Overview
Die Drosophila Flugmuskeln werden als Modellsystem für Die Muskelentwicklung und Physiologie eingesetzt. Dieses Video beschreibt die Flugmuskulatur von Erwachsenen und hebt ein Protokoll hervor, um die Entwicklung indirekter Flugmuskeln zu sezieren, die für die RNA-Sequenzierung von Pupasen geeignet sind.
Protocol
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. (2019).
1. IFM-Sektion nach 48 h APF
- Montieren Sie die notwendigen Geräte, darunter zwei #5 Biologie-Grade-Zangen, feine Schere, Standard-Glasmikroskop-Dias, Doppel-Stick-Band, Pipette, Pipettenspitzen, Trockeneis und (für RNA-Anwendungen) Isolationsreagenz (siehe Tabelle der Materialien). Die 1x PBS und Mikrozentrifugenrohre auf Eis abkühlen.
- Übertragen Sie die inszenierten Welpen mit einem leicht benetzten Pinsel auf einen Streifen doppelseitiger Klebebande, die auf einem Mikroskopschlitten montiert sind (Abbildung 1A). Platzieren Sie die Pupae in einer Linie, die in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet ist (ventral nach unten und vorderam zum Unteren der Folie).
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel Wasser auf dem Pinsel oder Filter zu verwenden, oder die Pupae wird nicht gut kleben. Wenn Die Welpen nicht kleben, trocknen Sie sie, indem Sie sie zuerst in einen Trockenenoder oder Gewebepapier überführen. Montieren Sie so viele Pupae, wie innerhalb eines 30 min Zeitfensters seziert werden können, idealerweise 10 Pupae. - Entfernen Sie die Pupa aus dem Pupal-Gehäuse. Verwenden Sie Zangen, um auseinander zu necken und öffnen Sie das Pupalgehäuse über den vorderen Spiracles (Abbildung 1B).
- Schieben Sie vorsichtig ein Paar Zangen dorsal in Richtung des Hinterteils, schneiden Sie das Pupal-Gehäuse, wenn sich die Zangen bewegen (Abbildung 1B'). Achten Sie darauf, die zugrunde liegende Pupa nicht zu brechen. Befreien Sie den Pupa aus dem geöffneten Gehäuse und übertragen Sie ihn sofort auf einen Tropfen von 1x PBS auf einem zweiten Mikroskopschlitten(Abbildung 1B",C).
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 für alle Welpen in der Linie, und stellen Sie dann das Doppelknüppel-Dia beiseite.
- Mit der feinen Schere den Bauch der Pupa vom Thorax wegschneiden und in einen separaten Haufen schieben (Abbildung 1D,D'). Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Welpen.
HINWEIS: Beginnen Sie mit dem Timing der Sezieren mit Schritt 1.6, sobald die Pupalintegrität gestört ist. Sezieren Sie so viele Fliegen wie möglich in 20-30 min, um den Zelltod und die damit verbundenen transkriptomischen und proteomischen Veränderungen zu verhindern. Bei der Sezieren 1 d Erwachsene oder >90 h Pupae, ist es oft bequem für spätere Schritte, um zusätzlich den Kopf mit der feinen Schere zu entfernen. - Entfernen Sie mit einem Tissuepapier den Großteil der 1x PBS (in der Regel trüb mit hängendem Fett) sowie den Bauchstapel (Abbildung 1E). Fügen Sie einen Tropfen frische, gekühlte 1x PBS zu den verbleibenden Thoraxen hinzu.
- Verwenden Sie die Schere, um den Thorax in die Hälfte zu schneiden (Abbildung 1F,F'),indem Sie vom Kopf die Längskörperachse in einer einzigen Bewegung herunterschneiden. Wenn der Kopf entfernt wurde, legen Sie zunächst die Schere ein, an der der Kopf befestigt war, und schneiden Sie die obere Hälfte des Thorax längs zwischen den IFMs. Schneiden Sie dann die ventrale Seite des Thorax mit einem zweiten Schnitt in der gleichen Ausrichtung.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8, damit alle Welpen seziert werden, wodurch ein Haufen Thoraxhalbsektionen in der Nähe der Mitte der Rutsche erzeugt wird. Stellen Sie sicher, dass genügend gekühlte 1x PBS auf der Rutsche vorhanden sind, damit die Hemisections nicht austrocknen.
HINWEIS: Nach 48 h APF sind IFMs groß genug, um unter einem Standard-Sezierendes Mikroskop für das geschulte Auge sichtbar zu sein. An dieser Stelle des Protokolls können Muskeln mit einem fluoreszierenden Etikett in einen fluoreszierenden Sezierenden Bereich verschoben werden, um bei der IFM-Identifikation oder zu Trainingszwecken zu helfen, aber dies ist nicht notwendig. - Sezieren Sie die IFMs aus dem Thorax. Isolieren Sie einen der Hemisektionen mit den #5 Zangen (Abbildung 1G,H). Legen Sie vorsichtig die Spitzen einer Zange über und unter der Mitte der IFMs ein (Abbildung 1G',H'). Während Sie die ersten Zangen still halten, verwenden Sie eine feine Schere, um ein Ende des IFM von der Nagelhaut und den Sehnen wegzuschneiden. Dann schneiden Sie das andere Ende des IFM frei von der Nagelhaut (Abbildung 1G'',H'').
HINWEIS: Abhängig von der Ausrichtung des Thorax nach dem ersten IFM-Schnitt ist es sinnvoll, den Thorax um 180° zu drehen, damit der zweite IFM-Schnitt einfacher durchzuführen ist. - Entfernen Sie das IFM-Bundle mit Zangen aus dem Thorax (Abbildung 1G''',H'''), und übertragen Sie es an den Rand der PBS-Blase, um es mit Wasserspannung an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 1I). Schieben Sie den Kadaver auf die gegenüberliegende Seite der Rutsche. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Thorax-Hemisektionen, wodurch eine Sammlung von sezierten IFMs generiert wird.
HINWEIS: Wenn die IFMs nicht in einem ordentlichen Stapel bleiben, entfernen Sie einige der 1x PBS mit einem Gewebe. Achten Sie darauf, dass nicht alle PBS verdampfen, und stellen Sie sicher, dass die sezierten IFMs und Hemithoraxes durch Puffer abgedeckt bleiben. - Nach der Sezieren aller IFMs führen Sie schnell eine Qualitätskontrolle für den sezierten Muskel durch. Entfernen Sie mit #5 Zangen alle Sprungmuskel- oder Nagelfragmente, die ihren Weg in die Probe gefunden haben könnten (Abbildung 1J-K'').
HINWEIS: Sprungmuskel erscheint anders als IFM. Wenn Mef2-Gal4 beschriftet Muskel unter Fluoreszenz, Sprungmuskel hat eine schwächere Fluoreszenz und eine andere Form und Textur. Bei normalem Licht erscheint es fast durchscheinend, während die IFMs ein undurchsichtiges, milchiges Gelb sind (Abbildung 1J-J'',K). - Mit Wasserspannung, erfassen (aber nicht squish) die sezierten IFMs zwischen einem Paar Zangen (Abbildung 1L). Übertragen Sie die IFMs in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das mit 250 l gekühlten 1x PBS vorgefüllt ist (Abbildung 1M). Fahren Sie sofort mit Abschnitt 2 fort.
HINWEIS: Wenn Zangenspitzen in einander in die Nähe gebracht und aus einer Pufferlösung gehoben werden, führt die Wasserspannung dazu, dass eine Pufferblase zwischen den Zangenspitzen eingefangen wird. Wenn IFMs auch in dieser Blase vorhanden sind, können sie aus der Lösung gehoben und einfach in eine andere puffergefüllte Buchse übertragen werden. Es ist wichtig, die Zange zu drücken, um die Spitzen in die Nähe zu bringen, ohne sich gegenseitig zu berühren, um zu vermeiden, dass das in der Pufferblase gefangene Gewebe mazeriert wird.
2. Pellet und Konservieren der IFM-Probe
- Pellet die IFMs durch Zentrifugieren des 1,5 ml Mikrozentrifugenrohres für 3–5 min bei 2.000 x g in einer Tischzentrifuge (Abbildung 2A,B).
- Entfernen Sie den Puffer mit einer Pipettespitze (Abbildung 2C).
- Für RNA-Anwendungen können Sie das IFM-Pellet in 50–100 l des gewünschten RNA-Isolationspuffers aussetzen (siehe Materialtabelle, Abbildung 2D). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.4 fort.
HINWEIS: IFMs können nach Schritt 2.2 für Massenspektrometriepräparate oder Isolierung von RNA mit kommerziellen Kits trockengefroren werden (siehe repräsentative Ergebnisse). Bei RNA-Anwendungen werden bessere Ergebnisse erzielt, indem das IFM-Pellet im Isolationspuffer sofort wieder ausgesetzt und eingefroren wird. - Probe auf Trockeneis einfrieren oder in flüssigem Stickstoff einfrieren (Abbildung 2E). Bei -80 °C lagern, bis sie für nachfolgende Schritte in der Probenvorbereitung für die nachgelagerte Analyse bereit sind.
HINWEIS: Nach der Kryokonservierung können Proben mehrere Monate gelagert werden, bevor sie für die nachgelagerte Untersuchung verarbeitet werden.
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Representative Results
Abbildung 1: Zerlegung von IFMs nach 48 h APF. (A) Ausrichten von Pupae auf Doppelklebeband. (B) Entnahme von Pupilben aus dem Pupal-Fall durch Vorderöffnen, Dorsalschneiden (B') und Herausheben der Pupilbe (B''). Kreissymbole, die mit Abbildung 2dargestellt werden. (C) Übertragung von Pupae in Puffer. (D) Entfernung des Bauches durch Schneiden mit Schere (gelbe Doppelpfeile) und Trennung von Thoraxen (D'). (E,F) Zugabe eines sauberen Puffers (E), dann Schneiden der Thoraxen in halblängs (F,F'). (G,H) Dissektionen können unter weißem Licht (G) oder Fluoreszenz durchgeführt werden, um das GFP (H) zu visualisieren; Schneiden der IFMs auf der einen Seite (G'), dann die andere Seite (G''); Heben aus dem Thorax mit Zange (grau umrandet) (G'''). (I,J,K) Sammlung von IFMs im Puffer (I) und Entfernung von kontaminierenden ventralen Nervenschnur (VNC), Darm und Sprungmuskel (TDT) (J) um eine saubere IFM-Probe zu generieren (K). TDT hat eine niedrigere GFP-Expression und eine andere Form als IFM-Fasern (J'', K'). (L,M) Verwendung von Zangen zur Übertragung von IFMs (L) auf ein Mikrozentrifugenrohr (M). Skalenbalken = 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D', F-L). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: IFM-Konservierungs- und RNA-Isolationsdetails. (A) IFMs werden durch Zentrifugation für 5 min bei 2000 x gpelletiert. (B) IFM-Pellet (Pfeil) und Pellet unter Fluoreszenz (B'). (C) Entfernen des gesamten Puffers mit einer Pipettenspitze. (D) Zur RNA-Extraktion, Resuspension von Pellets im Isolationspuffer. Dieser Schritt kann übersprungen werden, um sezierte IFMs trocken zu frieren. (E) Einfrieren der Probe in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis und Lagerung bei -80 °C. Skalenbalken = 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogramme (ng) der gesamten RNA aus seziertem IFM, die pro Fliege bei 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF und 1 d Erwachsene erhalten wurden. Fehlerbalken = SD. (G) Gesamt-RNA isoliert von IFM isoliert von 50 1 d erwachsenen Fliegen mit verschiedenen Extraktionsmethoden. Fehlerbalken = SD. (H) Repräsentative Spuren zur Assay-RNA-Integrität nach verschiedenen Extraktionsmethoden. Die ribosomalen Bänder laufen knapp unter 2000 Nukleotiden (nt) und das Markerband bei 25 nt. Zusätzliche Spuren in Ergänzender Abbildung 1. (I) Repräsentative Spuren einer frisch isolierten RNA-Probe (oben), einer 25-fach gefrierenden Probe auf Trockeneis (zweites Diagramm), einer Probe, die 4 h auf der Bank (drittes Diagramm) zurückgelassen wurde, und einer mit RNase A (bodenförmigen) Probe. Beachten Sie den vollständigen Abbau der RNA nach Zugabe von RNase A. (J) RT-PCR Gel aus Kits, wie sie für bru1 und rp49gekennzeichnet sind. Die relative Intensität des bru1-Bandes, das gegen rp49 normalisiert ist, wird unten dargestellt. Fehlerbalken = SEM (ungepaartt t-test, p = 0.0119). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1. (A,B,C) RNA liefert aus Proben desselben Genotyps, die vom gleichen Forscher in derselben Woche seziert wurden. Nachdem alle Proben seziert wurden, wurde die RNA isoliert und am selben Tag gemessen. (A) Nanogramme (ng) der gesamten RNA, die aus IFM-Sektionen pro 1 d erwachsenen Flug gewonnen wurde. Fehlerbalken = SEM. (B) Gesamt-RNA aus seziertem IFM pro Fliege bei 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF und 1 d Erwachsene. (C) Gesamt-RNA isoliert aus IFM seziert von 50 1 d erwachsenen Fliegen mit verschiedenen Extraktionsmethoden. (D) Die Gesamt-RNA-Konzentrationen pro Fliege von sezierten Beinen, Sprungmuskel (TDT) und IFM. Mehr RNA wird aus den größeren IFMs gewonnen. Fehlerbalken = SD. (E) Die gesamten RNA-Konzentrationen pro Fliege von IFM, die von Kontrollen seziert wurden, verglichen mit RNAi- oder Mutantenproben bei 30 h APF, 72 h APF und 1 d Erwachsenen. Für Mutanten wurde w1118 als Wildtypkontrolle verwendet. Mutante Daten werden aus bru1-IR, salm-/- und einem weiteren RNA-bindenden Proteinmutanten zusammengestellt. Beachten Sie, dass für diese Manipulationen die RNA-Ausbeute in 1 d Erwachsenen aufgrund von Muskelatrophie und Verlust verringert wird, so dass mehr Fliegen seziert werden müssen, um ausreichende Mengen für Omics-Ansätze zu erhalten. Fehlerstäbe = SD. (F) Zusätzliche Spuren, die die RNA-Integrität für die in Abbildung 2G und Cdargestellten RNA-Isolationsmethoden zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
