Overview
وتستخدم عضلات الطيران Drosophila كنظام نموذجي لتطوير العضلات وعلم وظائف الأعضاء. يصف هذا الفيديو عضلات الطيران للبالغين ويسلط الضوء على بروتوكول لتشريح تطوير عضلات الطيران غير المباشرة المناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي من الخوادر.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من كاو وآخرون., تشريح Drosophila melanogaster عضلات الطيران لنهج Omics, J. Vis. Exp. (2019).
1. IFM تشريح بعد 48 ح APF
- تجميع المعدات اللازمة بما في ذلك اثنين #5 الملقط الصف البيولوجيا، مقص غرامة، والشرائح المجهر الزجاجي القياسية، الشريط عصا مزدوجة، ماصة، نصائح ماصة، الجليد الجاف، و (لتطبيقات الجيش الملكي النيبالي) كاشف العزل (انظر جدول المواد). قم بتبريد أنابيب PBS وmicrocentrife 1x على الجليد.
- باستخدام فرشاة طلاء مبللة بخفة ، قم بنقل الخوادر المرحلية إلى شريط من الشريط اللاصق على الوجهين المثبت على شريحة المجهر(الشكل 1A). ضع الخوادر في خط ، موجهة في نفس الاتجاه (البطني لأسفل والجزء الأمامي نحو الجزء السفلي من الشريحة).
ملاحظة: يجب الحرص على عدم استخدام الكثير من الماء على فرشاة الطلاء أو مرشح، أو الخوادر لن عصا بشكل جيد. إذا لم تلتصق الجراء ، فجففها عن طريق نقلها أولا إلى فلتر جاف أو ورق أنسجة. جبل كما pupae كثيرة كما يمكن تشريحها في غضون فترة زمنية 30 دقيقة، من الناحية المثالية ~ 10 pupae. - إزالة الخوادر من حالة الجرو. استخدام ملقط ندف وبصرف النظر وفتح حالة pupal فوق spiracles الأمامية (الشكل 1B).
- الشريحة بلطف زوج من ملقط الظهر نحو الخلفي، وقطع حالة pupal كما تتحرك ملقط(الشكل 1B'). يجب الحرص على عدم تمزق pupa الكامنة. تحرير الجراء من حالة فتح ونقله على الفور إلى قطرة من برنامج تلفزيوني 1x على شريحة المجهر الثاني(الشكل 1B",C).
- كرر الخطوتين 1.3 و 1.4 لجميع الخوخ في السطر، ثم تعيين الشريحة الشريط عصا مزدوجة جانبا.
- باستخدام مقص غرامة، وقطع البطن من الخوخ بعيدا عن الصدر ودفعه إلى كومة منفصلة(الشكل 1D، D'). كرر للجراء المتبقية.
ملاحظة: بدء توقيت طول تشريح مع الخطوة 1.6، حالما يتم تعطيل سلامة الجراء. تشريح أكبر عدد ممكن من الذباب في 20-30 دقيقة لمنع موت الخلايا والتغيرات المرتبطة transcriptomic وبروتيوميك. عند تشريح 1 د البالغين أو > 90 ح الخوادر، فإنه غالبا ما يكون من المناسب للخطوات اللاحقة لإزالة الرأس بالإضافة إلى ذلك مع مقص غرامة. - باستخدام ورقة الأنسجة ، وإزالة غالبية برنامج تلفزيوني 1x (غائم عموما مع الدهون المعلقة) ، فضلا عن كومة من البطن(الشكل 1ه). إضافة قطرة من الطازجة، المبردة 1x برنامج تلفزيوني إلى الصدر المتبقية.
- استخدم المقص لقطع الصدر إلى نصفين(الشكل 1F، F') عن طريق قطع من الرأس إلى أسفل محور الجسم الطولي في حركة واحدة. بالتناوب، إذا تمت إزالة الرأس، أولا إدراج مقص حيث تم إرفاق الرأس وقطع النصف العلوي من الصدر طوليا بين IFMs. ثم، قطع الجانب البطني من الصدر مع قطع الثاني في نفس الاتجاه.
- كرر الخطوتين 1.7 و 1.8 لجميع الخوادر التي سيتم تشريحها ، مما يولد كومة من شفط الصدر بالقرب من وسط الشريحة. تأكد من وجود ما يكفي من المبردة 1x برنامج تلفزيوني على الشريحة بحيث لا تجف hemisections.
ملاحظة: بعد 48 h APF ، تكون IFMs كبيرة بما يكفي لتكون مرئية تحت مجهر تشريح قياسي للعين المدربة. عند هذه النقطة في البروتوكول، يمكن نقل العضلات مع تسمية الفلورسنت إلى نطاق تشريح الفلورسنت للمساعدة في تحديد IFM أو لأغراض التدريب، ولكن هذا ليس ضروريا. - تشريح IFMs من الصدر. عزل واحدة من hemisections باستخدام ملقط #5 (الشكل 1G, H). إدراج بلطف نصائح من ملقط واحد فوق وتحت منتصف IFMs (الشكل 1G', H '). في حين عقد ملقط الأولى لا يزال، واستخدام مقص غرامة لقطع نهاية واحدة من IFM بعيدا عن لطيف والأوتار. ثم، وقطع الطرف الآخر من IFM خالية من كندل(الشكل 1G''، H'' ).
