Alimentação FITC-Dextran: Um método para quantificar a permeabilidade intestinal em C. elegans

Overview

Este vídeo introduz um método para visualizar e medir a integridade do lúmen intestinal C. elegans alimentando vermes fitc rotulados dextran.  O protocolo de exemplo mostra o ensaio feito com vermes tratados com 3,3'-diindolylmetano (DIM) e alimentados por patógenos.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Le et al, Medindo os Efeitos de Bactérias e Produtos Químicos sobre a Permeabilidade Intestinal de Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparação de placas de NGM para testar os efeitos de um produto químico (DIM) na Permeabilidade Intestinal de C. elegans Alimentado com P. aeruginosa
   1. Adicione 0,5 g de peptone, 0,6 g de NaCl, 195 mL de água destilada, um agitador magnético e 6,8 g de ágar a uma garrafa de vidro de 500 mL (Ágar NGM).
   2. Adicione 0,5 g de peptone, 0,6 g de NaCl, 195 mL de água destilada e um agitador magnético sem ágar a outra garrafa de vidro de 500 mL (caldo NGM).
   3. Autoclave as duas garrafas (dos passos 1.1-1.2), uma garrafa de vidro vazia de 100 mL e uma garrafa de vidro vazia de 500 mL por 15 min a 121 °C. Em seguida, deixe que as garrafas médias que contenham frio até 55 °C no banho de água por 30 minutos. Mantenha o ágar médio no banho de água e remova a garrafa contendo caldo (a partir da etapa 1.2) para o próximo passo.
   4. Adicione os produtos químicos aditivos ao caldo NGM: 0,4 mL de 1 M CaCl₂, 0,4 mL de colesterol no etanol (mL), 0,4 mL de 1 M MgSO₄ e 10 mL de 1 M KPO₄ (todos esses componentes devem ser esterilizados além do colesterol no etanol). Em seguida, mexa bem a mistura com um agitador magnético a 55 °C.
   5. Rotule a garrafa de vidro vazia de 500 mL com sulfóxido de dimetil (DMSO) e a garrafa de vidro vazia de 100 mL autoclaved com DIM.
   6. Transfira 50 mL de caldo NGM para a garrafa de 100 mL com rótulo DIM. Adicione 500 μL de 20 mM DIM na garrafa e misture bem.
      NOTA: O DIM é dissolvido em DMSO (estoque DIM de 20 mM).
   7. Remova rapidamente o meio ágar NGM do banho de água, adicione 50 mL do meio ágar NGM na garrafa com etiqueta DIM e misture bem.
   8. Coloque uma alíquota de 20 mL de meio NGM contendo DIM em cada placa de Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente cinco placas de GNM contendo DIM podem ser feitas a partir desta etapa.
      NOTA: A concentração final de DIM em cada placa de NGM será de 100 μM.
   9. Para preparar a placa NGM contendo DMSO, transfira 150 mL de caldo NGM para a garrafa de 500 mL rotulada por DMSO. Adicione 1,5 mL de DMSO à garrafa e misture bem.
   10. Adicione 150 mL do ágar médio ngm à garrafa rotulada DMSO e misture bem.
   11. Coloque uma alíquota de 20 mL de meio NGM contendo DMSO em cada placa de Petri de 90 mm x 15 mm. Aproximadamente quinze placas de NGM contendo DMSO podem ser feitas a partir desta etapa.
       NOTA: A concentração final de DMSO em cada placa de NGM será de 0,5%.
   12. Solidifique as placas em temperatura ambiente por pelo menos 3h e armazene-as a 4 °C até usar.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   13. Remova a cultura E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 da geladeira de 4 °C e vórtice da cultura corretamente antes de se espalhar para as placas de NGM.
   14. Coloque 800 μL da cultura bacteriana E. coli OP50 ou P. aeruginosa PAO1 em cada placa de ágar NGM fresca e deixe as placas secarem em uma incubadora de 20 °C durante a noite.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Para o terceiro experimento (Figura 1),foram preparadas duas placas de NGM contendo DMSO revestidas com E. coli OP50 ao vivo, uma placa NGM contendo DMSO revestida com P. aeruginosa PAO1 viva e uma placa NGM contendo DIM revestida com P. aeruginosa PAO1 viva.
2. Tratamento de Bactérias ou Alimentação DIM e FITC-dextran
   1. Incubar os ovos sincronizados com idade a 20 °C por 64 h em placas de NGM suplementadas com E. coli OP50 ao vivo como alimento.
   2. Lave a larva L4 sincronizada por idade com tampão S e transfira-as (mais de aproximadamente 500 vermes) para as placas de NGM de tratamento contendo diferentes bactérias e produtos químicos. Incubar a 20 °C por 48 h.
      NOTA: O tempo de tratamento pode variar de 24 a 72 h, de acordo com as bactérias e produtos químicos utilizados. O efeito terapêutico ou preventivo do DIM também pode ser avaliado pré-tratamento dos vermes com patógenos e, em seguida, tratar os vermes com DIM (o efeito terapêutico) ou pré-tratamento dos vermes com DIM e, em seguida, tratar com patógenos (o efeito preventivo).
   3. Para preparar as placas complementadas fitc-dextran, misture 2 mL de E. coli OP50 inativado a calor com 4 mg de FITC-dextran. Em seguida, divida 100 μL da mistura FITC-dextran e E. coli OP50 em vinte placas frescas de Ágar NGM (60 mm x 15 mm) e deixe as placas secarem por 1h em um banco limpo.
      NOTA: A concentração final do FITC-dextran em cada placa de NGM será de 20 μg/mL.
   4. Prepare cinco placas de NGM contendo E. coli OP50 sem FITC-dextran para o tratamento de controle do veículo. Para isso, divida e. coli OP50 inativado a calor de 100 μL para cada placa de ágar NGM fresco (60 mm x 15 mm) e deixe as placas secarem por 1h em um banco limpo.
      NOTA: Para cada experimento independente, são necessárias quinze placas de GNM complementadas pelo FITC-dextran e cinco placas de NGM sem FITC-dextran.
   5. Após 48h de tratamento (a partir da etapa 2.2), lave os vermes com tampão S, transfira os vermes para as placas complementadas FITC-dextran e as placas de NGM sem FITC-dextran, e incubar as placas durante a noite (14-15 h).
      NOTA: Para cada grupo de tratamento, são necessárias 5 réplicas de coloração FITC-dextran (ou alimentação de controle do veículo).
   6. Lave os worms com tampão S e deixe-os rastejar na placa de ágar NGM fresca por 1 h.
      NOTA: Para cada experimento independente, são necessárias 20 placas de NGM frescas. Nesta etapa, você pode usar a placa NGM suplementada sem ou com E. coli OP50.
   7. Adicione 50 μL de solução de formaldeído de 4% a cada poço de uma placa preta de fundo plano de 96.000. Transfira aproximadamente 50 vermes de cada placa de NGM para cada poço para medições de fluorescência. Após 1 a 2 min, remova completamente todo o formaldeído de cada poço e adicione 100 μL de meio de montagem para revestir os poços.
      NOTA: Solução de formaldeído (4%) é usado para imobilizar e consertar os vermes. Para cada grupo de tratamento, são utilizados 5 poços (5 réplicas) para análise de imagens.
3. Imagem C. elegans com o Sistema de Imagem Operetta e determinação da permeabilidade intestinal medindo a captação de fluorescência FITC-dextran
   NOTA: A estereomicroscopia fluorescente pode ser usada para análise de imagens em vez do sistema Operetta.
   1. Capture imagens de fluorescência e meça a intensidade da fluorescência usando o Sistema de Imagem de Alto Conteúdo da Operetta e analise as imagens com o software Harmony.
   2. No software Harmony, pressione o ícone Abra a tampa para abrir a tampa e coloque a placa na máquina.
   3. Configure os parâmetros.
   4. Clique em Configurar,selecione o tipo de placa (96-well corning flat-bottom) e adicione os canais (canais de campo brilhante e EGFP).
   5. Ajuste o layout. Vá para a seleção layoute selecione Track e ajuste os parâmetros (primeira imagem a 1 μm, número de planos são 10, distância é de 1 μm).
   6. Selecione um dos poços de tratamento e um campo de captura e pressione Teste para verificar se as imagens são satisfatórias na seção Executar experimento.
   7. Se as imagens forem satisfatórias, retorne à seção Configurar e pressione o ícone Redefinir no final da tela. Em seguida, selecione todos os poços alvo e um número adequado de campos de captura.
   8. Vá para Executar experimento novamente e digite o nome da placa, em seguida, pressione Começar a processar.
   9. Para medir a intensidade da fluorescência, vá até a seção de análise de imagens e insira a imagem. Encontre a célula escolhendo o canal EGFP e o método B. Ajuste o limiar comum para 0,5, área para >200 μm², fator dividido para 3.0, limiar individual para 0,18 e contraste com mais de 0,18. Em seguida, calcule as propriedades de intensidade e escolha a média como a saída. Pressione o ícone Aplicar para salvar a configuração.
   10. Vá até a seção Avaliação para medir a intensidade, obtendo um mapa de calor e tabela de dados. Defina o parâmetro Readout para Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Média por bem e inicie a avaliação.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   11. Para extrair os dados da Operetta, clique no botão Configuração e escolha o gerenciamento de dados.
   12. Escolha escrever arquivoe, em seguida, abra a navegação e selecione o arquivo.
   13. Para selecionar o arquivo, clique no pequeno + sinal no canto esquerdo e, em seguida, clique em Medição e escolha o nome da placa.
   14. Selecione o arquivo e clique em OK.
   15. Selecione o caminho para salvar o arquivo clicando no sinal Procurar no caminho ativo.
   16. Clique em Iniciar para salvar o arquivo de dados.
       NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Análise Estatística da Fluorescência FITC-dextran de C. elegans
   1. Importe os dados e calcule a média e o desvio padrão (SD) utilizando um software estatístico.
   2. Analise a diferença significativa com a análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey.

Representative Results

Figura 1: O efeito do DIM na permeabilidade intestinal de C. elegans alimentado P. aeruginosa. Imagens de microscopia de vermes de (A) E. coli OP50 sem alimentação FITC-dextran, (B) E. coli com alimentação FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 com alimentação FITC-dextran, e(D) P. aeruginosa e DIM (100 μM) cotratamento com fitc-detranx. Barra de escala = 1 mm (branco) e 200 μm (preto). As larvas L4 sincronizadas por idade foram incubadas por 48 h em placas de NGM semeadas com E. coli viva(A, B), P. aeruginosa viva(C), P. aeruginosa viva e DIM(D). Em seguida, os vermes foram transferidos para placas contendo FITC-dextran(B-D),exceto para o controle do veículo(A). (E) A intensidade da fluorescência fitc indica que a permeabilidade intestinal de C. elegans foi afetada por DIM. Colunas e barras de erro indicam a média ± SD. ***P < 0,001 para diferença significativa do controle do veículo. ^###P < 0,001 e ^##P < 0,01 para diferença significativa dos worms tratados com FITC-dextran alimentados com P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Este gráfico é representativo de dois experimentos independentes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N