Alimentazione FITC-Dextran: Un metodo per quantificare la permeabilità intestinale in C. elegans

Overview

Questo video introduce un metodo per visualizzare e misurare l'integrità del lume intestinale C. elegans alimentando vermi Dextran con etichetta FITC.  Il protocollo di esempio mostra il saggio fatto con vermi trattati con 3,3'-diindolilmetano (DIM) e alimentati da agenti patogeni.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparazione di piastre NGM per la prova degli effetti di una sostanza chimica (DIM) sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con P. aeruginosa
   1. Aggiungere 0,5 g di peptone, 0,6 g di NaCl, 195 ml di acqua distillata, un agitatore magnetico e 6,8 g di agar a una bottiglia di vetro da 500 ml (agar NGM).
   2. Aggiungere 0,5 g di peptone, 0,6 g di NaCl, 195 ml di acqua distillata e un agitatore magnetico senza agar ad un'altra bottiglia di vetro da 500 mL (brodo NGM).
   3. Autoclavare le due bottiglie (dai gradini 1.1–1.2), una bottiglia di vetro vuota da 100 ml e una bottiglia di vetro vuota da 500 mL per 15 minuti a 121 °C. Quindi, lasciare raffreddare il mezzo contenente bottiglie a 55 °C nel bagno d'acqua per 30 minuti. Tenere il mezzo agar nel bagno d'acqua e rimuovere la bottiglia contenente brodo (dal passaggio 1.2) per il passaggio successivo.
   4. Aggiungere le sostanze chimiche additive al brodo NGM: 0,4 mL di 1 M CaCl₂, 0,4 mL di colesterolo in etanolo (mL), 0,4 mL di 1 M MgSO₄ e 10 mL di 1 M KPO₄ (tutti questi componenti devono essere sterilizzati ad eccezione del colesterolo in etanolo). Quindi, mescolare accuratamente la miscela con un agitatore magnetico a 55 °C.
   5. Etichettare la bottiglia di vetro vuota da 500 ml autoclavata con solfossido di dimetile (DMSO) e la bottiglia di vetro vuota autoclavata da 100 ml con DIM.
   6. Trasferire 50 ml di brodo NGM nella bottiglia da 100 ml con etichetta DIM. Aggiungere 500 μL di 20 mM di stock DIM nella bottiglia e mescolare bene.
      NOTA: DIM viene sciolto in DMSO (20 mM di stock DIM).
   7. Rimuovere rapidamente il mezzo agar NGM dal bagno d'acqua, aggiungere 50 mL del mezzo agar NGM nel flacone etichettato DIM e mescolare accuratamente.
   8. Posizionare un'aliquota di 20 mL di mezzo NGM contenente DIM in ogni piastra di Petri da 90 mm x 15 mm. Circa cinque piastre NGM contenenti DIM possono essere realizzate da questo passaggio.
      NOTA: La concentrazione finale di DIM in ogni piastra NGM sarà di 100 μM.
   9. Per preparare la piastra NGM contenente DMSO, trasferire 150 ml di brodo NGM nella bottiglia da 500 mL etichettata DMSO. Aggiungere 1,5 ml di DMSO alla bottiglia e mescolare bene.
   10. Aggiungere 150 mL del mezzo agar NGM alla bottiglia etichettata DMSO e mescolare accuratamente.
   11. Posizionare un'aliquota di 20 mL di mezzo NGM contenente DMSO in ogni piastra di Petri da 90 mm x 15 mm. Da questo passaggio possono essere realizzate circa quindici piastre NGM contenenti DMSO.
       NOTA: La concentrazione finale di DMSO in ogni piastra NGM sarà dello 0,5%.
   12. Solidificare le piastre a temperatura ambiente per almeno 3 ore e conservarle a 4 °C fino all'uso.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   13. Rimuovere la coltura E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 dal frigorifero a 4 °C e vortice correttamente la coltura prima di diffondersi sulle piastre NGM.
   14. Mettere 800 μL della coltura batterica E. coli OP50 o P. aeruginosa PAO1 su ogni piastra di agar NGM fresca e lasciare asciugare le piastre in un incubatore di 20 °C durante la notte.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Per il terzo esperimento(figura 1),sono state preparate due piastre NGM contenenti DMSO rivestite con E. coli OP50 vivo, una piastra NGM contenente DMSO rivestita con P. aeruginosa PAO1 viva e una piastra NGM contenente DIM rivestita con P. aeruginosa PAO1 viva.
2. Trattamento di batteri o alimentazione DIM e FITC-dextran
   1. Incubare le uova sincronizzate con l'età a 20 °C per 64 ore su piastre NGM integrate con E. coli OP50 vivo come cibo.
   2. Lavare la larva L4 sincronizzata con l'età con S-buffer e trasferirla (più di circa 500 vermi) alle piastre NGM di trattamento contenenti diversi batteri e sostanze chimiche. Incubarli a 20 °C per 48 ore.
      NOTA: Il tempo di trattamento può variare da 24 a 72 ore, in base ai batteri e alle sostanze chimiche utilizzate. L'effetto terapeutico o preventivo di DIM può anche essere valutato pretrattando i vermi con agenti patogeni e quindi trattando i vermi con DIM (l'effetto terapeutico) o pretrattando i vermi con DIM e quindi trattando con agenti patogeni (l'effetto preventivo).
   3. Per preparare le piastre integrate da FITC-dextran, mescolare 2 mL di E. coli OP50 inattivato dal calore con 4 mg di FITC-dextran. Quindi, dividere 100 μL della miscela FITC-dextran ed E. coli OP50 in venti piastre di agar NGM fresche (60 mm x 15 mm) e lasciare asciugare le piastre per 1 h su una panca pulita.
      NOTA: La concentrazione finale di FITC-dextran in ogni piastra NGM sarà di 20 μg/mL.
   4. Preparare cinque piastre NGM contenenti E. coli OP50 senza FITC-dextran per il trattamento di controllo del veicolo. A tal fine, dividere 100 μL E. coli OP50 inattivato termicamente in ciascuna piastre di agar NGM fresche (60 mm x 15 mm) e lasciare asciugare le piastre per 1 h su una panca pulita.
      NOTA: Per ogni esperimento indipendente sono necessarie quindici piastre NGM integrate in FITC-dextran e cinque piastre NGM senza FITC-dextran.
   5. Dopo 48 ore di trattamento (dal passaggio 2.2), lavare i vermi con S-buffer, trasferire i vermi nelle piastre integrate FITC-dextran e nelle piastre NGM senza FITC-dextran e incubare le piastre durante la notte (14-15 h).
      NOTA: Per ogni gruppo di trattamento sono necessarie 5 repliche della colorazione FITC-dextran (o alimentazione del controllo del veicolo).
   6. Lavare i vermi con S-buffer e consentire loro di strisciare nella piastra di agar NGM fresca per 1 h.
      NOTA: Per ogni esperimento indipendente sono necessarie un totale di 20 piastre NGM fresche. In questo passaggio, è possibile utilizzare la piastra NGM integrata senza o con E. coli OP50.
   7. Aggiungere 50 μL di soluzione di formaldeide al 4% ad ogni pozzo di una piastra nera a fondo piatto da 96 po '. Trasferire circa 50 vermi da ogni piastra NGM in ogni pozzo per misurazioni della fluorescenza. Dopo 1-2 min, rimuovere accuratamente tutta la formaldeide da ogni pozzo e aggiungere 100 μL di mezzo di montaggio per rivestire i pozzetti.
      NOTA: Soluzione di formaldeide (4%) viene utilizzato per immobilizzare e riparare i vermi. Per ogni gruppo di trattamento, vengono utilizzati 5 pozzi (5 repliche) per l'analisi delle immagini.
3. Imaging C. elegans con il sistema di imaging Operetta e determinazione della permeabilità intestinale misurando l'assorbimento di fluorescenza FITC-dextran
   NOTA: La stereomicroscopia fluorescente può essere utilizzata per l'analisi delle immagini al posto del sistema Operetta.
   1. Cattura immagini a fluorescenza e misura l'intensità della fluorescenza utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto Operetta e analizza le immagini con il software Harmony.
   2. Nel software Harmony, premere l'icona Apri coperchio per aprire il coperchio e mettere la piastra nella macchina.
   3. Impostare i parametri.
   4. Fate clic su Imposta (Set up),selezionate il tipo di piastra (96-well corning flat-bottom) e aggiungete i canali (canali bright-field ed EGFP).
   5. Regolare il layout. Passare alla selezione Layout, quindi selezionare Traccia e regolare i parametri (prima immagine a 1 μm, numero di piani sono 10, distanza è 1 μm).
   6. Selezionare uno dei pozzi di trattamento e un campo di acquisizione e premere Test per verificare se le immagini sono soddisfacenti nella sezione Esegui esperimento.
   7. Se le immagini sono soddisfacenti, tornare alla sezione Configurazione e premere l'icona Reimposta alla fine dello schermo. Quindi, seleziona tutti i pozzi di destinazione e un numero adatto di campi di acquisizione.
   8. Passare di nuovo a Esegui esperimento e immettere il nome della piastra, quindi premere Start per iniziare l'elaborazione.
   9. Per misurare l'intensità della fluorescenza, vai alla sezione di analisi dell'immagine e inserisci l'immagine. Trovare la cella scegliendo il canale EGFP e il metodo B. Regolare la soglia comune a 0,5, l'area a >200 μm², il fattore di divisione a 3,0, la soglia individuale a 0,18 e il contrasto con più di 0,18. Quindi, calcola le proprietà di intensità e scegli la media come output. Premere l'icona Applica per salvare la configurazione.
   10. Passare alla sezione Valutazione per misurare l'intensità ottenendo una mappa termica e una tabella dati. Impostate il parametro Readout su Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well e iniziate la valutazione.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
   11. Per estrarre i dati da Operetta, fare clic sul pulsante Impostazione e scegliere Gestione dati.
   12. Scegliere Scrivi archivio, quindi aprire l'esplorazione e selezionare il file.
   13. Per selezionare il file, fare clic sul piccolo + segnale nell'angolo sinistro, quindi fare clic su Misurazione e scegliere Nome piastra.
   14. Selezionare il file e fare clic su OK.
   15. Selezionare il percorso per salvare il file facendo clic sul segnale Sfoglia nel percorso attivo.
   16. Fare clic sul pulsante Start per salvare il file di dati.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Analisi statistica della fluorescenza FITC-dextran di C. elegans
   1. Importare i dati e calcolare la deviazione media e standard (SD) utilizzando un software di statistica.
   2. Analizza la differenza significativa con l'analisi uni-way della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey.

Representative Results

Figura 1: L'effetto del DIM sulla permeabilità intestinale di C. elegans alimentati con P. aeruginosa. Immagini in microscopia di vermi di (A) E. coli OP50 senza alimentazione FITC-dextran, (B) E. coli con alimentazione FITC-dextran, (C) P. aeruginosa PAO1 con alimentazione FITC-dextran e (D) P. aeruginosa e DIM (100 μM) cotreatment con alimentazione FITC-dextran. Barra di scala = 1 mm (bianco) e 200 μm (nero). Le larve L4 sincronizzate con l'età sono state incubate per 48 ore in piastre NGM sementi con E. coli vivo (A, B), P. aeruginosa viva (C), P. aeruginosa viva e DIM(D). Quindi, i vermi sono stati trasferiti su piastre contenenti FITC-dextran (B-D), ad eccezione del controllo del veicolo (A). (E) L'intensità di fluorescenza FITC indica che la permeabilità intestinale di C. elegans è stata influenzata ± da DIM. ^###P < 0,001 e ^##P < 0,01 per una differenza significativa rispetto ai worm trattati con FITC-dextran alimentati con P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Questo grafico è rappresentativo di due esperimenti indipendenti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N