Overview
Drosophila flymuskler brukes som et modellsystem for muskelutvikling og fysiologi. Denne videoen beskriver flymuskulaturen til voksne og fremhever en protokoll for å dissekere utvikle indirekte flymuskler som er egnet for RNA-sekvensering fra pupper.
Protocol
Denne protokollen er et utdrag fra Kao et al.,Disseksjon av Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).
1. IFM Disseksjon etter 48 h APF
- Sett sammen nødvendig utstyr, inkludert to #5 biologiklasse tang, fin saks, standard glassmikroskop lysbilder, dobbeltpinne tape, pipette, pipettespisser, tørris og (for RNA-applikasjoner) isolasjonsreagens (se Materialfortegnelse). Kjøl ned 1x PBS og mikrocentrifuge rør på is.
- Bruk en lett fuktet pensel, overfør den iscenesatte pupaen til en stripe med dobbeltsidig klebrig tape montert på et mikroskopsklie (Figur 1A). Plasser puppene i en linje, orientert i samme retning (ventral ned og fremre mot bunnen av lysbildet).
MERK: Pass på at du ikke bruker for mye vann på penselen eller filteret, ellers vil ikke puppene holde seg godt. Hvis pupper ikke stikker, tørk dem ved først å overføre til et tørt filter eller vevspapir. Monter så mange pupper som kan dissekeres innen et 30 min tidsvindu, ideelt ~ 10 pupper. - Fjern puppen fra puppetuiet. Bruk tang til å erte fra hverandre og åpne puppetuiet over de fremre spirakler (Figur 1B).
- Skyv forsiktig et par tang dorsally mot bakre, kutte puppetuiet når tangene beveger seg (Figur 1B'). Vær forsiktig så du ikke bryter den underliggende puppen. Frigjør puppen fra den åpne saken og overfør den umiddelbart til en dråpe 1x PBS på et annet mikroskopsklie (Figur 1B",C).
- Gjenta trinn 1.3 og 1.4 for alle pupper i linjen, og sett deretter dobbeltpinnebåndet til side.
- Bruk den fine saksen til å kutte puppens underliv bort fra thoraxen og skyv den inn i en egen haug (Figur 1D,D'). Gjenta for de resterende puppene.
MERK: Begynn å tidsberegning lengden på disseksjon med trinn 1.6, så snart pupal integritet er forstyrret. Disseker så mange fluer som mulig i 20-30 min for å forhindre celledød og tilhørende transkripsjons- og proteomiske endringer. Når du dissekerer 1 d voksne eller >90 h pupper, er det ofte praktisk for senere trinn å i tillegg fjerne hodet med den fine saksen. - Bruk et silkepapir, fjern mesteparten av 1x PBS (generelt overskyet med suspendert fett) samt haugen med underliv (Figur 1E). Tilsett en dråpe fersk, kjølt 1x PBS til de resterende thoraxene.
- Bruk saksen til å kutte thoraxen i to (Figur 1F,F') ved å skjære fra hodet ned langsgående kroppsakse i en enkelt bevegelse. Alternativt, hvis hodet er fjernet, må du først sette inn saksen der hodet var festet og kutte den øverste halvdelen av thoraxen langsgående mellom IFM-ene. Klipp deretter den ventrale siden av thoraxen med et andre kutt i samme retning.
- Gjenta trinn 1.7 og 1.8 for at alle pupper skal dissekeres, noe som genererer en haug med thorax hemisections nær midten av lysbildet. Pass på at det er nok kjølt 1x PBS på lysbildet slik at hemiseksjonene ikke tørker ut.
MERK: Etter 48 timer APF er IFM-er store nok til å være synlige under et standard dissekeringsmikroskop til det trente øyet. På dette punktet i protokollen kan muskler med fluorescerende etikett flyttes til et fluorescerende dissekeringsområde for å hjelpe til med IFM-identifikasjon eller for treningsformål, men dette er ikke nødvendig. - Disseker IFM-ene ut av thoraxen. Isoler en av hemiseksjonene ved hjelp av #5 tang (Figur 1G,H). Sett forsiktig inn spissene på én tang over og under midten av IFM-ene (Figur 1G', H'). Mens du holder de første tangene stille, bruk fin saks for å kutte den ene enden av IFM bort fra kutikalen og senene. Deretter kutter du den andre enden av IFM fri for kutik sekken (Figur 1G'',H'').
