Overview
De Drosophila vluchtspieren worden gebruikt als een modelsysteem voor spierontwikkeling en fysiologie. Deze video beschrijft het vluchtspierstelsel van volwassenen en belicht een protocol om het ontwikkelen van indirecte vluchtspieren te ontleden die geschikt zijn voor RNA-sequencing van poppen.
Protocol
Dit protocol is een uittreksel uit Kao et al., Dissectie van Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).
1. IFM Dissectie Na 48 h APF
- Monteer de benodigde apparatuur, waaronder twee #5 van biologische kwaliteit, fijne scharen, standaard glasmicroscoopglaasjes, dubbelstokband, pipet, pipettips, droogijs en (voor RNA-toepassingen) isolatiereagens (zie tabel met materialen). Koel de 1x PBS en microcentrifugebuizen op ijs.
- Breng de geënsceneerde poppen met behulp van een licht bevochtigde penseel over op een strook dubbelzijdig plakband die op een microscoopschuif is gemonteerd (afbeelding 1A). Plaats de poppen in een lijn, georiënteerd in dezelfde richting (ventrale naar beneden en voorste naar de onderkant van de dia).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet te veel water op de kwast of filter gebruikt, anders blijft de poppen niet goed plakken. Als poppen niet plakken, droog ze dan door ze eerst over te brengen op een droog filter of tissuepapier. Monteer zoveel poppen als kan worden ontleed binnen een tijdvenster van 30 minuten, idealiter ~ 10 poppen. - Verwijder de pop uit de poppenkast. Gebruik de tang om de pop uit elkaar te plagen en de popkoffer boven de voorste spiracles te openen (figuur 1B).
- Schuif voorzichtig een tang dorsaal naar de achterste, snijd de popbehuizing terwijl de tang beweegt (Figuur 1B'). Pas op dat u de onderliggende pop niet scheurt. Bevrijd de pop uit de geopende behuizing en breng deze onmiddellijk over in een druppel van 1x PBS op een tweede microscoopschuif (figuur 1B",C).
- Herhaal stap 1.3 en 1.4 voor alle poppen in de lijn en zet vervolgens de tapeschuif met dubbele stok opzij.
- Snijd met behulp van de fijne schaar de buik van de pop weg van de thorax en duw deze in een aparte stapel(afbeelding 1D,D'). Herhaal dit voor de resterende poppen.
OPMERKING: Begin met het timen van de lengte van de dissectie met stap 1.6, zodra de popintegriteit wordt verstoord. Ontleed zoveel mogelijk vliegen in 20-30 minuten om celdood en bijbehorende transcriptomische en proteomische veranderingen te voorkomen. Bij het ontleden van 1 d volwassenen of >90 h poppen, is het vaak handig voor latere stappen om het hoofd extra te verwijderen met de fijne schaar. - Verwijder met behulp van een tissuepapier het grootste deel van de 1x PBS (over het algemeen troebel met gesuspendeerd vet) en de stapel buiken (figuur 1E). Voeg een druppel verse, gekoelde 1x PBS toe aan de resterende thoraxen.
- Gebruik de schaar om de thorax doormidden te snijden (figuur 1F,F') door in één beweging van het hoofd langs de lengteas van het lichaam te snijden. Als de kop is verwijderd, plaatst u eerst de schaar waar de kop is bevestigd en snijdt u de bovenste helft van de thorax in de lengterichting tussen de IFM's. Snijd vervolgens de ventrale kant van de thorax met een tweede snede in dezelfde richting.
- Herhaal stap 1.7 en 1.8 om alle poppen te ontleden, waardoor een stapel thoraxbloedingen in de buurt van het midden van de glijbaan ontstaat. Zorg ervoor dat er voldoende gekoelde 1x PBS op de glijbaan zit, zodat de hemisections niet uitdrogen.
OPMERKING: Na 48 h APF zijn IFM's groot genoeg om zichtbaar te zijn onder een standaard ontleedmicroscoop naar het getrainde oog. Op dit punt in het protocol kunnen spieren met een fluorescerend label worden verplaatst naar een fluorescerende ontledingsruimte om te helpen bij IFM-identificatie of voor trainingsdoeleinden, maar dit is niet nodig. - Ontleed de IFM's uit de thorax. Isoleer een van de hemisections met behulp van de #5 tang (Figuur 1G,H). Steek voorzichtig de uiteinden van één tang boven en onder het midden van de IFM's (figuur 1G',H'). Terwijl u de eerste tang stil houdt, gebruikt u een fijne schaar om het ene uiteinde van het IFM weg te snijden van de nagelriem en pezen. Snijd vervolgens het andere uiteinde van het IFM vrij van de nagelriem (figuur 1G'',H'').
OPMERKING: Afhankelijk van de oriëntatie van de thorax na de eerste IFM-snede, is het handig om de thorax 180° te draaien, zodat de tweede IFM-snede gemakkelijker uit te voeren is. - Verwijder de IFM-bundel met een tang uit de thorax (afbeelding 1G''',H'''), waarbij deze naar de rand van de PBS-bel wordt overgebracht om waterspanning te gebruiken om deze op zijn plaats te houden (figuur 1I). Duw het karkas naar de andere kant van de glijbaan. Herhaal dit voor de resterende thoraxbloedingen en genereert een verzameling ontlede IFM's.
OPMERKING: Als de IFM's niet op een nette stapel blijven, verwijder dan een deel van de 1x PBS met een tissue. Zorg ervoor dat niet alle PBS verdampt en zorg ervoor dat de ontleedde IFM's en hemithoraxen bedekt blijven met buffer. - Voer na het ontleden van alle IFM's snel een kwaliteitscontrole uit op de ontlede spier. Verwijder met #5 tang eventuele sprongspier- of nagelriemfragmenten die mogelijk hun weg naar het monster hebben gevonden (figuur 1J-K'').
OPMERKING: Jump spier lijkt anders dan IFM. Als het ontleden van Mef2-Gal4 gelabeld spier onder fluorescentie, sprong spier heeft een zwakkere fluorescentie en een andere vorm en textuur. Bij normaal licht lijkt het bijna doorschijnend, terwijl de IFM's ondoorzichtig, melkgeel zijn (figuur 1J-J'',K). - Vang met behulp van waterspanning de ontlede IFMs op (maar niet) tussen een paar tangen (figuur 1L). Breng de IFM's over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die is voorgevuld met 250 μL gekoelde 1x PBS (figuur 1M). Ga onmiddellijk verder met sectie 2.
OPMERKING: Wanneer tangpunten in de nabijheid van elkaar worden gebracht en uit een bufferoplossing worden getild, zorgt waterspanning ervoor dat een bufferbel tussen de tangpunten wordt opgevangen. Als IFM's ook in deze bel aanwezig zijn, kunnen ze uit de oplossing worden getild en gemakkelijk worden overgebracht naar een andere met buffer gevulde recipiënt. Het is belangrijk om in de tang te knijpen om de uiteinden bij elkaar te brengen zonder elkaar aan te raken, om te voorkomen dat het weefsel dat in de bufferbel wordt gevangen, wordt gemacereerd.
2. Pellet en behoud van het IFM-monster
- Pelleteer de IFM's door de microcentrifugebuis van 1,5 ml gedurende 3-5 minuten bij 2.000 x g in een tafelcentrifuge te centrifugeren (figuur 2A,B).
- Verwijder de buffer met behulp van een pipettip (figuur 2C).
- Voor RNA-toepassingen moet de IFM-pellet worden geresuspendeerd in 50-100 μL van de gewenste RNA-isolatiebuffer (zie tabel met materialen, figuur 2D). Ga anders verder met stap 2.4.
OPMERKING: IFM's kunnen na stap 2.2 drooggevroren worden voor massaspectrometriepreparaten of isolatie van RNA met commerciële kits (zie representatieve resultaten). Voor RNA-toepassingen worden betere resultaten verkregen door de IFM-pellet onmiddellijk in isolatiebuffer te resuspenden en in te vriezen. - Vries het monster in op droogijs of vries in vloeibare stikstof (figuur 2E). Bewaren bij -80 °C tot het klaar is voor volgende stappen in de monstervoorbereiding voor downstreamanalyse.
OPMERKING: Na cryopreservatie kunnen monsters enkele maanden worden bewaard voordat ze worden verwerkt voor downstreamonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1: Dissectie van IFM's na 48 h APF. (A) Uitlijnen van poppen op dubbelstokband. (B) Verwijdering van poppen uit de poppenkast door de pop voorste opening, het dorsaal snijden van de kast (B') en het uittrekken van de pop (B''). Cirkelsymbolen vertegenwoordigden hetzelfde als figuur 2. (C) Overdracht van poppen naar buffer. (D) Verwijdering van de buik door snijden met een schaar (gele dubbele pijlen) en scheiding van thoraxen (D'). (E,F) Toevoeging van schone buffer (E), vervolgens snijden van thoraxen in de lengterichting (F,F'). (G,H) Dissecties kunnen worden uitgevoerd onder wit licht (G) of fluorescentie om de GFP (H) te visualiseren; snijden van de IFM's aan de ene kant (G'), dan aan de andere kant (G''); hijsen uit de thorax met tang (grijs omlijnd) (G'''). (I, J, K) Verzameling van IFM's in buffer (I) en verwijdering van vervuilend ventraal zenuwkoord (VNC), darm en sprongspier (TDT) (J) om een schoon IFM-monster (K) te genereren . TDT heeft een lagere GFP-expressie en een andere vorm dan IFM-vezels (J'', K'). (L,M) Gebruik van een tang om IFM's (L) over te brengen naar een microcentrifugebuis (M). Schaalbalken = 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D',F-L). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: IFM-conservering en RNA-isolatiedetails. (A) IFM 's worden geplet door centrifugeren gedurende 5 min bij 2000 x g. (B) IFM pellet (pijl) en pellet onder fluorescentie (B'). (C) Verwijderen van alle buffer met een pipetpunt. (D) Voor RNA-extractie, resuspensie van pellet in isolatiebuffer. Deze stap kan worden overgeslagen om ontlede IFM's droog te vriezen. ( E) Invriezen van monster in vloeibare stikstof of op droogijs en opslag bij -80 °C. Schaalbalken = 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogrammen (ng) van totaal RNA uit ontleed IFM verkregen per vlieg bij 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF en 1 d volwassene. Foutbalken = SD. (G) Totaal RNA geïsoleerd van IFM ontleed uit 50 1 d volwassen vliegen met behulp van verschillende extractiemethoden. Foutbalken = SD. (H) Representatieve sporen om de RNA-integriteit na verschillende extractiemethoden te controleren. De ribosomale banden lopen net onder 2000 nucleotiden (nt) en de markerband op 25 nt. Aanvullende sporen beschikbaar in aanvullende figuur 1. (I) Representatieve sporen van een vers geïsoleerd RNA-monster (boven), een monster dat 25x op droog ijs is ontdooid (tweede perceel), een monster dat gedurende 4 uur op de bank is achtergelaten (derde perceel) en een monster dat is behandeld met RNase A (onderste perceel). Let op volledige afbraak van RNA bij toevoeging van RNase A. (J) RT-PCR gel uit kits zoals gelabeld voor bru1 en rp49. De relatieve intensiteit van de bru1-band genormaliseerd tegen rp49 wordt hieronder uitgezet. Foutbalken = SEM (ongepaarde t-test, p = 0,0119). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1. (A, B, C) RNA levert op uit monsters van hetzelfde genotype die in dezelfde week door dezelfde onderzoeker zijn ontleed. Nadat alle monsters waren ontleed, werd RNA dezelfde dag geïsoleerd en gemeten. (A) Nanogrammen (ng) van totaal RNA verkregen uit IFM-dissecties per 1 d volwassen vlieg. Foutbalken = SEM. (B) Totaal RNA verkregen uit ontleed IFM per vlieg bij 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF en 1 d volwassene. (C) Totaal RNA geïsoleerd van IFM ontleed van 50 1 d volwassen vliegen met behulp van verschillende extractiemethoden. (D) Totale RNA-concentraties per vlieg uit ontlede benen, sprongspier (TDT) en IFM. Er wordt meer RNA verkregen van de grotere IFM's. Foutbalken = SD. (E) Totale RNA-concentraties per vlieg IFM ontleed uit controles in vergelijking met RNAi- of mutantmonsters bij 30 h APF, 72 h APF en 1 d volwassene. Voor mutanten werd w1118 gebruikt als wildtype controle. Mutantgegevens worden verzameld uit bru1-IR, salm-/- en een andere RNA-bindende eiwitmutant. Merk op dat voor deze manipulaties de RNA-opbrengsten bij volwassenen met 1 d worden verlaagd als gevolg van spieratrofie en verlies, dus meer vliegen moeten worden ontleed om voldoende hoeveelheden te verkrijgen voor omics-benaderingen. Foutbalken = SD. (F) Aanvullende sporen die de RNA-integriteit voor de RNA-isolatiemethoden weergeven in figuur 2G en in C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
