Intramuskulär injektion (IM): Sammansatt leverans till en vuxen zebrafisks dorsala muskel

Overview

Denna video beskriver tekniken för intramuskulär injektion för att leverera föreningar i dorsala muskler av en vuxen zebrafisk.

Protocol

1. Injektion av DNA-vaccin och elektroporering

1. För immuniseringar enligt detta protokoll, använd friska, 6 till 12 månader gamla vuxna zebrafiskar. Håll fisken i ett genomflödessystem med en 14/10 h ljus/mörk cykel, med högst sju fiskar per 1 L vatten.
2. Förbered en 0,02% 3-aminobensoesyraetylesterlösning (trikain) (pH 7) i tankvatten för att bedöva fisken. Använd en 10 cm Petri skål eller något liknande.
3. Förbered en återvinningstank genom att fylla en 5 L bägare med 3 L rent systemvatten.
4. Förbered en vaccinationsstoppning för att hålla fisken i ett fast läge under vaccinationen. Ta en 5 x 7 cm² bit av en 2 till 3 cm tjock svamp. Skär ett spår i svampen med ett skalpellblad eller en vass sax.
   OBS: Samma vaccinationsstoppning kan användas i flera experiment. Desinficera svampen mellan experimenten genom att blötlägga den i 70% etylalkohol och låt torka.
5. Blötlägg svampen noggrant i systemvattnet och ställ svampen på en petriskål.
6. Snabb fisken 24 timmar före vaccinationerna.
7. Söv en zebrafisk genom att placera den på en petriskål som innehåller 0,02% trikain. Vänta tills fisken inte svarar på beröringsstimulering och tills det inte finns någon rörelse av gälarna. Bedöva en enda fisk i taget.
8. Använd en plastsked, överför den bedövade zebrafisken på den våta svampen och sätt fiskens ventrala sida ner i spåret. I rätt läge, se till att huvudet och det mesta av fiskens kropp är inuti spåret och dorsalfenan och svansen sticker ut från spåret.
9. Placera nålen i en cirka 45° vinkel nära zebrafiskens dorsala muskel under mikroskopet med hjälp av de x- och y-axliga finjusteringshjulen på mikromanipulatorn.
10. Hitta den lilla fläcken utan vågar framför dorsalfenan, där det inte krävs kraft att trycka nålen. Om motstånd känns, prova en intilliggande plats. Undvik att skada ryggraden, ryggfenan eller vågen.
    OBS: Om nålen böjer sig under tryck, förkorta nålen något genom att skära den.
11. Använd fotbrytaren för att gradvis injicera vaccinlösningen i muskeln. Observera injektionen genom mikroskopet: fenolrött är synligt när det kommer in i muskelvävnaden. Justera pulsens längd om det behövs.
    OBS: Alternativt kan du använda pulsinitieringsknappen på frontpanelen på den pneumatiska pumpen för injektionen. Användningen av en fjärrfotbrytare gör det dock möjligt att använda den andra handen för att justera pulslängden med ratten med 10 varv. Undvik att injicera lösningen för snabbt, eftersom detta kan orsaka överdriven vävnadsskada. Se till att inte injicera luft.
12. Elektroporera fisken omedelbart efter injektionen. Se till att fisken fortfarande är under narkos. Håll fisken på svampen och ställ fisken mellan pincettliknande elektroder, så att elektroderna ligger på varje sida av injektionsstället. Tryck inte på elektrod pincetten för hårt men håll båda elektroderna i kontakt med fisken.
    1. Tryck på startknappen på elektroporatorn för att ge sex 40 V, 50 ms pulser.
    2. Överför försiktigt fisken till återhämtningstanken.
    3. Rengör elektroderna efter varje elektroporation genom att svepa dem med 70% etanol.
       OBS: Övervaka noggrant fiskens välbefinnande efter vaccinationen. Avliva alla fiskar som visar tecken på obehag (en långsam återhämtning från anestesi, avvikande simning, flämtande) i 0,04% trikain. Efter återhämtning, överför fisken till genomflödesenheten och mata den normalt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench