Overview
שרירי הטיסה של דרוזופילה משמשים כמערכת מודל להתפתחות שרירים ופיזיולוגיה. סרטון זה מתאר את שרירי הטיסה של מבוגרים ומדגיש פרוטוקול לנתח פיתוח שרירי טיסה עקיפים המתאימים לריצוף RNA מגולים.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Kao et al., ניתוח של דרוזופילה מלנוגסטר שרירי טיסה עבור גישות אומיק, J. Vis. Exp. (2019).
1. ניתוח IFM לאחר 48 שעות APF
- להרכיב ציוד נחוץ כולל שני מלקחיים כיתה ביולוגית #5, מספריים בסדר, שקופיות מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטית, קלטת מקל כפול, פיפטה, טיפים פיפטה, קרח יבש, ו (עבור יישומי RNA) מגיב בידוד (ראה טבלה של חומרים). מצננים את צינורות ה-1x PBS והמיקרוצנטריפוגות על הקרח.
- בעזרת מברשת צבע רטובה קלות, מעבירים את הגומה המבוימת לרצועה של סרט דביק דו-צדדי המותקן על מגלשת מיקרוסקופ(איור 1A). מניחים את הגומי בשורה, בכיוון זהה (גחון כלפי מטה ופנימי לכיוון החלק התחתון של השקופית).
שים לב: היזהר לא להשתמש יותר מדי מים על מברשת צבע או מסנן, או גולם לא מקל טוב. אם גולם לא נדבק, יבש אותם על ידי העברה ראשונה למסנן יבש או נייר טישו. הר כמו גולם רבים ככל שניתן לנתח בתוך חלון זמן של 30 דקות, אידיאלי ~ 10 גולם. - הסר את הגולם ממארז הפופאל. השתמשו במלקחיים כדי להקניט ולפתוח את מארז הגומות מעל הספירקלים לפני השימוש(איור 1B).
- החליקו בעדינות זוג מלקחיים לכיוון האחורי, וחתכו את מארז הגומה כשהכפות זזות (איור 1B). היזהר לא לקרוע את הגומה הבסיסית. שחררו את הגלם מהמארז שנפתח והעבירו אותו מיד לירידה של 1x PBS במגלשת מיקרוסקופשנייה (איור 1B",C).
- חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4 עבור כל הגומי בשורה ולאחר מכן הגדר את שקופית הקלטת של המקל הכפול הצידה.
- בעזרת המספריים העדינים, חותכים את הבטן של הגומה הרחק מבית החזה ודוחפים אותה לערימה נפרדת(איור 1D,D). חזור על זה לשאר הגומי.
שים לב: התחל לתזמן את אורך הניתוח עם שלב 1.6, ברגע שלמות pupal הוא שיבש. לנתח זבובים רבים ככל האפשר ב 20-30 דקות כדי למנוע מוות של תאים ושינויים תעתיקיים ופרוטאומיים הקשורים. בעת ניתוח 1 d מבוגרים או >90 שעות גולם, זה לעתים קרובות נוח עבור צעדים מאוחרים יותר כדי להסיר את הראש עם מספריים בסדר. - באמצעות נייר טישו, להסיר את רוב 1x PBS (בדרך כלל מעונן עם שומן מושעה) כמו גם את ערימת הבטן (איור 1E). מוסיפים טיפה של 1x PBS טרי ומצונן לשאר בית החזה.
- השתמש במספריים כדי לחתוך את בית החזה לשניים (איור 1F, F') על ידי חיתוך מהראש במורד ציר הגוף האורך בתנועה אחת. לחלופין, אם הראש הוסר, ראשית להכניס את המספריים שבו הראש היה מחובר לחתוך את החצי העליון של בית החזה longitudinally בין IFMs. לאחר מכן, לחתוך את הצד הגחוני של בית החזה עם חתך שני באותו אוריינטציה.
- חזור על שלבים 1.7 ו 1.8 עבור כל הגומות להיות מנותח, יצירת ערימה של hemisections בית החזה ליד מרכז המגלשה. ודא שיש מספיק PBS 1x מצונן בשקופית, כך hemisections לא להתייבש.
שים לב: לאחר 48 שעות APF, רכיבי IFM גדולים מספיק כדי להיות גלויים תחת מיקרוסקופ מנתח סטנדרטי לעין המאומנת. בשלב זה של הפרוטוקול, ניתן להעביר שרירים עם תווית פלואורסצנטית להיקף ניתוח פלואורסצנטי כדי לסייע בזיהוי IFM או למטרות אימון, אך אין בכך צורך. - לנתח את ה-IFMs מתוך בית החזה. בודדו את אחד המלקחיים באמצעות מלקחיים #5(איור 1G,H). הכנס בעדינות את קצות המלקחיים מעל ומתחת לאמצע ה- IFMs (איור 1G',H'). תוך החזקת המלקחיים הראשונים עדיין, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך קצה אחד של ה- IFM הרחק מהציפורניים והגידים. לאחר מכן, חותכים את הקצה השני של ה-IFM ללא הקוטיקל(איור 1G',H'').
