Dissection malpighienne de tubule d’une mouche adulte : isoler un organe osmoregulatory et excréteur

Overview

Cet article décrit la dissection des tubules malpighiens antérieurs (MT) d’une mouche femelle de Drosophila et un protocole d’exemple de Rossano et autres. (2017) dans lequel les MT sont préparés pour l’imagerie en direct dans une chambre de perfusion.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Rossano et Romero, Quantification optique du pH intracellulaire en Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia avec un indicateur de pH génétiquement codé fluorescent, J. Vis. Exp. (2017).

1. Préparation de diapositives poly-l-lysine

1. Dessinez une bordure de 40 x 20 mm avec un stylo PAP hydrophobe autour du dessus des glissières standard de 75 x 25 mm et mettez-les de côté pour sécher pendant 15 min à RT. Utilisez de grandes couvertures si les glissières ne sont pas compatibles avec l’optique d’imagerie.
2. Transférer 2 mL de stock 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) solution sur chaque diapositive et réserver pendant 1 h à RT.
3. Retirer l’excès de PLL à l’avec une pipette. Enregistrez la solution dans un flacon conique de 50 mL pour une utilisation future. Conserver à 4 °C.
4. Aspirer toute solution restante avec une ligne sous vide. Exécutez la ligne de vide sur toute la surface de la glissière pour vous assurer qu’aucune solution ne reste sur les glissières.
5. Réglez les glissières de côté pendant 1 h supplémentaire à RT avant l’utilisation. Conservez les diapositives à sec à RT jusqu’à 1 mois dans un diaporama standard.

2. Préparation de dissecting Dish and Glass Rods

1. Ajouter 0,5 mL d’agent curatif élastomère à 4,5 mL de base d’élastomère dans une boîte petri en polystyrène de 35 x 10 mm à RT pour produire une profondeur de 5 mm. Mélanger avec une pointe de pipette jetable. Permettre à l’élastomer de guérir o/n à RT.
   REMARQUE: Elastomer doit être clair et exempt de bulles. Le dégagement des bulles peut être facilité en gardant les plaques d’élastomères dans un bocal sous vide pendant 10 à 15 minutes après le cousage.
2. Maintenez une tige de verre de 5 mm de diamètre entre les mains et faites fondre le centre de la tige sur un brûleur Bunsen allumé tout en tirant les extrémités à part. À mesure que le verre fond, tirez plus rapidement pour produire un arbre mince (0,1 mm) et conique(figure 1).
   REMARQUE: Un angle de 45 ° à la tige est souvent utile dans la manipulation des tubules. Ceci peut être réalisé en abaissant une main pendant que la tige est tirée (voir figure 1).
3. Casser l’arbre mince au milieu avec le côté contondant d’une lame de rasoir en acier en carbone à bord unique. Inspecter l’extrémité mince de la tige sous une portée de dissecting pour s’assurer que la rupture est propre.

3. Dissection des tubules malpighiens antérieurs adultes de Drosophila

1. Recueillir le plat de dissection et tirer la tige de verre de la section 2, une lame recouverte de PLL de la section 1, un séparateur adhésif perfusion-puits, graisse sous vide, une bande de 4 x 2 " de film d’étanchéité, 2 paires de forceps fines #5, et 40 mL aliquots de milieu de Schneider glacé et RT iPBS.
2. Étendre la graisse sous vide sur le ruban d’étanchéité et presser le séparateur adhésif de perfusion sur le ruban adhésif pour enrober le fond de graisse. Peler le séparateur adhésif de perfusion-puits et le placer côté graisse vers le bas sur un glissière enduit de PLL. Retirer le séparateur de puits de perfusion pour laisser les puits individuels tracés dans la graisse hydrophobe.
3. Placez 200 μL d’iPBS RT dans le puits entouré de graisse sur la glissière enduite PLL et déplacez la glissière sous le stéréoscope.
4. Placez les mouches UAS-pHerry/capaR-GAL4 dans un flacon à mouches vides et anesthésiez-les sur la glace pendant 10 min.
   REMARQUE: Cette méthode d’anesthésie, contrairement au CO_2,garantit que les mouches ne se déshydratent pas.
5. Verser le milieu glacé de Schneider dans le plat disséquant et utiliser des forceps fins pour transférer une seule mouche femelle anesthésiée dans le plat sous un stéréoscope disséquant.
6. Tenez la mouche par le thorax avec un ensemble de forceps et utilisez l’autre pour saisir doucement le postérieur de l’abdomen. Ouvrez le postérieur de la mouche à l’aide des forceps en mouvements courts et délibérés. Une fois que l’intestin postérieur est visible, saisir l’extrémité distale et libérer l’intestin et les MTs des trachéoles sous-jacentes en tirant l’intestin postérieur loin du corps par des remorqueurs répétitifs et brefs.
   REMARQUE: Les MTs antérieurs et postérieurs seront visibles où ils rencontrent la jonction de l’orgut et de l’arrière-pensée à travers l’uretret. La première paire de MTs à être libre sera probablement les tubules postérieurs comme ils encerclent l’arrière-pensée. Ceux-ci peuvent êtreignorés ( Figure 2A).
7. Pincez les MTs antérieurs à l’uretret avec des forceps fins une fois que le deuxième ensemble de MTs est libre de l’abdomen. Ceci séparera les MTs antérieurs de l’intestin et fermera l’uretret.
8. Ramasser les MTs antérieurs gratuits avec la tige de verre tirée en glissant la tige sous l’uretères de sorte que les tubules tombent de chaque côté. Soulevez les MT directement hors de la solution.
9. Tournez la tige de verre de telle sorte que les MTs et l’uretère soient adhérés au dessous de la tige et abaissent l’uretère directement vers le bas sur la glissière. Apposer l’uretère et sceller les extrémités distales des MTs en appuyant sur l’uretère vers le bas sur laglissièreen verre ( Figure 2B). Ne manipulez pas les MT plus que nécessaire. Les MT devraient flotter dans la solution avec l’uretère ancré à la glissière.
10. Utilisez l’extrémité fine de la tige de verre pour balayer doucement chaque tubule sur la surface de la glissière. Attachez la tige contre la glissière pour éviter d’écraser le tubule et faites glisser la tige sur le dessus du tubule, en déplaçant le distal vers proximal, pour fixer toute la longueur de chaque tubule à la surface de la glissière enduite de PLL (figure 2C).
11. Placez le séparateur adhésif de puits de perfusion sur la glissière pour former un petit puits rempli de liquide sur le tubule monté.
12. Placez le spécimen au microscope. Placez les capillaires d’entrée et de sortie sur l’ouverture de l’entrée et de la sortie du puits de perfusion, respectivement.
    REMARQUE: Le diviseur de puits peut être laissé de côté si une chambre de perfusion ouverte est désirée. Dans ce cas, les capillaires d’entrée et de sortie peuvent être alignés sur les côtés opposés d’un puits d’imagerie.

Representative Results

Figure 1 : Fabrication de tiges de verre pour la manipulation des tubules malpighiens.
A - E. Processus de chauffage et de traction d’une tige de verre pour produire un cône et un angle adaptés à la manipulation des MTs. Les flèches indiquent la direction et l’ampleur de la force à appliquer. F. Photographie d’un outil en verre fabriqué de façon appropriée. Barre d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Dissection des tubules malpighiens antérieurs adultes de Drosophila.
A. Représentation schématique de l’enlèvement antérieur de MT avec 2 paires de forceps fins dans le milieu refroidi de Schneider. « A. Tubule » = MT antérieur " P. Tubule " = MT postérieur B. Processus de récupération et de montage des MTs extraits à l’aide de fines tiges de verre. C. Processus d’adhésion de la pleine longueur des MTs extraits à une diapositive pour l’imagerie et l’évaluation physiologique. D. Images de champ large représentatives des composants SEpH (470/510 nm ex/em) et mCherry (556/630 nm ex/em) de UAS-pHerry conduits par capaR-GAL4 représentant des MTs antérieurs sains, MTs antérieurs endommagés par perfusion insuffisante, et MTs postérieures mal identifiés. Notez que les MTs antérieurs sains affichent un segment initial aveugle dilaté clair, un segment transitoire serré avec l’expression relativement accrue de UAS-pHerry une fois conduit par capaR-GAL4,et un segment principal distal. Les MT endommagés affichent des agrégats visibles de fluorescence mCherry sans fluorescence SEpH correspondante. Les MT postérieurs ont un diamètre uniforme sans segments morphologiquement distincts. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.