肌肉内注射（IM）：复合分娩到成年斑马鱼的躯干肌肉

Overview

该视频描述了肌肉注射技术，用于将化合物输送到成年斑马鱼的后部肌肉。

Protocol

1. 注射DNA疫苗和电扩散

1. 对于根据此协议的免疫接种，使用健康的6至12个月大的成年斑马鱼。将鱼保持在14/10小时光/暗循环的流动系统中，每1升水中最多有7条鱼。
2. 在水箱水中准备0.02%的3氨基苯甲酸乙酯（三甲酸）溶液（pH 7），用于麻醉鱼。使用10厘米的培养皿或类似的东西。
3. 用 3 升清洁系统水填充 5 升烧嘴，准备回收罐。
4. 准备疫苗接种填充物，使鱼在接种疫苗期间处于固定位置。取一块5×7厘米² 厘米厚的海绵。用手术刀刀片或锋利的剪刀将凹槽切入海绵中。
   注： 相同的疫苗接种填充可用于多个实验。通过将海绵浸泡在70%的乙醇中，对实验之间的海绵进行消毒，并允许干燥。
5. 将海绵浸泡在系统水中，并将海绵放在培养皿上。
6. 接种疫苗前24小时禁食鱼。
7. 麻醉一条斑马鱼，将其放在含有0.02%三角星的培养皿上。等到鱼对触摸刺激没有反应，直到刺没有运动。一次麻醉一条鱼。
8. 使用塑料勺子，将麻醉斑马鱼转移到湿海绵上，并将鱼的腹侧放到凹槽中。在正确的位置，确保鱼的头部和大部分身体在凹槽内，背鳍和尾巴从凹槽中伸出来。
9. 在显微镜下，使用微操纵器上的 x-和 y 轴微调轮，小心地将针头置于靠近斑马鱼躯干肌肉的大约 45° 角度。
10. 在背鳍前找到没有鳞片的小点，推针不需要力。如果感觉到阻力，请尝试相邻的位置。避免伤害脊椎、背鳍或鳞片。
    注： 如果针头在推力时弯曲，则通过切割稍微缩短针头。
11. 使用足部开关逐渐将疫苗溶液注射到肌肉中。通过显微镜观察注射：苯酚红色在进入肌肉组织时可见。如果需要，调整脉冲的持续时间。
    注： 或者，使用气动泵前面板上的脉冲启动按钮进行注射。但是，使用远程脚开关允许使用另一只手通过 10 转拨盘轮调整脉冲长度。避免注射溶液太快，因为这可能导致过度的组织损伤。确保不要注入任何空气。
12. 注射后立即对鱼进行电镀。确保鱼还在麻醉下。将鱼放在海绵上，将鱼放在钳子式电极之间，使电极位于注射点的每一侧。不要将电极钳子压得太紧，但要保持两个电极与鱼的接触。
    1. 按下电压器上的启动按钮，提供六个 40 V，50 ms 脉冲。
    2. 轻轻地将鱼转移到回收罐中。
    3. 每次电挥发后，用70%的乙醇刷净电极。
       注： 接种疫苗后仔细监测鱼的福祉。在0.04%的三卡因中安乐死任何有不适迹象的鱼（麻醉、异常游泳、喘气缓慢恢复）。恢复后，将鱼转移到流动单元，并正常喂养。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench