Inyección intramuscular (IM): Entrega compuesta en el músculo dorsal de un pez cebra adulto

Overview

Este video describe la técnica de inyección intramuscular para entregar compuestos en los músculos dorsales de un pez cebra adulto.

Protocol

1. Inyección de la vacuna y electroporación del ADN

1. Para las inmunizaciones de acuerdo con este protocolo, utilice peces cebra adultos sanos de 6 a 12 meses de edad. Mantenga a los peces en un sistema de flujo con un ciclo claro/oscuro de 14/10 h, con un máximo de siete peces por cada 1 L de agua.
2. Preparar una solución de éster etílico de ácido etílico (tricarina) de 0,02% 3 aminobenzoicos (tricarina) en agua de tanque para anestesiar a los peces. Use una placa de Petri de 10 cm o algo similar.
3. Prepare un tanque de recuperación llenando un vaso de precipitados de 5 L con 3 L de agua limpia del sistema.
4. Prepare un relleno de vacunación para mantener el pescado en una posición fija durante la vacunación. Tome una esponja de 5 x 7 cm² de una esponja de 2 a 3 cm de espesor. Corta una ranura en la esponja con una hoja de bisturí o tijeras afiladas.
   NOTA: El mismo relleno de vacunación se puede utilizar en múltiples experimentos. Desinfectar la esponja entre los experimentos empapándola en un 70% de alcohol etílico y dejar secar.
5. Remoje bien la esponja en el agua del sistema y ajuste la esponja en una placa de Petri.
6. Ayunar el pescado 24 h antes de las vacunas.
7. Anestesiar un pez cebra colocándolo en una placa de Petri que contenga un 0,02% de tricarina. Espere hasta que el pez no responda a la estimulación táctil y hasta que no haya movimiento de las branquias. Anestesia un solo pez a la vez.
8. Con una cuchara de plástico, transfiera el pez cebra anestesiado a la esponja húmeda y coloque el lado ventral del pez en la ranura. En la posición correcta, asegúrese de que la cabeza y la mayor parte del cuerpo de los peces están dentro de la ranura y la aleta dorsal y la cola están sobresaliendo de la ranura.
9. Bajo el microscopio, coloque cuidadosamente la aguja en un ángulo de aproximadamente 45° cerca del músculo dorsal del pez cebra, utilizando las ruedas de ajuste fino de eje x e y en el micromanipulador.
10. Encuentra el pequeño lugar sin escamas frente a la aleta dorsal, donde empujar la aguja no exige fuerza. Si se siente resistencia, pruebe un punto adyacente. Evite lesionar la columna vertebral, la aleta dorsal o las escamas.
    NOTA: Si la aguja se dobla mientras empuja, acorte ligeramente la aguja cortándola.
11. Utilice el interruptor del pie para inyectar gradualmente la solución vacunal en el músculo. Observe la inyección a través del microscopio: el fenol rojo es visible a medida que entra en el tejido muscular. Ajuste la duración del pulso si es necesario.
    NOTA: Como alternativa, utilice el botón del iniciador de pulsos en el panel frontal de la bomba neumática para la inyección. Sin embargo, el uso de un interruptor de pie remoto permite utilizar la otra mano para ajustar la longitud del pulso por la rueda de marcado de 10 vueltas. Evite inyectar la solución demasiado rápido, ya que esto puede causar daños excesivos en los tejidos. Asegúrese de no inyectar aire.
12. Electroporate los peces inmediatamente después de la inyección. Asegúrese de que el pez todavía está bajo anestesia. Mantenga el pescado en la esponja y establezca el pescado entre electrodos de tipo pinza, de modo que los electrodos se encuentren a cada lado del lugar de inyección. No presione las pinzas de electrodos demasiado apretadas, pero mantenga ambos electrodos en contacto con los peces.
    1. Pulse el botón de inicio del electroporador para dar seis pulsos de 40 V y 50 ms.
    2. Transfiera suavemente el pescado al tanque de recuperación.
    3. Limpie los electrodos después de cada electroporación deslizándolos con un 70% de etanol.
       NOTA: Controle cuidadosamente el bienestar de los peces después de la vacunación. Eutanasia cualquier pez que muestre signos de incomodidad (una lenta recuperación de la anestesia, natación aberrante, jadeo) en 0,04% tricarina. Después de la recuperación, transfiera el pescado a la unidad de flujo y aliméntalo normalmente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench