تشريح أنبوبي مالبيغيان من ذبابة الكبار: عزل جهاز أوزمورجيلاتوري وإفراز

Overview

يصف هذا المقال تشريح الأنابيب Malpighian الأمامية (MT) من ذبابة Drosophila أنثى وبروتوكول مثال من روسانو وآخرون. (2017) حيث يتم إعداد MTs للتصوير الحي في غرفة التشوه.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من روسانو وروميرو، القياس الكمي البصري لحاء داخل الخلايا في Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia مع مؤشر الحموضة الفلوري المشفر وراثيا، J. Vis. Exp. (2017).

1. إعداد الشرائح بولي L-Lysine

1. رسم حدود 40 × 20 ملم مع قلم PAP الكاره للماء حول الجزء العلوي من الشرائح القياسية 75 × 25 ملم وتخصص لتجف لمدة 15 دقيقة في RT. استخدم أغطية كبيرة إذا كانت الشرائح غير متوافقة مع البصريات التصوير.
2. نقل 2 مل من الأسهم 0.01٪ بولي-L-Lysine (PLL) حل على كل شريحة وتخصم لمدة 1 ساعة في RT.
3. إزالة PLL الزائدة مع ماصة. حفظ الحل في قارورة مخروطية 50 مل للاستخدام في المستقبل. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. يستنشق أي حل المتبقية مع خط فراغ. تشغيل خط فراغ على سطح الشريحة بأكملها لضمان أن أي حل يبقى على الشرائح.
5. خصص الشرائح لمدة ساعة إضافية في RT قبل الاستخدام. قم بتخزين الشرائح الجافة في RT لمدة تصل إلى شهر واحد في دفتر شرائح قياسي.

2. إعداد طبق تشريح وقضبان الزجاج

1. إضافة 0.5 مل من عامل المعالجة الاستومر إلى 4.5 مل من قاعدة الاستومر في طبق البوليسترين بيتري 35 × 10 ملم في RT لإنتاج عمق 5 ملم. تخلط مع طرف ماصة المتاح. السماح الاستومر لعلاج O / N في RT.
   ملاحظة: يجب أن يكون إلستومر واضحا وخاليا من الفقاعات. يمكن تسهيل إزالة الفقاعات عن طريق الحفاظ على لوحات الاستومر في جرة فراغ لمدة 10 - 15 دقيقة بعد سكبها.
2. عقد قضيب زجاجي قطره 5 ملم بين اليدين وتذوب في وسط قضيب على الموقد بونسن مضاءة في حين سحب نهايات بعيدا. كما يذوب الزجاج سحب بسرعة أكبر لإنتاج رقيقة (0.1 ملم) ومشدود رمح (الشكل 1).
   ملاحظة: زاوية 45 درجة في ساق غالبا ما تكون مفيدة في التعامل مع الأنابيب. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق خفض يد واحدة كما يتم سحب ساق (انظر الشكل 1).
3. كسر رمح رقيقة في الوسط مع الجانب الحاد من شفرة حلاقة الصلب الكربون ذات حد واحد. فحص نهاية رقيقة من قضيب تحت نطاق تشريح للتأكد من كسر نظيفة.

3. تشريح الكبار Drosophila أنابيب Malpighian الأمامية

1. جمع طبق تشريح وسحب قضيب زجاجي من القسم 2، شريحة PLL المغلفة من القسم 1، مقسم لاصق perfusion جيدا، الشحوم فراغ، شريط 4 × 2 "من فيلم الختم، 2 أزواج من ملقط غرامة #5، و 40 مل aliquots من الجليد الباردة شنايدر المتوسطة وRT iPBS.
2. نشر الشحوم فراغ على الشريط الختم واضغط على مقسم لاصق perfusion جيدا على الشريط لمعطف الجزء السفلي مع الشحوم. قشر قبالة مقسم لاصق perfusion جيدا ووضعه الشحوم الجانب إلى أسفل على رأس الشريحة المغلفة PLL. إزالة المقسم perfusion جيدا لترك الآبار عينة الفردية تتبع في الشحوم الكارهة للماء.
3. ضع 200 ميكرولتر من RT iPBS في البئر المحاط بالشحوم على الشريحة المغلفة ب PLL وحرك الشريحة تحت المجسم.
4. ضع UAS-pHerry/capaR-GAL4 يطير في قارورة ذبابة فارغة وتخديرها على الجليد لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: هذه الطريقة من_{التخدير}، على عكس ثاني أكسيد الكربون ، تضمن عدم جفاف الذباب.
5. صب الجليد الباردة شنايدر المتوسطة في طبق تشريح واستخدام ملقط غرامة لنقل ذبابة أنثى مخدر واحد في الطبق تحت مجسمة تشريح.
6. عقد ذبابة من الصدر مع مجموعة من ملقط واستخدام الآخر لقبضة بلطف الخلفي من البطن. اسحب الفتح الخلفي للذبابة باستخدام ملقط في حركات قصيرة ومتعمدة. مرة واحدة في hindgut مرئية، قبضة نهاية بعيدة وتحرير القناة الهضمية و MTs من tracheoles الكامنة عن طريق سحب hindgut بعيدا عن الجسم من خلال القاطرات المتكررة، وجيزة.
   ملاحظة: ستكون MTs الأمامية والخلفية مرئية حيث تلتقي بتقاطع المنتصف والهندغوت من خلال الحالب. أول زوج من MTs لتكون حرة من المرجح أن تكون الأنابيب الخلفية لأنها تطوق hindgut. ويمكن تجاهل هذه(الشكل 2أ).
7. قرصة قبالة MTs الأمامي في الحالب مع ملقط غرامة مرة واحدة في المجموعة الثانية من MTs خالية من البطن. وهذا سيفصل MTs الأمامية من القناة الهضمية وإغلاق الحالب.
8. التقاط MTs الأمامية الحرة مع قضيب الزجاج سحبت عن طريق انزلاق قضيب تحت الحالب بحيث تقع الأنابيب إلى أي من الجانبين. رفع MTs مباشرة للخروج من الحل.
9. بدوره قضيب الزجاج بحيث يتم الالتزام MTs والمكورات إلى الجانب السفلي من قضيب وخفض الحالب مباشرة إلى أسفل على الشريحة. لصق الحالب وختم نهايات البعيدة من MTs عن طريق الضغط على الحالب إلى أسفل على الشريحة الزجاجية (الشكل 2B). لا تعالج MTs أي أكثر من اللازم. يجب أن تطفو MTs في الحل مع مرساة الحالب إلى الشريحة.
10. استخدام نهاية غرامة من قضيب زجاجي لاكتساح بلطف كل أنبوب عبر سطح الشريحة. دعامة قضيب ضد الشريحة لتجنب سحق أنبوبي والانزلاق قضيب على الجزء العلوي من أنبوب، تتحرك القاصي إلى قريب، لإرفاق طول كامل من كل أنبوب على سطح الشريحة المغلفة PLL(الشكل 2C).
11. ضع المقسم اللاصق perfusion-well مرة أخرى على الشريحة لتشكيل بئر صغير مملوء بالسوائل فوق الأنبوب المثبت.
12. ضع العينة على مرحلة المجهر. ضع الشعيرات الدموية الداخلة والخارجة على مدخل وفتح منفذ بئر التغلغل ، على التوالي.
    ملاحظة: يمكن ترك مقسم البئر إذا رغبت غرفة تغلغل مفتوحة. في هذه الحالة يمكن محاذاة الشعيرات الدموية التدفق والتدفق إلى طرفي نقيض من بئر التصوير.

Representative Results

الشكل 1: تصنيع قضبان زجاجية للتعامل مع الأنابيب Malpighian.
أ - هاء. عملية التدفئة وسحب قضيب زجاجي لإنتاج تفتق وزاوية مناسبة للتعامل مع MTs. الأسهم تدل على الاتجاه وحجم القوة التي سيتم تطبيقها. F.صورة من أداة الزجاج ملفقة بشكل مناسب. شريط المقياس = 10 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تشريح الكبار Drosophila الأنابيب الأمامية Malpighian.
A.التمثيل التخطيطي لإزالة MT الأمامية مع 2 أزواج من ملقط غرامة في المتوسط شنايدر المبردة. "A. Tubule" = MT الأمامية. "P. Tubule" = الخلفي MT. B. عملية استرجاع وتركيب MTs المستخرجة باستخدام قضبان زجاجية رقيقة. ج.عملية الالتزام بالطول الكامل ل MTs المستخرجة إلى شريحة للتصوير والتقييم الفسيولوجي. D.صور واسعة النطاق ممثل SEpH (470/510 نانومتر ex/em) وmCherry (556/630 نانومتر ex/em) مكونات UAS-pHerry مدفوعة capaR-GAL4 يصور MTs الأمامية صحية, MTs الأمامية التالفة من عدم كفاية التشوه، و MTs الخلفية التي تم تحديدها بشكل خاطئ. لاحظ أن MTs الأمامية صحية عرض شريحة أولية عمياء متوسعة واضحة، وشريحة انتقالية ضيقة مع التعبير المتزايد نسبيا من UAS-pHerry عندما يقودها capaR-GAL4،وشريحة رئيسية بعيدة. MTs التالفة عرض مجاميع ملحوظة من مشر مضان مع عدم وجود مضان SEpH المقابلة. MTs الخلفية هي موحدة في القطر مع عدم وجود شرائح متميزة شكليا. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.