MERK: Avhengig av thoraxens orientering etter det første IFM-kuttet, er det nyttig å rotere thoraxen 180° slik at det andre IFM-kuttet er lettere å utføre. - Fjern IFM-bunten fra thoraxen med tang (Figur 1G''',H'''), og oversett den til kanten av PBS-boblen for å bruke vannspenning til å holde den på plass (Figur 1I). Skyv slaktkroppen til motsatt side av lysbildet. Gjenta for de resterende thorax hemisections, generere en samling av dissekerte IFMs.
MERK: Hvis IFM-ene ikke holder seg i en fin haug, fjern noe av 1x PBS med et vev. Vær forsiktig så du ikke lar alle PBS fordampe, og sørg for at de dissekerte IFM-ene og hemithoraxene forblir dekket av buffer. - Etter dissekering av alle IFMs, utfør raskt en kvalitetskontroll på den dissekerte muskelen. Bruk #5 tang, fjern eventuelle hoppmuskulatur- eller kutiklede fragmenter som kan ha funnet veien inn i prøven (Figur 1J-K'').
MERK: Hoppemuskelen ser annerledes ut enn IFM. Hvis dissekering Mef2-Gal4 merket muskel under fluorescens, hoppe muskel har en svakere fluorescens og en annen form og tekstur. Under normalt lys ser det nesten gjennomskinnelig ut mens IFM-ene er ugjennomsiktige, melkegule (Figur 1J-J',K). - Bruk vannspenning til å fange opp (men ikke klem) de dissekerte IFM-ene mellom et par tang (figur 1L). Overfør IFM-ene til et 1,5 ml mikrosenterrør som er ferdigfylt med 250 μL kjølt 1x PBS (figur 1M). Fortsett umiddelbart med avsnitt 2.
MERK: Når tangspisser bringes i nærheten av hverandre og løftes ut av en bufferløsning, fører vannspenning til at en bufferboble fanges opp mellom tangspissene. Hvis DET OGSÅ finnes IFM-er i denne boblen, kan de løftes ut av løsningen og enkelt overføres til en annen bufferfylt beholder. Det er viktig å klemme tangene for å bringe spissene nær hverandre uten å berøre hverandre, for å unngå å macerating vevet fanget i bufferboblen.
2. Pellets og bevar IFM-prøven
- Pellet IFMs ved å sentrifugere 1,5 ml mikrosenterrør i 3–5 min ved 2000 x g i en bordplate sentrifuge (Figur 2A,B).
- Fjern bufferen ved hjelp av en pipettespiss (Figur 2C).
- For RNA-bruksområder må IFM-pelletsen brukes på nytt i 50–100 μL av ønsket RNA-isolasjonsbuffer (se Materialliste, figur 2D). Ellers går du videre til trinn 2.4.
MERK: IFMs kan tørkefrossen etter trinn 2.2 for massespektrometripreparater eller isolering av RNA med kommersielle sett (se representative resultater). For RNA-applikasjoner oppnås bedre resultater ved å umiddelbart resuspendere og fryse IFM-pelletsen i isolasjonsbuffer. - Frys prøven på tørris eller trykk på frys i flytende nitrogen (Figur 2E). Oppbevars ved -80 °C til den er klar for påfølgende trinn i prøvepreparering for nedstrømsanalyse.
MERK: Etter kryopreservering kan prøver lagres i flere måneder før behandling for nedstrøms undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Disseksjon av IFM-er etter 48 timer APF. (A) Justering av pupper på dobbeltpinnebånd. (B) Fjerning av pupper fra puppetuiet ved å åpne fremre, kutte saken dorsalt (B'), og løfte ut puppen (B''). Sirkelsymboler representerte det samme som Figur 2. (C) Overføring av pupper til buffer. (D) Fjerning av magen ved å kutte med saks (gule doble piler) og separasjon fra thoraxer (D '). (E,F) Tilsetning av ren buffer (E), deretter kutting av thoraxer i halv langsgående (F,F'). (G,H) Disseksjoner kan utføres under hvitt lys (G) eller fluorescens for å visualisere GFP (H); kutting av IFM-ene på den ene siden (G'), deretter den andre siden (G''); løfting ut av thoraxen med tang (skissert i grått) (G'''). (I,J,K) Innsamling av IFM-er i buffer (I) og fjerning av forurensende ventral nerveledning (VNC), tarm og hoppmuskel (TDT) (J) for å generere en ren IFM-prøve (K). TDT har lavere GFP-uttrykk og en annen form enn IFM-fibre (J'', K'). (L,M) Bruk av tang til å overføre IFM-er (L) til et mikrosenterrør (M). Skalastenger = 1 cm (A, E, M), 1 mm (B-D', F-L). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: IFM-bevaring og RNA-isolasjonsdetaljer. (A) IFM-er pelleteres ved sentrifugering i 5 minutter ved 2000 x g. (B) IFM pellet (pil) og pellets under fluorescens (B'). (C) Fjerning av all buffer med pipettespiss. (D) For RNA-ekstraksjon, resuspensasjon av pellets i isolasjonsbuffer. Dette trinnet kan hoppes over til tørrfrysing dissekerte IFMer. (E) Frysing av prøve i flytende nitrogen eller på tørris og lagring ved -80 °C. Skalastenger = 10 cm (A), 1 mm (B, B'), 1 cm (C, D, E). (F) Nanogrammer (ng) av total RNA fra dissekert IFM oppnådd per flue ved 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF og 1 d voksen. Feilfelt = SD. (G) Total RNA isolert fra IFM dissekert fra 50 1 d voksne fluer ved hjelp av forskjellige ekstraksjonsmetoder. Feilfelt = SD. (H) Representant sporer til analyse RNA-integritet etter forskjellige utvinningsmetoder. Ribosomale båndene går like under 2000 nukleotider (nt) og markørbåndet på 25 nt. Ytterligere spor tilgjengelig i tilleggs figur 1. (I) Representative spor av en nyisolert RNA-prøve (topp), en prøve fryse-tint 25x på tørris (andre tomt), en prøve igjen i 4 timer på benken (tredje tomt), og en prøve behandlet med RNase A (bunnplott). Legg merke til fullstendig nedbrytning av RNA ved tilsetning av RNase A. (J) RT-PCR gel fra sett som merket for bru1 og rp49. Den relative intensiteten til bru1-båndet normalisert mot RP49 er plottet nedenfor. Feilfelt = SEM (uparret t-test, p = 0,0119). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1. (A,B,C) RNA gir fra prøver av samme genotype dissekert av samme forsker samme uke. Etter at alle prøvene ble dissekert, ble RNA isolert og målt samme dag. (A) Nanogram (ng) av total RNA hentet fra IFM disseksjoner per 1 d voksen fly. Feilfelt = SEM. (B) Total RNA hentet fra dissekert IFM per flue ved 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF og 1 d voksen. (C) Total RNA isolert fra IFM dissekert fra 50 1 d voksne fluer ved hjelp av forskjellige ekstraksjonsmetoder. (D) Totale RNA-konsentrasjoner per flue fra dissekerte ben, hoppmuskel (TDT) og IFM. Mer RNA er hentet fra de større IFM-ene. Feilfelt = SD. (E) Totale RNA-konsentrasjoner per flue av IFM dissekert fra kontroller sammenlignet med RNAi eller mutantprøver ved 30 h APF, 72 h APF og 1 d voksen. For mutanter ble w1118 brukt som wildtype-kontroll. Mutantdata kompileres fra bru1-IR, salm-/- og et annet RNA-bindende proteinmutant. Merk at for disse manipulasjonene reduseres RNA-utbyttet hos 1 d voksen på grunn av muskelatrofi og tap, så flere fluer må dissekeres for å oppnå tilstrekkelige mengder for omics tilnærminger. Feilfelt = SD. (F) Flere spor som viser RNA-integritet for RNA-isolasjonsmetodene vist i figur 2G og i C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
