Внутримышечная (IM) инъекция: Доставка соединения в спинную мышцу взрослой зебры

Overview

Это видео описывает технику внутримышечной инъекции для доставки соединений в спинные мышцы взрослой зебры.

Protocol

1. Инъекция ДНК-вакцины и электропорации

1. Для иммунизации в соответствии с этим протоколом, используйте здоровые, от 6 до 12 месяцев взрослых зебры. Держите рыбу в сквозной системе с 14/10 ч свет / темный цикл, с максимум семь рыб на 1 л воды.
2. Приготовьте 0,02% 3-аминобензойной кислоты этилэстер (трикаин) раствор (рН 7) в резервуарной воде для обезболить рыбу. Используйте 10 см чашки Петри или что-то подобное.
3. Подготовьте восстановительный бак, заполнив стакан 5 л 3 л чистой системной воды.
4. Подготовьте прививое обивку, чтобы держать рыбу в фиксированном положении во время вакцинации. Возьмите 5 х 7 см² кусок губки толщиной от 2 до 3 см. Вырезать паз в губку с лезвием скальпеля или острыми ножницами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один и тот же прививоющий обивка может быть использован в нескольких экспериментах. Дезинфицировать губку между экспериментами, замачивая его в 70% этилового спирта и дать высохнуть.
5. Тщательно замочите губку в системной воде и установите губку на чашку Петри.
6. Быстрый рыбы 24 ч до вакцинации.
7. Обезболить одну зебру, поместив ее на чашку Петри, содержащую 0,02% трикаина. Подождите, пока рыба не отреагирует на сенсорную стимуляцию и пока не будет движения жабры. Обезботь одну рыбу за один раз.
8. Используя пластиковую ложку, перенесите обезболивающее зебру на влажную губку и установите винтраловую сторону рыбы вниз в паз. В правильном положении убедитесь, что голова и большая часть тела рыбы находятся внутри паза и спинной плавник и хвост выступают из паза.
9. Под микроскопом, тщательно поместите иглу в примерно 45 "угол близко к спинной мышцы зебры, используя X- и y-оси тонкой настройки колес на микроманипуляторе.
10. Найти небольшое пятно без чешуи перед спинным плавником, где нажатие иглы не требует силы. Если сопротивление ощущается, попробуйте соседнее место. Избегайте травм позвоночника, спинного плавника или чешуи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла изгибается при нажатии, укоротить иглу немного, разрезав ее.
11. Используйте переключатель стопы, чтобы постепенно вводить раствор вакцины в мышцу. Наблюдайте за инъекцией через микроскоп: фенол красный виден, как он входит в мышечную ткань. При необходимости отрегулируйте продолжительность пульса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, используйте кнопку инициатора импульса на передней панели пневматического насоса для инъекции. Тем не менее, использование удаленного переключателя ног позволяет использовать другую руку для регулировки длины импульса на 10-поворотное колесо циферблата. Избегайте введения раствора слишком быстро, так как это может привести к чрезмерному повреждению тканей. Убедитесь в том, чтобы не вводить воздух.
12. Электропорат рыбы сразу после инъекции. Убедитесь, что рыба все еще находится под наркозом. Держите рыбу на губке и установите рыбу между электродами типа пинцета, так что электроды расположены по обе стороны от места инъекции. Не нажимайте на электродный пинцет слишком туго, но держите оба электрода в контакте с рыбой.
    1. Нажмите кнопку запуска на электропораторе, чтобы дать шесть импульсов 40 V, 50 мс.
    2. Аккуратно перенесите рыбу в восстановительный резервуар.
    3. Очистите электроды после каждого электропорации, проводя их с 70% этанола.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следите за благополучием рыбы после вакцинации. Усыпание любой рыбы с признаками дискомфорта (медленное восстановление после анестезии, аномальное плавание, задыхаясь) в 0,04% tricaine. После выздоровления перенесите рыбу в блок потока и накормите ее нормально.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench