Yetişkin Bir Sinekten Malpighian Tübüle Diseksiyonu: Osmoregulatory ve Boşaltım Organlarını İzolasyon

Overview

Bu makalede, ön Malpighian tübüllerinin (MT) dişi bir Drosophila sineği ve Rossano ve ark. (2017) MT'lerin perfüzyon odasında canlı görüntüleme için hazırlandığı.

Protocol

Bu protokol Rossano ve Romero'dan bir alıntıdır, Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia'da Hücre İçi pH'ın Floresan Genetik olarak kodlanmış pH Göstergesi J. Vis. Exp. (2017) ile Optik Nicelemesi.

1. Poli-L-Lizin Slaytlarının Hazırlanması

1. Standart 75 x 25 mm slaytların etrafına hidrofobik PAP kalemle 40 x 20 mm kenarlık çizin ve RT'de 15 dakika kuruması için bir kenara koyun.
2. Her slayta 2 mL stok %0,01 Poly-L-Lizin (PLL) çözeltisi aktarın ve RT'de 1 saat bekletin.
3. Fazla PLL'yi pipetle çıkarın. Çözeltiyi ileride kullanmak üzere 50 mL konik şişeye kaydedin. 4 °C'de saklayın.
4. Kalan herhangi bir çözeltiyi bir vakum hattı ile epire edin. Slaytlarda çözüm kalmadığından emin olmak için vakum hattını tüm slayt yüzeyi üzerinde çalıştırın.
5. Kullanmadan önce RT'de 1 ek h için slaytları bir kenara koyun. Rt'de kuru olan slaytları standart bir slayt defterinde 1 aya kadar saklayın.

2. Diseksiyon Kabı ve Cam Çubukların Hazırlanması

1. 5 mm derinlik üretmek için RT'de 35 x 10 mm polistiren Petri kabına 4,5 mL elastomer bazlı 0,5 mL elastomer kürleme maddesi ekleyin. Tek kullanımlık pipet ucu ile karıştırın. Elastomer'ın RT'de O/N'yi iyileştirmesine izin verin.
   NOT: Elastomer açık ve kabarcıksız olmalıdır. Kabarcıkların temizlenmesi, elastomer plakaları döktükten sonra 10 - 15 dakika boyunca bir vakum kavanozunda tutularak kolaylaştırılabilir.
2. Ellerin arasında 5 mm çapında bir cam çubuk tutun ve uçları ayırırken çubuğun merkezini yanan bir Bunsen brülörü üzerinde eritin. Cam eridikçe daha hızlı çekerek ince (0,1 mm) ve konik şaft üretin(Şekil 1).
   NOT: Saptaki 45 ° açı genellikle tübüllerin işlenmesinde yardımcı olur. Bu, sap çekilirken bir elin indirilmesiyle elde edilebilir (bkz. Şekil 1).
3. İnce şaftı ortada tek kenarlı karbon çelik jiletle kırın. Kopmanın temiz olduğundan emin olmak için çubuğun ince ucunun bir diseksiyon dürbün altında inceliğini inceleyin.

3. Yetişkin Drosophila Anterior Malpighian Tubules Diseksiyonu

1. Diseksiyon kabını ve bölüm 2'den çekilmiş cam çubuğu, bölüm 1'den PLL kaplı bir kaydırak, yapışkan perfüzyon kuyusu bölücü, vakum gresi, 4 x 2" sızdırmazlık filmi şeridi, 2 çift #5 ince önps ve 40 mL buz gibi Schneider'ın orta ve RT iPBS'lerini toplayın.
2. Vakum gresini sızdırmazlık bandına yayın ve tabanı gresle kaplamak için yapışkan perfüzyon kuyusu bölücüyü bandın üzerine bastırın. Yapışkan perfüzyon-iyi bölücüyü soyun ve PLL kaplı bir kaydırağın üzerine yağ tarafı aşağı yerleştirin. Hidrofobik greste izlenen numune kuyularını bırakmak için perfüzyon kuyusu bölücüyü çıkarın.
3. PLL kaplı kaydırağın üzerine gresle kaplanmış kuyuya 200 μL RT iPBS yerleştirin ve slaydı stereoskopun altına taşıyın.
4. UAS-pHerry/capaR-GAL4 sineklerini boş bir sinek şişesine yerleştirin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde uyuşturun.
   NOT: Bu anestezi yöntemi, CO_2'ninaksine, sineklerin susuz kalmamasını sağlar.
5. Buz gibi Schneider'ın medyumunu diseksiyon kabına dökün ve tek bir uyuşturulma dişi sineği diseksiyon stereoskopu altında yemeğe aktarmak için ince tokalar kullanın.
6. Sineği bir dizi toka ile toraks tarafından tutun ve diğerini karın arkasını hafifçe kavramak için kullanın. Kısa, kasıtlı hareketlerde tokaları kullanarak sineğin arkasını açın. Arka koltuk görünür olduğunda, distal ucu kavrayın ve arkalığı tekrarlayan, kısa römorkörler aracılığıyla vücuttan çekerek bağırsakları ve MT'leri alttaki trakeollerden kurtarın.
   NOT: Ön ve arka MR'lar, üreter aracılığıyla midgut ve hindgut kavşağını buluştukları yerde görülebilir. Ücretsiz olacak ilk MT çifti, arkayı kuşatırken muhtemelen arka tübüller olacaktır. Bunlar göz ardı edilebilir (Şekil 2A).
7. İkinci MTs seti karından arındırılmışsa, ön MTs'leri üretterdeki ince ön ayaklarla kıstırın. Bu, ön MT'leri bağırsaktan ayıracak ve üretteri kapatacaktır.
8. Tübüllerin her iki tarafa da düşmesi için çubuğu üreterin altına kaydırarak çekilen cam çubukla serbest ön MT'leri alın. MT'leri doğrudan çözeltiden kaldırın.
9. Cam çubuğu, MTs ve üreter çubuğun alt kısmına yapışacak şekilde çevirin ve üreteri doğrudan kaydırağa 2007'den aşağı 2007'den aşağı 2007'den bu yana 2007'den bu yana 2007'den bu yana 2007'den bu yana Üreteri yapıştırın ve üreteri cam slayda bastırarak MT'lerin distal uçlarını kapatın (Şekil 2B). MT'leri gereğinden fazla manipüle etmeyin. MT'ler, üreter slayta tutturulmuş olarak çözeltide yüzüyor olmalıdır.
10. Her boruyu slayt yüzeyine hafifçe süpürmek için cam çubuğun ince ucını kullanın. Borunun ezilmemesi için çubuğu kaydırağa yaslayın ve çubuğu tübüllerin üstüne kaydırın, distal olarak proksimal hale taşıyarak, her borunun tam uzunluğunu PLL kaplı slaydın yüzeyine tutturmak için (Şekil 2C).
11. Yapışkan perfüzyon-iyi bölücüyü, monte edilmiş tübül üzerinde küçük bir sıvı dolu kuyu oluşturmak için kaydırağa geri yerleştirin.
12. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Giriş ve çıkış kılcal damarlarını sırasıyla perfüzyonun giriş ve çıkış açıklığı üzerine yerleştirin.
    NOT: Açık bir perfüzyon odası isteniyorsa kuyu bölücü bırakılabilir. Bu durumda giriş ve çıkış kılcal damarları bir görüntüleme kuyusunun karşı taraflarına hizalanabilir.

Representative Results

Şekil 1: Malpighian Tübüllerini Işlemek için Cam Çubuklar İmalatı.
A - E. MT'leri işlemek için uygun bir konik ve açı üretmek için bir cam çubuğu ısıtma ve çekme işlemi. F. Uygun şekilde imal edilmiş bir cam aletin fotoğrafı. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yetişkin Drosophila Anterior Malpighian Tübüllerinin Diseksiyonu.
A. Soğutulmuş Schneider'ın ortamında 2 çift ince önps ile ön MT kaldırmanın şematik gösterimi. "A. Tubule" = Anterior MT. "P. Tubule" = posterior MT. B. İnce cam çubuklar kullanılarak çıkarılan MTs'nin geri alma ve montaj süreci. C. Çıkarılan MTs'lerin tam uzunluğunu görüntüleme ve fizyolojik değerlendirme için bir slayta tutturma işlemi. D. Sağlıklı ön MT'leri gösteren capaR-GAL4 tarafından yönlendirilen UAS-pHerry'nin SEpH (470/510 nm ex/em) ve mCherry (556/630 nm ex/em) bileşenlerinin temsili geniş alan görüntüleri, yetersiz perfüzyondan zarar gören ön MTs ve yanlış tanımlı posterior MTs. Sağlıklı ön MR'ların net bir genişlemiş kör başlangıç segmenti, capaR-GAL4tarafından sürüldüğünde UAS-pHerry'nin nispeten artan ekspresyonunu içeren daraltılmış bir geçiş segmenti ve distal bir ana segmenti görüntülediğine dikkat edin. Hasarlı MT'ler, karşılık gelen SEpH floresan olmadan gözle görülür mCherry floresan agregaları gösterir. Posterior MT'ler, morfolojik olarak farklı segmentler olmadan çapı düzgündür. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.