שים לב: בהתאם לכיוון של בית החזה לאחר חתך IFM הראשון, כדאי לסובב את בית החזה 180° כך לחתוך IFM השני קל יותר לבצע. - הסירו את צרור ה-IFM מבית החזה עם מלקחיים(איור 1G''', H'''), והעבירו אותו לקצה בועת ה-PBS כדי להשתמש במתח מים כדי להחזיק אותו במקומו (איור 1I). דחוף את הפגר לצד הנגדי של השקופית. חזור על הפעולה עבור hemisections בית החזה הנותרים, יצירת אוסף של IFMs מנותח.
שים לב: אם ה- IFMs אינם נשארים בערימה מסודרת, הסר חלק מה- PBS 1x עם רקמה. היזהר לא לתת לכל PBS להתאדות, ולהבטיח כי IFMs מנותח hemithoraxes להישאר מכוסה על ידי חיץ. - לאחר ניתוח כל רכיבי ה- IFM, בצע במהירות בקרת איכות על השריר המנותח. בעזרת מלקחיים #5, יש להסיר שברי שריר קפיצה או קוטיקל שאולי מצאו את דרכם לתוך המדגם (איור 1J-K').
שים לב: שריר הקפיצה נראה שונה מ- IFM. אם מנתחים את שריר Mef2-Gal4 המסומן תחת פלואורסצנטיות, לשריר הקפיצה יש פלואורסצנטיות חלשה יותר וצורה ומרקם שונים. תחת אור רגיל, הוא נראה כמעט שקוף בעוד ה-IFMs הם צהובים אטומים וחלביים(איור 1J-J'',K). - באמצעות מתח מים, לכודים (אך אינם מועך) את ה- IFMs המנותחים בין זוג מלקחיים (איור 1L). העבירו את ה-IFMs לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל שמולא מראש ב-250 מיקרו-ל' של 1x PBS מצונן (איור 1M). המשך מיד עם סעיף 2.
שים לב: כאשר טיפים מלקחיים מובאים לקרבה אחד של השני והרים מתוך פתרון חיץ, מתח מים גורם בועה של חיץ להיתפס בין קצות מלקחיים. אם גם רכיבי IFM נמצאים בבועה זו, ניתן להסיר אותם מהפתרון ולהעבירם בקלות לכלי קיבול אחר מלא במאגר. חשוב לסחוט את המלקחיים כדי להביא את הטיפים אחד ליד השני מבלי לגעת זה בזה, כדי למנוע macerating הרקמה שנתפסו בבועת החיץ.
2. גלולה ולשמר את מדגם IFM
- גלול את ה-IFMs על ידי צנטריפוגה של צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל למשך 3-5 דקות ב-2,000 x גרם בצנטריפוגה עליונה בטבלה (איור 2A,B).
- הסירו את המאגר בעזרת קצה פיפטה (איור 2C).
- עבור יישומי RNA, התחדש גלולת IFM ב 50–100 μL של מאגר בידוד RNA הרצוי (ראה טבלה של חומרים, איור 2D). אחרת, המשך לשלב 2.4.
שים לב: IFMs ניתן להקפיא יבש לאחר שלב 2.2 עבור תכשירים ספקטרומטריה המונית או בידוד של RNA עם ערכות מסחריות (ראה תוצאות מייצגות). עבור יישומי RNA, תוצאות טובות יותר מתקבלות על ידי שימוש חוזר והקפאה מיידית של גלולת IFM במאגר בידוד. - להקפיא דגימה על קרח יבש או להקפיא בחנקן נוזלי (איור 2E). יש לאחסן ב-80°C עד לקבלת השלבים הבאים בהכנה לדוגמה לניתוח במורד הזרם.
שים לב: לאחר cryopreservation, דגימות ניתן לאחסן במשך כמה חודשים לפני עיבוד לחקירה במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: ניתוח של רכיבי IFMs לאחר 48 שעות APF. (A)יישור של גולם על קלטת מקל כפול. (B)הסרת גולם ממארז הפופאל על ידי פתיחה מראש, חיתוך התיק באופן דורסי(B') והרמת הגולם(B'). סמלי העיגול מייצגים את איור 2. (ג)העברת גולם למאגר. (D)הסרת הבטן על ידי חיתוך במספריים (חצים כפולים צהובים) והפרדה מבית החזה (D '). (E,F) תוספת של חיץ נקי (E), ולאחר מכן חיתוך של בית החזה במחצית longitudinally(F,F'). (ז,ח) ניתוחים יכולים להתבצע תחת אור לבן (G) או פלואורסצנטיות כדי לדמיין את GFP (H); חיתוך ה- IFMs בצד אחד (G '), ולאחר מכן בצד השני (G ''); מתרוממים מבית החזה עם מלקחיים (מתוארים באפור)(G'''). (I, J, K)) אוסף של IFMs במאגר(I)והסרה של חוט עצב גחוני מזהם (VNC), בטן, שריר קפיצה(J)כדי ליצור מדגם IFM נקי (K). ל- TDT יש ביטוי GFP נמוך יותר וצורה שונה מסיבי IFM (J'', K'). (L,M) שימוש במלקחיים להעברת רכיבי IFM(L)לצינור מיקרוצנטריפוגה(M). פסים בקנה מידה = 1 ס"מ (A, E, M), 1 מ"מ (B-D', F-L). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פרטי הבידוד של IFM ושימור רנ"א. (A)IFMs הם גלולות על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 x g. (B)גלולת IFM (חץ) וכדור תחת פלואורסצנטיות (B '). (C)הסרת כל המאגר עם קצה פיפטה. (D) עבור מיצוי RNA, שימוש חוזר של גלולה במאגר בידוד. ניתן לדלג על שלב זה כדי להקפיא יובש IFMs מנותח. (ה)הקפאת מדגם בחנקן נוזלי או על קרח יבש ואחסון ב -80 מעלות צלזיוס. פסים בקנה מידה = 10 ס"מ (A), 1 מ"מ (B,B'), 1 ס"מ (C, D, E). (ו)ננוגרם (ng) של RNA הכולל מ- IFM מנותח המתקבל לכל זבוב ב 16 שעות APF, 24 שעות APF, 30 שעות APF, 48 שעות APF, 72 שעות APF, 90 שעות APF, ו 1 d מבוגר. קווי שגיאה = SD. (G) סה"כ RNA מבודד מ- IFM מנותח מ 50 1 d זבובים בוגרים באמצעות שיטות חילוץ שונות. קווי שגיאה = SD. (H) עוקב אחר תקינות RNA בדיקה לאחר שיטות חילוץ שונות. הלהקות הריבוזומליות פועלות ממש מתחת ל-2000 נוקלאוטידים (nt) ולהקת הסמן ב-25 nt. עקבות נוספות ניתן למצוא באיור 1. (I)עקבות מייצגות של דגימת RNA מבודדת טרייה (למעלה), מדגם מופשר בהקפאה 25x על קרח יבש (חלקה שנייה), דגימה שנותרה 4 שעות על הספסל (חלקה שלישית), ודגימה שטופלה ב- RNase A (חלקה תחתונה). הערה השפלה מוחלטת של RNA עם תוספת של RNase A. (J) RT-PCR ג'ל מערכות כפי שכותרתו עבור bru1 ו rp49. האינטנסיביות היחסית של הלהקה bru1 מנורמל נגד rp49 הוא זמם להלן. קווי שגיאה = SEM (t-testלא משוכך, p = 0.0119). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1. (A, B, C)) RNA מניב מדגימות של אותו גנוטיפ מנותח על ידי אותו חוקר באותו שבוע. לאחר שכל הדגימות נותחו, רנ"א בודד ונמדד באותו יום. (A)ננוגרם (ng) של RNA הכולל המתקבל ניתוחי IFM לכל 1 d זבוב מבוגר. קווי שגיאה = SEM. (B) סה"כ RNA המתקבל מ- IFM מנותח לטיסה במהירות של 30 שעות APF, 48 שעות APF, APF 72 שעות ומבוגר ד'. (C) סה"כ RNA מבודד מ- IFM מנותח מ 50 1 d זבובים בוגרים באמצעות שיטות מיצוי שונות. (D) ריכוזי RNA סה"כ לכל זבוב מרגליים מנותבות, שריר קפיצה (TDT) ו- IFM. רנ"א נוסף מתקבל מה-IFMs הגדולים יותר. קווי שגיאה = SD. (E) סה"כ ריכוזי RNA לכל זבוב של IFM מנותח מפקדים בהשוואה לדגימות RNAi או מוטציה ב 30 שעות APF, 72 שעות APF ו 1 d מבוגר. עבור מוטנטים, w1118 שימש כבקרת wildtype. נתוני המוטנטים נאספים מ- bru1-IR, סלמה-/- ומוטנט חלבון מחייב RNA אחר. שים לב כי עבור מניפולציות אלה, תשואות RNA יורדים 1 d מבוגר עקב ניוון שרירים ואובדן, כך זבובים יותר צריך להיות מנותח כדי להשיג כמויות מספיקות עבור גישות omics. סרגלי שגיאות = SD. (F) עקבות נוספים המראים שלמות RNA עבור שיטות הבידוד של RNA המוצגות באיור 2G וב- C. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