ملاحظة: اعتمادا على اتجاه الصدر بعد قطع IFM الأولى، فمن المفيد لتدوير الصدر 180 درجة بحيث قطع IFM الثاني هو أسهل لأداء. - إزالة حزمة IFM من الصدر مع ملقط(الشكل 1G'''، H''')، ونقله إلى حافة فقاعة PBS لاستخدام التوتر المياه لعقد في مكان(الشكل 1أنا). دفع الذبيحة إلى الجانب الآخر من الشريحة. كرر لشفط الصدر المتبقية، وتوليد مجموعة من IFMs تشريح.
ملاحظة: إذا كانت IFMs لا تبقى في كومة أنيق، وإزالة بعض من برنامج تلفزيوني 1x مع الأنسجة. يجب الحرص على عدم السماح لجميع برنامج تلفزيوني تتبخر، وضمان أن IFMs تشريح و hemithoraxes لا تزال مغطاة المخزن المؤقت. - بعد تشريح جميع IFMs، بسرعة إجراء مراقبة الجودة على العضلات تشريح. باستخدام ملقط #5، وإزالة أي عضلات القفز أو شظايا لطيف التي قد وجدت طريقها إلى العينة(الشكل 1J-K'').
ملاحظة: القفز العضلات يبدو مختلفا عن IFM. إذا تشريح Mef2-Gal4 المسمى العضلات تحت الفلورسينس، والقفز العضلات لديه مضان أضعف وشكل مختلف والملمس. تحت الضوء العادي، يبدو شفافا تقريبا في حين أن IFMs هي مبهمة، أصفر حليبي(الشكل 1J-J'،K). - باستخدام توتر المياه ، والتقاط (ولكن لا اسفنجي) IFMs تشريح بين زوج من ملقط(الشكل 1لتر). نقل IFMs إلى أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مملوءة مسبقا مع 250 ميكرولتر من المبردة 1x PBS (الشكل 1M). تابع فورا مع القسم 2.
ملاحظة: عندما يتم إحضارها نصائح ملقط على مقربة من بعضها البعض ورفعها من حل عازلة، التوتر المياه يسبب فقاعة من العازلة ليتم التقاطها بين نصائح ملقط. وإذا كانت الأجهزة المالية الدولية موجودة أيضا في هذه الفقاعة، فيمكن إخراجها من الحل ونقلها بسهولة إلى وعاء آخر مملوء بالمخزن المؤقت. من المهم الضغط على ملقط لجلب النصائح بالقرب من بعضها البعض دون لمس بعضها البعض، لتجنب تهكم الأنسجة التي تم التقاطها في فقاعة العازلة.
2. بيليه والحفاظ على عينة IFM
- بيليه IFMs عن طريق الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل لمدة 3-5 دقائق في 2000 × ز في جهاز طرد مركزي أعلى الجدول (الشكل 2A, B).
- إزالة المخزن المؤقت باستخدام تلميح ماصة (الشكل 2C).
- لتطبيقات الجيش الملكي النيبالي، resuspend بيليه IFM في 50-100 ميكرولتر من العازلة العزل الحمض النووي الريبي المطلوب (انظر جدول المواد، الشكل 2D). وإلا، انتقل إلى الخطوة 2.4.
ملاحظة: يمكن تجميد IFMs بعد الخطوة 2.2 لتحضيرات قياس الطيف الكتلي أو عزل الحمض النووي الريبي مع مجموعات تجارية (انظر النتائج التمثيلية). بالنسبة لتطبيقات الحمض النووي الريبي ، يتم الحصول على نتائج أفضل عن طريق إعادة تعليق وتجميد بيليه IFM على الفور في عازل العزل. - تجميد عينة على الجليد الجاف أو تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل (الشكل 2ه). تخزين في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للخطوات اللاحقة في إعداد عينة لتحليل المصب.
ملاحظة: بعد حفظ التبريد، يمكن تخزين العينات لعدة أشهر قبل معالجتها للتحقيق في المصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: تشريح الأجهزة IFMs بعد 48 h APF. (أ) محاذاة الخوادر على شريط عصا مزدوجة. (ب)إزالة الخوادر من حالة الجراء عن طريق فتح الأمامية، وقطع الحالة الظهري(ب')،ورفع من الجراء(B''). تمثل رموز الدائرة نفس الشكل 2. (ج)نقل الخوادر إلى المخزن المؤقت. (د)إزالة البطن عن طريق قطع مع مقص (السهام المزدوجة الصفراء) والانفصال عن الصدر(D'). (E,F) إضافة عازلة نظيفة (E)، ثم قطع الصدر في نصف طولي(F، F'). (G,H) تشريح يمكن القيام به تحت الضوء الأبيض (G) أو مضان لتصور GFP (H); قطع من IFMs على جانب واحد(G'، ثم الجانب الآخر(G''؛ رفع من الصدر مع ملقط (المبينة باللون الرمادي) (G'''). (I,J,K) جمع IFMs في العازلة (I) وإزالة تلوث الحبل العصبي البطني (VNC), الأمعاء, والقفز العضلات (TDT) (J) لتوليد عينة IFM نظيفة (K). TDT أقل GFP التعبير وشكل مختلف عن ألياف IFM(J'' ، K '). (L, M) استخدام ملقط لنقل IFMs (L) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق(M). أشرطة المقياس = 1 سم (A, E, M), 1 مم (B-D', F-L). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حفظ IFM وتفاصيل عزل الجيش الملكي النيبالي. (أ)يتم إعادة كريات IFMs بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 × ز. (ب)بيليه IFM (السهم) والكريه تحت الفلورسينس(B'). (ج) إزالة كل العازلة مع طرف ماصة. (D) لاستخراج الحمض النووي الريبي، وإعادة الإنفاق من بيليه في العزل العازلة. يمكن تخطي هذه الخطوة إلى IFMs تشريح تجميد الجافة. (ه)تجميد العينة في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف والتخزين عند -80 درجة مئوية. أشرطة المقياس = 10 سم (A)، 1 مم (B، B')، 1 سم (C، D، E). (F)نانوجرام (نانوغرام) من إجمالي الحمض النووي الريبي من IFM تشريح تم الحصول عليها لكل ذبابة في 16 H APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF, و 1 د الكبار. أشرطة الخطأ = SD. (G) مجموع الحمض النووي الريبي معزولة عن IFM تشريح من الذباب الكبار 1 50 د باستخدام أساليب استخراج مختلفة. أشرطة الخطأ = SD. (H) آثار تمثيلية إلى سلامة الحمض النووي الريبي المقايسة بعد طرق استخراج مختلفة. العصابات ribosomal تشغيل أقل قليلا من 2000 النيوكليوتيدات (NT) والفرقة علامة في 25 NT. آثار إضافية متوفرة في الشكل التكميلي 1. (I)آثار تمثيلية لعينة الحمض النووي الريبي معزولة حديثا (أعلى)، عينة تجميد ذوبان 25x على الجليد الجاف (المؤامرة الثانية)، عينة تركت لمدة 4 ساعة على مقاعد البدلاء (مؤامرة ثالثة)، وعينة تعامل مع RNase A (مؤامرة أسفل). لاحظ تدهور كامل من الحمض النووي الريبي عند إضافة RNase A. (J) RT-PCR هلام من مجموعات كما وصفت لbru1 و rp49. يتم رسم الكثافة النسبية للفرقة bru1 تطبيع ضد rp49 أدناه. أشرطة الخطأ = SEM (غير مدفوع t-test, p = 0.0119). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي رقم 1. (A, B, C) ينتج الحمض النووي الريبي من عينات من نفس النمط الجيني تشريحها من قبل نفس الباحث في نفس الأسبوع. وبعد تشريح جميع العينات، تم عزل الحمض النووي الريبي وقياسه في اليوم نفسه. (أ)نانوجرام (نانوغرام) من إجمالي الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من تشريح IFM لكل 1 د ذبابة الكبار. أشرطة الخطأ = SEM. (B) إجمالي الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من IFM تشريح لكل ذبابة في 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF و 1 د الكبار. (ج)مجموع الحمض النووي الريبي معزولة عن IFM تشريحها من الذباب البالغ 1 50 د باستخدام أساليب استخراج مختلفة. (د)مجموع تركيزات الحمض النووي الريبي لكل ذبابة من الساقين تشريح، والقفز العضلات (TDT) وIFM. يتم الحصول على المزيد من الحمض النووي الريبي من أكبر IFMs. أشرطة الخطأ = SD. (E) مجموع تركيزات الحمض النووي الريبي لكل ذبابة من IFM تشريحها من الضوابط مقارنة مع عينات RNAI أو متحولة في 30 H APF, 72 h APF و 1 د الكبار. بالنسبة للمسوخ ، تم استخدام w1118 كتحكم في النمط البري. يتم تجميع البيانات متحولة من bru1-IR، salm-/- وآخر متحولة بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة. لاحظ أنه بالنسبة لهذه التلاعبات ، يتم تقليل غلة الحمض النووي الريبي في 1 د الكبار بسبب ضمور العضلات والخسارة ، لذلك المزيد من الذباب تحتاج إلى تشريح للحصول على كميات كافية لنهج omics. أشرطة الأخطاء = SD. (F) آثار إضافية تظهر سلامة الحمض النووي الريبي لأساليب عزل الحمض النووي الريبي الموضحة في الشكل 2G وفي C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
