Intramuskulær (IM) Injektion: Sammensat levering i dorsalmusklen hos en voksen zebrafisk

Overview

Denne video beskriver teknikken med intramuskulær injektion til at levere forbindelser i rygmusklerne hos en voksen zebrafisk.

Protocol

1. Injektion af DNA-vaccine og elektroporation

1. Til vaccinationer i henhold til denne protokol skal du bruge sunde, 6 til 12 måneder gamle voksne zebrafisk. Hold fisken i et gennemstrømningssystem med en lys/mørk cyklus på 14/10 timer med højst syv fisk pr. 1 L vand.
2. Forbered en 0,02% 3-aminobenzosyre ethylester (tricain) opløsning (pH 7) i tankvand til bedøvelse af fisken. Brug en 10 cm petriskål eller noget lignende.
3. Forbered en bjærgningstank ved at fylde et 5 L bægerglas med 3 L rent systemvand.
4. Forbered en vaccinationspolstring for at holde fisken i en fast position under vaccinationen. Tag en 5 x 7 cm² stykke af en 2 til 3 cm tyk svamp. Skær en rille i svampen med en skalpelblad eller en skarp saks.
   BEMÆRK: Den samme vaccination polstring kan bruges i flere eksperimenter. Desinficere svampen mellem forsøgene ved iblødsætning det i 70% ethylalkohol og lad det tørre.
5. Gennemblød svampen i systemvandet og sæt svampen på en petriskål.
6. Fastgør fisken 24 timer før vaccinationerne.
7. Bedøve en zebrafisk ved at placere den på en petriskål indeholdende 0,02% trikain. Vent, indtil fisken ikke reagerer på berøringsstimulering, og indtil der ikke er nogen bevægelse af gællerne. Bedøve en enkelt fisk ad gangen.
8. Brug en plastikske til at overføre den bedøvede zebrafisk på den våde svamp og sæt fiskens ventrale side ned i rillen. I den rigtige position skal du sikre dig, at hovedet og det meste af fiskens krop er inde i rillen, og rygfinnen og halen stikker ud fra rillen.
9. Under mikroskopet skal du forsigtigt placere nålen i en ca. 45° vinkel tæt på zebrafiskens dorsale muskel ved hjælp af x- og y-akse finjusteringshjulene på mikromanipulatoren.
10. Find det lille sted uden skalaer foran rygfinnen, hvor det ikke kræver kraft at skubbe nålen. Hvis modstanden mærkes, kan du prøve et tilstødende sted. Undgå at skade rygsøjlen, rygfinnen eller skalaerne.
    BEMÆRK: Hvis nålen bøjer, mens den skubber, skal du afkorte nålen lidt ved at skære den.
11. Brug fodkontakten til gradvist at injicere vaccineopløsningen i musklen. Overhold injektionen gennem mikroskopet: phenolrød er synlig, når den kommer ind i muskelvævet. Juster pulsens varighed, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Alternativt kan du bruge pulsinitiativtagerknappen på frontpanelet på den pneumatiske pumpe til injektionen. Brugen af en fjernfodskontakt gør det dog muligt at bruge den anden hånd til at justere pulslængden ved hjælp af 10-drejet opkaldshjul. Undgå at injicere opløsningen for hurtigt, da dette kan forårsage overdreven vævsskade. Sørg for ikke at injicere luft.
12. Elektroporate fisken umiddelbart efter injektionen. Sørg for, at fisken stadig er under bedøvelse. Hold fisken på svampen og sæt fisken mellem elektroder af pincettypen, så elektroderne er placeret på hver side af injektionsstedet. Tryk ikke elektrodecetterne for stramt, men hold begge elektroder i kontakt med fisken.
    1. Tryk på startknappen på elektroporatoren for at give seks 40 V, 50 ms impulser.
    2. Overfør forsigtigt fisken til bjærgningstanken.
    3. Rengør elektroderne efter hver elektroporation ved at skubbe dem med 70% ethanol.
       BEMÆRK: Overvåg forsigtigt fiskens velbefindende efter vaccinationen. Aflive enhver fisk, der viser tegn på ubehag (en langsom genopretning fra anæstesi, afvigende svømning, gispende) i 0,04% tricain. Efter genopretning overføres fisken til gennemstrømningsenheden og fodres normalt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench