Drosophila Sen Pupa Indirekte Flight Muscle (IFM) Dissektion: En metode til High-Throughput Tissue Collection

Overview

Drosophila-flyvemusklerne bruges som modelsystem til muskeludvikling og fysiologi. Denne video beskriver flyvningen muskulatur af voksne og fremhæver en protokol til at dissekere udvikle indirekte flyvning muskler, der er egnede til RNA sekventering fra pupper.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Kao et al.,Dissektion af Drosophila melanogaster Flight Muskler til Omics Tilgange, J. Vis. Exp. (2019).

1. IFM Dissektion Efter 48 h APF

1. Saml nødvendigt udstyr, herunder to #5 af biologikvalitet pincet, fin saks, standard glasmikroskop dias, dobbelt-stick tape, pipette, pipette tips, tøris, og (for RNA applikationer) isolation reagens (se Tabel over materialer). Chill 1x PBS og mikrocentrifuge rør på is.
2. Ved hjælp af en let fugtet pensel overføres den iscenesatte pupper til en strimmel dobbeltsidet klæbebånd monteret på et mikroskopdias (Figur 1A). Placer pupperne i en linje, orienteret i samme retning (ventral ned og forreste mod bunden af diaset).
   BEMÆRK: Pas på ikke at bruge for meget vand på penslen eller filteret, ellers holder pupperne sig ikke godt. Hvis pupperne ikke klæber, skal du tørre dem ved først at overføre til et tørt filter eller silkepapir. Monter så mange pupper som kan dissekeres inden for en 30 min tidsvindue, ideelt ~ 10 pupper.
3. Fjern puppen fra pupaletuiet. Brug pincet til at drille fra hinanden og åbne pupal sagen over den forreste spirakler(Figur 1B).
4. Skub forsigtigt et par pincets ihærdigt mod den bageste, og skær pupalkassen, når tangen bevæger sig(figur 1B'). Pas på ikke at sprænge den underliggende puppe. Frigør puppen fra den åbnede kasse, og overfør den straks til en dråbe 1x PBS på et andet mikroskopdias(Figur 1B",C).
5. Gentag trin 1.3 og 1.4 for alle pupper i linjen, og sæt derefter dobbelt-stick tape dias til side.
6. Ved hjælp af den fine saks skæres puppens underliv væk fra brystkassen og skubbes ind i en separat bunke(Figur 1D,D'). Gentag for de resterende pupper.
   BEMÆRK: Begynd timingen af dissektionens længde med trin 1.6, så snart pupalintegriteten er forstyrret. Dissekere så mange fluer som muligt i 20-30 minutter for at forhindre celledød og tilhørende transskriptions- og proteomiske ændringer. Når dissekere 1 d voksne eller >90 h pupper, er det ofte bekvemt for senere trin til desuden at fjerne hovedet med den fine saks.
7. Ved hjælp af et silkepapir skal du fjerne størstedelen af 1x PBS (generelt overskyet med suspenderet fedt) samt bunken af maver (Figur 1E). Tilsæt en dråbe frisk, kølet 1x PBS til de resterende thoraxer.
8. Brug saksen til at skære brystkassen i halve (Figur 1F,F') ved at skære fra hovedet ned langs langsgående kropsakse i en enkelt bevægelse. Alternativt, hvis hovedet er blevet fjernet, skal du først indsætte saksen, hvor hovedet var fastgjort, og skære den øverste halvdel af brystkassen i længderetningen mellem IFMs. Skær derefter brystkassens ventrale side med et andet snit i samme retning.
9. Gentag trin 1.7 og 1.8 for alle pupper, der skal dissekeres, generere en bunke af thorax hemisections nær midten af diaset. Sørg for, at der er nok kølet 1x PBS på rutsjebanen, så hæmaliteten ikke tørrer ud.
   BEMÆRK: Efter 48 timers APF er IFMs store nok til at være synlige under et standard dissekerende mikroskop til det trænede øje. På dette tidspunkt i protokollen, muskler med en fluorescerende etiket kan flyttes til en fluorescerende dissekering anvendelsesområde til støtte i IFM identifikation eller til træningsformål, men det er ikke nødvendigt.
10. Dissekere IFMs ud af brystkassen. Isolere en af de hemisections ved hjælp af #5 pincet (Figur 1G, H). Sæt forsigtigt spidserne på en tang over og under midten af IFM'erne(figur 1G',H'). Mens du holder den første pincet stadig, skal du bruge fine saks til at skære den ene ende af IFM væk fra neglebånd og sener. Derefter skæres den anden ende af IFM fri for kutikula(figur 1G'',H'').
    BEMÆRK: Afhængigt af brystkassens retning efter det første IFM-snit er det nyttigt at rotere brystkassen 180°, så det andet IFM-snit er lettere at udføre.
11. Fjern IFM-bundtet fra brystkassen med tang (figur 1G''',H'''), og overfør det til kanten af PBS-boblen for at bruge vandspændingen til at holde den på plads (figur 1I). Skub slagtekroppen til den modsatte side af rutsjebanen. Gentag for de resterende thorax hemisections, genererer en samling af dissekeret IFMs.
    BEMÆRK: Hvis IFMs ikke ophold i en pæn bunke, fjerne nogle af de 1x PBS med et væv. Pas på ikke at lade hele PBS fordampe, og sørg for, at de dissekerede IFM'er og hemithoraxer forbliver dækket af buffer.
12. Når du har dissekeret alle IFMs, skal du hurtigt udføre en kvalitetskontrol på den dissekerede muskel. Ved hjælp af #5 pincet fjernes eventuelle hoppemuskel- eller neglebåndsfragmenter, der kan have fundet vej til prøven (Figur 1J-K'').
    BEMÆRK: Hoppe muskel synes forskellig fra IFM. Hvis dissekere Mef2-Gal4 mærket muskel under fluorescens, hoppe muskel har en svagere fluorescens og en anden form og tekstur. Under normalt lys ser det næsten gennemsigtigt ud, mens IFM'erne er en uigennemsigtig, mælkegul(Figur 1J-J'',K).
13. Ved hjælp af vandspænding, fange (men ikke klemme) dissekeret IFMs mellem et par pincet (Figur 1L). De ifm'er overføres til et 1,5 mL mikrocentrifugerør, der er forfyldt med 250 μL kølet 1x PBS(figur 1M). Fortsæt straks med afsnit 2.
    BEMÆRK: Når tangspidser bringes i nærheden af hinanden og løftes ud af en bufferopløsning, forårsager vandspænding, at en boble af buffer fanges mellem tangspidserne. Hvis IFMs også er til stede i denne boble, kan de løftes ud af opløsningen og let overføres til en anden bufferfyldt beholder. Det er vigtigt at presse tangen for at bringe spidserne i nærheden af hinanden uden at røre hinanden for at undgå at macerating vævet fanget i bufferboblen.

2. Pellet og bevar IFM-prøven

1. Pellet IFMs ved centrifuging af 1,5 mL mikrocentrifuge rør i 3-5 min ved 2.000 x g i en table-top centrifuge (Figur 2A, B).
2. Fjern bufferen ved hjælp af en pipettespids (Figur 2C).
3. For RNA-applikationer blev IFM-pelleten genbrugt i 50-100 μL af den ønskede RNA-isolationsbuffer (se Materialetabel, Figur 2D). Ellers skal du gå videre til trin 2.4.
   BEMÆRK: IFMs kan tørres ned efter trin 2.2 for massespektrometripræparater eller isolering af RNA med kommercielle kits (se repræsentative resultater). For RNA-applikationer opnås bedre resultater ved straks at genbruge og fryse IFM-pellet i isolationsbuffer.
4. Fryseprøve på tøris eller fastfrysning i flydende nitrogen (Figur 2E). Opbevares ved -80 °C, indtil det er klar til efterfølgende trin i prøveforberedelsen til downstream-analyse.
   BEMÆRK: Efter kryopræservering kan prøver opbevares i flere måneder før behandling til downstream-undersøgelse.

Representative Results

Figur 1: Dissektion af IFMs efter 48 timers APF. (A)Justering af pupper på dobbelt-stick tape. B) Fjernelse af pupper fra pupalkassen ved at åbne sig foran, skære i kabinettet i dorsalt (B)og løfte puppen ud (B''). Cirkelsymboler repræsenterede det samme som figur 2. (C) Overførsel af pupper til buffer. D) Fjernelse af maven ved at skære med en saks (gule dobbeltpile) og adskillelse fra brystkassen (D«). (E,F) Tilsætning af ren buffer (E), derefter skæring af brystkassen i halve længdegrader (F,F'). (G,H) Dissektioner kan udføres under hvidt lys (G) eller fluorescens for at visualisere GFP (H); skæring af IFMs på den ene side(G'),derefter den anden side(G''); løft ud af brystkassen med pincet (beskrevet med gråt) (G'''). (I,J,K) Opsamling af IFMs i buffer (I) og fjernelse af forurenende ventral nerveledning (VNC), tarm, og hoppe muskel (TDT) (J) til at generere en ren IFM prøve (K). TDT har lavere GFP-udtryk og en anden form end IFM-fibre (J'', K'). (L,M) Anvendelse af pincet til overførsel af IFMs (L) til et mikrocentrifugerør (M). Skalastænger = 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D',F-L). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Oplysninger om IFM-konservering og RNA-isolering. a) IFM'erne pelleteres ved centrifugering i 5 min. ved 2000 x g. b) IFM pellet (pil) og pellet under fluorescens (B«). (C) Fjernelse af alle buffere med pipettespids. (D) Til RNA-ekstraktion, genpension af pellet i isolationsbuffer. Dette trin kan springes over for at rense dissekerede IFM'er. (E)Frysning af prøven i flydende nitrogen eller på tøris og oplagring ved -80 °C. Skalastænger = 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogram (ng) af det samlede RNA fra dissekeret IFM opnået pr. flue ved 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF og 1 d voksen. Fejllinjer = SD. (G) Samlet RNA isoleret fra IFM dissekeret fra 50 1 d voksne fluer ved hjælp af forskellige ekstraktionsmetoder. Fejllinjer = SD. (H) Repræsentative spor for at analysere RNA-integritet efter forskellige udtrækningsmetoder. Den ribosomal bands køre lige under 2000 nukleotider (nt) og markør band på 25 nt. Yderligere spor findes i supplerende figur 1. (I) Repræsentative spor af en frisk isoleret RNA-prøve (øverst), en prøve, der er optøet 25x på tøris (andet observationsområde), en prøve tilbage i 4 timer på bænken (tredje observationsområde) og en prøve behandlet med RNase A (bundområde). Bemærk fuldstændig nedbrydning af RNA ved tilsætning af RNase A. (J) RT-PCR gel fra kits som mærket for bru1 og rp49. Den relative intensitet af bru1 bandet normaliseret mod RP49 er afbildet nedenfor. Fejllinjer = SEM (uparret t-test, p = 0,0119). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. (A,B,C) RNA udbytter fra prøver af samme genotype dissekeret af den samme forsker i samme uge. Efter at alle prøver var dissekeret, blev RNA isoleret og målt samme dag. (A) Nanogram (ng) af det samlede RNA fra IFM-dissektioner pr. 1 d voksenflyvning. Fejllinjer = SEM. (B) Samlet RNA opnået fra dissekeret IFM pr. flyve ved 30 timers APF, 48 timer APF, 72 timer APF og 1 d voksen. (C) Samlet RNA isoleret fra IFM dissekeret fra 50 1 d voksne fluer ved hjælp af forskellige ekstraktionsmetoder. (D) Samlede RNA-koncentrationer pr. flue fra dissekerede ben, hoppemusklen (TDT) og IFM. Der opnås mere RNA fra de større IFM'er. Fejllinjer = SD. (E) Samlede RNA-koncentrationer pr. flue af IFM dissekeret fra kontroller sammenlignet med RNAi- eller mutantprøver ved 30 h APF, 72 h APF og 1 d voksen. For mutanter blev w¹¹¹⁸ brugt som wildtype kontrol. Mutant data er indsamlet fra bru1-IR, salm^-/- og en anden RNA-bindende protein mutant. Bemærk, at for disse manipulationer reduceres RNA-udbyttet i 1 d voksen på grund af muskelatrofi og tab, så flere fluer skal dissekeres for at opnå tilstrækkelige mængder til omiske tilgange. Fejllinjer = SD. (F) Yderligere spor, der viser RNA-integritet for RNA-isoleringsmetoderne i figur 2G og c. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm culture dishes	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	used for photos not taken under a microscope
Double stick tape	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2]			Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3]			Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4	Bloomington Stock Center	BDSC:27390	Fly stock
Fly: salm[1]	Bloomington Stock Center	3274	Fly stock
Fly: salm[FRT]			Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR	Vienna Drosophila Research Center	GD41568	Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma	Bloomington Stock Center	BDSC:31776	Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP	Bloomington Stock Center	BDSC:5130	Fly stock
Fly: w[1118]	Bloomington Stock Center	3605	Fly stock
Fly: weeP26			Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster	ChromoTek	gba488-100
Glycogen	Invitrogen	10814-010
Image processing software, Photoshop CS6	Adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol	Life Technologies	15596018	Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit	Invitrogen	AM1907	TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	Zymo Research	R2070S	RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Z6110	We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit	New England Biolabs	T2010G	We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher	AM12400	RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides	Thermo Fisher	12342108	Standard slides, uncharged, 1 mm
Paintbrush	Marabu	1910000000	Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS buffer (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips	Elemental Scientific	ES-7000-0101	Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Pipette tips	Sigma-Aldrich	P5161	Universal 200 mL pipette tips
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer	Invitrogen	Q33238
RNase A	Promega	A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit	Invitrogen	18080-044	reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript	New England Biolabs	E3010S	reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit	Qiagen	205410	reverse transcription kit
Statistical software: GraphPad Prism	GraphPad Prism		www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel	Microsoft		Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Standard tissue wipes
Transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z350796	Plastic pipette
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper	Sigma-Aldrich	1004-070	Filter paper circles, Grade 4, 70 mm