로는 10일 후에 볼 수 있듯이 무질서한 상피층으로 과도한 성장을 보이는 모델이 있습니다(그림 1B). 또 다른 예로는 너무 두껍고 무질서한 상피층(그림 1C)이 있는데, 이는 과도한 Caco-2 세포의 파종 또는 과도한 배양으로 인해 발생합니다. 증식의 활성 단계에 있지 않은 세포를 파종하거나 lamina propria의 준비 또는 파라핀으로 고정하는 동안 발생하는 문제(세포가 분리/파괴됨)로 인한 기형(그림 1D)도 용납할 수 없는 재건된 장 점막의 예입니다. 마찬가지로 상피층 형성의 부족(그림 1E)은 용납할 수 없으며, 이는 Caco-2 세포가 너무 적게 파종되거나 lamina propria의 준비에 문제가 있음을 나타냅니다. 여러 절편을 생성할 수 있는 허용 가능한 3D 장 등가물을 사용하여 단일 실험에서 다양한 파라미터를 조사할 수 있습니다.
분석할 수 있는 다양한 파라미터 중 전염증 유발 인자에 반응하는 장벽 무결성을 시각화할 수 있으며, TJ 단백질을 염색 및 정량화하여 처리되지 않은 대조 모델 시스템과 비교할 수 있습니다. 여기서는 글루텐 함량이 높은 듀럼 밀 공급원에서 추출한 총 밀 단백질 40μg/mL가 세포 무결성과 TJ 오클루딘 단백질 함량에 미치는 염증 유발 효과를 입증합니다7(그림 2A). H&E 조직학적 염색을 사용하여 대조 모델 시스템은 Caco-2 원주 세포가 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 것을 보여줍니다. 대조적으로, 글루텐 함유 단백질 샘플의 효과는 더 많은 비특이적 에오신 염색과 함께 단층의 파괴를 유발하는 것으로 나타났습니다(그림 2A). 또한, 상피층의 두께를 측정할 수 있으며, 전염증성 글루텐에 노출된 후 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 2A,B). 오클루딘에 대한 항체(적색 염색에 접합)를 사용하여 오클루딘 단백질을 시각화하고 정량화할 수 있었습니다. 24시간 동안 글루텐 단백질에 노출된 장 점막에 비해 대조군에서 오클루딘 단백질 함량이 상당히 높았습니다(그림 2A,C).
면역 성분(U937 단핵구로 대표)으로 구성된 장내 등가물은 단핵구 활성화, 이동 및 대식세포로의 분화에 대한 전염증 유도제의 효과를 조사하는 데에도 이상적입니다. 다시 한 번, 글루텐 함량이 높은 밀 공급원에서 추출한 40μg/mL의 총 밀 단백질을 사용하여 빠른 적색 결합 CD14 염색에서 lamina propria에서 U937 단핵구의 전염증 활성화가 분명했습니다(그림 3A). 활성화는 단핵구와 대식세포에서 이 붉은색으로 염색된 막 당단백질의 증가된 발현에서 감지됩니다. 증가된 CD14 단백질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에서도 검출되었는데, 이는 면역형광 하에서 녹색으로 염색됩니다. 이동은 Caco-2 단층에 가까운 활성화된 U937 세포의 존재로부터 입증되었습니다. 단층이 파열된 곳에서는 U937 세포가 Caco-2 세포 단층 내부로 들어간 것으로 나타났습니다(그림 3A). 대조군에서는 CD14 염색 단핵구 이동의 증거가 없었습니다(그림 3A). 단핵구가 대식세포로 분화하는 것은 마커 CD11b에서 확인할 수 있습니다. 적색 염색체 또는 FITC를 사용한 대조군에서는 CD11b 염색이 분명하지 않았습니다(그림 3B). 대신, 글루텐에 노출된 조직에서 CD11b 대식세포는 ECM이 풍부한 lamina propria와 파열된 Caco-2 단층 내에서 관찰되었습니다(그림 3B).
LPS를 사용하여 장 염증을 시뮬레이션한 결과, 이 모델 시스템을 사용하여 치료되지 않은 대조군과 LPS 치료군에서 각각 Caco-2 세포에 의해 생성된 산성 뮤신 및 뮤코다당류를 조사할 수도 있음을 보여줍니다(그림 4A). Alcian blue와 PAS 염색을 사용하여 산성 점액은 각각 밝은 파란색으로 염색하고 중성 점액은 보라색-자홍색으로 염색합니다. 점액 염색의 정도도 유사하게 정량화할 수 있으며 1ng/mL LPS 챌린지 하에서 유의하게 유도되는 것으로 나타났습니다(그림 4B). 또한, 고정 전에 배지를 제거하여 전염증성 사이토카인 생성을 조사할 수 있습니다. 수많은 배설 사이토카인을 측정할 수 있지만, 이 특별한 경우에는 미드카인(midkine, MDK)을 선택했습니다. MDK는 전사 인자(transcription factor), 활성화된 B 세포(NF-κB) 경로의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer)에 의해 유도되는 내인성 염증 표지자이며, 장 세포의 염증성 질환과도 관련이 있다15. LPS 챌린지에서 MDK는 대조군에 비해 유의하게 유도됩니다(그림 5).
그림 1: 처리되지 않은 대조군 3D 장 등가물. 실험 목적을 위한 기본 3D 장 점막 모델의 효능을 검증하기 위해 24시간 동안 처리되지 않은 대조군 3D 장 등가물(Caco-2 /U937/L929 공동 배양)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색. (A) 수용 가능한 실험 모델을 수용 불가능한 모형과 비교하여, 10일 후 과도한 (B) 상피 성장 및 무질서한 층, (C) 과도한 상피 두께 및 무질서, (D) 기형, (E) 상피 세포층이 없음을 보여줍니다. 각 이미지의 눈금 막대는 50μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 처리된 3D 장 등가물. (A) 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 대조군(CTRL)과 비교하여 고글루텐 함유 현대 밀 혼합물에서 24시간 - 40μg/mL 총 단백질에 노출된 3D 장 등가물(Caco-2 /U937/L929 공동 배양)의 오클루딘 발현. 각 이미지의 눈금 막대는 50μm입니다. (B) Caco-2 세포 두께의 정량화 및 (C) 오클루딘-적색 염색 염색. 유의한 차이는 일원분산(ANOVA)에 의해 결정되었으며 *** 0.0001< P < 0.001로 표시되었습니다. 검은색 점은 반복실험 횟수를 나타냅니다. 이 그림은 Truzzi et al.7의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CD14 및 CD11B 염색. U937 단핵구 및 CD11B U937의 CD14 염색은 24시간 후 고글루텐 함유 현대 밀 혼합물에서 첨가된 단백질(대조군[CTRL]) 또는 40μg/mL의 총 단백질에 노출된 3D 장 등가물(Caco-2/U937/L929 공동 배양)에서 대식세포를 분화시켰습니다. CD14 및 CD11b 염색의 경우, 빠른 적색을 염색체로 사용하고 핵을 에오신으로 대조염색했습니다. 각 이미지의 눈금 막대는 20μm입니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(녹색)를 사용한 CD14 및 CD11b 염색도 면역형광 하에서 나타났습니다. 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)로 대조염색하였다. 각 이미지의 눈금 막대는 50μm입니다. 화살표는 단핵구(CD14 양성 세포)와 대식세포(CD11b 양성 세포)의 존재를 나타냅니다. 이 그림은 Truzzi et al.7의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 Alcian Blue/주기적 산-쉬프 염색(PAS) 염색의 점액 발현. (A) 1ng/mL 지질다당류에 노출된 처리되지 않은 등가물 및 재건된 장 점막 모델 시스템에서 24시간 후 기본 3D 장 등가물(Caco-2 /U937/L929 공동 배양)의 Caco-2 세포. 각 이미지의 눈금 막대는 50μm입니다. (B) 점액 발현의 정량화는 단방향 분산(ANOVA)에 의해 결정되었으며 유의성은 **** P < 0.0001로 보고되었습니다. 검은색 점은 반복실험 횟수를 나타냅니다. 이 그림은 Truzzi et al.16의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미드킨 발현. 1ng/mL 지질다당류에 노출된 미처리군(CTRL) 및 장 점막 모델 시스템에서 24시간 후 3D 장 등가물(Caco-2 /U937/L929 공동 배양)의 배지에서 Midkine 발현. 미드카인 발현의 정량화는 일원분산(ANOVA)에 의해 결정되었으며 유의성은 **** P < 0.0001로 보고되었습니다. 이 그림은 Truzzi et al.16의 허가를 받아 각색되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 장 등가물의 구성 및 실험적 사용과 조직 절편의 파라미터에 대한 고정 및 현미경 분석을 나타내는 개략도. 개략도는 장 등가물의 구성과 이러한 모델에 투여할 수 있는 가능한 실험적 치료법을 요약합니다. 단일 실험에서 여러 조직 절편을 생성하면 그림 1, 그림 2, 그림 3 및 그림 4와 같이 장 점막의 수많은 구조적 및 면역 측면을 분석할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 기본 재구성 장 점막 모델 시스템(그림 6)은 생리학적 복잡성(섬유아세포 및 단핵구를 포함하는 ECM이 풍부한 lamina propria 지지체와 함께 Caco-2 단층을 포함하는 생리학적으로 더 관련성이 높은 3D 세포 배양)과 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 생산하기 위해 상업용 인간 세포주를 사용)을 결합합니다.13. 따라서 이 모델 시스템은 잠재적인 의약품/식품 성분이 장 장벽 무결성에 미치는 영향을 평가하는 것을 목표로 하는 쥐 모델에 대한 적절한 대안으로 간주됩니다. 이와 관련하여, 이전 논문들은 잠재적으로 유익한 화합물(용량 의존성 플러스)과 유해한 식품 성분 7,16,17을 모두 테스트하는 데 있어 현재 세포 배양 모델의 효능을 입증했다. 또한, LPS 또는 대체 전염증성 시약(2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 또는 덱스트란 설페이트 나트륨)을 현재 장 점막 모델에 추가하여 IBD 증상을 시뮬레이션할 수 있습니다. 이를 통해 IBD15의 표지자인 전염증성 MDK와 같은 사이토카인의 발현뿐만 아니라 구조적 측면에서 장 질환의 원인을 연구할 수 있습니다. 이 기본 모델 시스템은 또한 더 많은 인구를 대상으로 하는 궁극적인 약물 스크리닝 잠재력을 가지고 있습니다. 모델 시스템은 2D 모델보다 생리학적으로 더 복잡하지만(13,14), 복잡한 인간 생리학을 재현하는 데 있어 미세유체 시스템(영양소의 지속적인 공급과 노폐물 제거 및 기계적 자극의 유체 관류)8,14 및 마이크로바이옴(장 질환에서 숙주-마이크로바이옴 상호 작용 평가)8의 부재를 포함하는 한계가 있습니다. 14.
상피 장벽 무결성의 광현미경 평가를 위해 파라핀 임베딩과 함께 현재의 기본 3D 장 점막 모델을 사용하는 것의 장점은 단일 실험에서 여러 조직 절편을 만들 수 있어 수많은 매개변수를 분석할 수 있다는 것입니다. 경상피 전기 저항(TEER)3은 장 장벽 무결성을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 방법이며 고분자 투과성 연구 3,18 및 TJ 단백질 발현의 웨스턴 블롯 평가에 대해 널리 보고된 연구와 함께 사용되었습니다. 웨스턴 블롯 평가는 단백질 발현의 전반적인 변화에 대한 정량적 통찰력을 제공하며, TEER은 장벽 무결성의 정량적 척도 역할을 합니다. 대신, 현미경 평가는 국소 단백질 변화 및 상호작용의 정성적 시각화 및 평가를 위한 귀중한 도구를 제공한다18.
면역 성분이 있는 모델의 현미경 평가는 CD14 및 CD11b 염색으로 입증된 바와 같이 단핵구를 대식세포로 분화하고 ECM에서 활성화된 단핵구의 이동과 같은 면역 반응을 시각화할 수 있습니다. 식별은 그림 3의 CD14 및 CD11b에 대해 표시된 것처럼 개별 조직 절편에 대한 면역조직화학 및/또는 면역형광 염색을 통해 수행할 수 있습니다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 재건된 장 점막 조직 전체의 구조적 시각화를 가능하게 합니다. 또한 세포의 핵과 세포질을 모두 식별할 수 있습니다. 대조적으로, 컨포칼 면역형광은 조직 전체를 볼 수 없습니다(관심 마커와 DAPI 염색 핵만). 그러나 배경색이 제거된 매우 깨끗한 이미지를 제공합니다. 이것의 장점은 마커의 양성성 또는 부정성을 입증하는 데 더 높은 정밀도를 허용하고 색상 강도의 차이(예: 다른 셀보다 한 셀에서 더 많이 표현되는 마커)를 계산할 수 있다는 것입니다. 잠재적으로 CD14 단핵구가 lamina propria 내에서 Caco-2 단층으로 이동하는 정도는 다양한 시점에서 촬영된 여러 복제 이미지로부터 추정할 수도 있습니다. 그럼에도 불구하고, 염증의 증거는 CD14 및 CD11b 염색 세포의 존재로부터 분명했습니다.
20–40 μg의 총 단백질 범위는 웨스턴 블로팅19를 위해 대부분의 실험실에서 사용됩니다. 수많은 간극연접 단백질(occludin, claudin, zonulin 및 E-caderin)의 정량화는 각각 훨씬 적은 단백질을 필요로 하는 개별 조직 절편에 대한 면역조직화학적 및/또는 형광 염색을 통해 수행할 수 있습니다. 동시에, 동일한 실험에서 화합물에 반응하는 상피층의 무결성은 H&E 염색을 통해 세포의 패턴, 모양 및 구조로부터 시각화할 수도 있습니다.
점액 생성, TJ 단백질 및 면역 반응에서 생성된 단백질을 염색하는 데 사용하기 위한 기본 3D 재구성 장 점막의 효능은 특히 모델 시스템 구성 및 조직 고정 중에 중요한 단계를 극복하는 데 달려 있습니다. 모델 구성과 관련하여 올바른 합류점을 사용하고 올바른 수의 Caco-2 세포(프로토콜의 메모로 표시됨)를 각각 파종하는 것이 기본입니다. 세포가 너무 많거나 잘못된 합류는 두껍고 무질서한 상피층을 초래할 수 있습니다. 대신, 세포가 너무 적으면 상피층 형성이 감소하거나 부족해집니다. 파종에서 마찬가지로 기본은 ECM에서 L929 및 U937 세포의 정확한 세포 합류 및 수뿐만 아니라 준비 중 콜라겐의 올바른 처리입니다. 콜라겐의 과잉 세포 또는 빠른 중합은 조밀하고 기형의 ECM을 초래하여 위의 상피 세포 구조에 영향을 미칩니다. 마찬가지로, 콜라겐 형성 L929 세포가 너무 적으면 ECM의 일관성이 부정확해지는 반면, U937 단핵구가 너무 적으면 면역 반응이 좋지 않습니다. 또한 장기간 배양하면 세포가 과도하게 성장하여 상피층이 조밀해지기 때문에 5일 후에 세포를 실험에 사용하는 것이 중요합니다. 더욱이, 본 설계는 미세유체 시스템이 결여되어 있고 정적인 장 세포 모델을 대표한다는 점을 감안할 때, 분자의 방출과 세포의 성장 및 자극을 촉진하기 위해서는 배지를 매일 바꾸는 것이 매우 중요합니다. 고정 프로토콜과 관련하여 투명화 단계가 중요하며 조직이 파라핀에서 투명해지는 데 필요한 시간이 다를 수 있다는 점을 감안할 때 이 단계에서 각 장 점막 시스템을 면밀히 관찰해야 합니다. 고정 절차 전반에 걸쳐 이러한 모델의 손상을 방지하기 위해 이러한 모델을 취급할 때 주의를 기울여야 합니다.
결론적으로, 기본 3D 장 등가물의 구성 및 고정에서 중요한 점을 엄격하게 준수한다면 모델은 제약 스크리닝 및 독성 연구에서 여러 매개변수를 평가하기 위한 수많은 조직 절편을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
연구자 작업을 지원하는 펠로우십을 제공한 움베르토 베로네시 재단(Umberto Veronesi Foundation)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
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