הזרקה תוך שרירית (IM): משלוח מורכב לתוך השריר הגבי של דג זברה בוגר

Overview

וידאו זה מתאר את הטכניקה של הזרקה תוך שרירית להעברת תרכובות לתוך שרירי הגב של זברה מבוגר.

Protocol

1. הזרקת חיסון DNA ואלקטרופורציה

1. לחיסונים על פי פרוטוקול זה, יש להשתמש בזברה בריאה בת 6 עד 12 חודשים. שמור את הדגים במערכת זרימה דרך עם מחזור אור / כהה 14/10 שעות, עם מקסימום של שבעה דגים לכל 1 L של מים.
2. הכינו תמיסת אתיל אסתר (pH 7) של חומצה 3 אמינובנזואית (pH 7) במי מיכלים להרדמת הדגים. השתמש צלחת פטרי 10 ס"מ או משהו דומה.
3. הכן מיכל התאוששות על ידי מילוי 5 L עם 3 L של מים במערכת נקייה.
4. הכינו ריפוד חיסון כדי לשמור על הדג במצב קבוע במהלך החיסון. קח 5 x 7 ס"מ² חתיכה של ספוג 2 עד 3 ס"מ עבה. חותכים חריץ לתוך הספוג עם להב אזמל או מספריים חדים.
   שים לב: ניתן להשתמש באותו ריפוד חיסונים בניסויים מרובים. לחטא את הספוג בין הניסויים על ידי השריית אותו 70% אלכוהול אתיל ולאפשר להתייבש.
5. ביסודיות להשרות את הספוג במים המערכת ולהגדיר את הספוג על צלחת פטרי.
6. צמים את הדגים 24 שעות לפני החיסונים.
7. יש למרדים דג זברה אחד על ידי הנחתו על צלחת פטרי המכילה 0.02% טריקאין. המתן עד שהדג לא יגיב לגירוי מגע ועד שלא תהיה תנועה של הזימים. המשך להרגעת דג בודד בכל פעם.
8. באמצעות כף פלסטיק, מעבירים את דג הזברה המורדם אל הספוג הרטוב ומניחים את צד הגחון של הדג לתוך החריץ. בתנוחה הנכונה, ודא כי הראש ורוב הגוף של הדג נמצאים בתוך החריץ ואת סנפיר הגב והזנב בולטים מתוך החריץ.
9. מתחת למיקרוסקופ, הניחו בזהירות את המחט בזווית של כ-45 מעלות קרוב לשריר הגב של הזברה, תוך שימוש בגלגלי הכוונון העדין x וציר y על המיקרומניפולטור.
10. מצא את הנקודה הקטנה ללא קשקשים מול סנפיר הגב, שם דוחף את המחט אינו דורש כוח. אם ההתנגדות מורגשת, נסה נקודה סמוכה. הימנע מפגיעה בעמוד השדרה, בסנפיר הגב או קשקשים.
    שים לב: אם המחט מתכופפת תוך כדי דחיפה, לקצר את המחט מעט על ידי חיתוך אותו.
11. השתמש במתג כף הרגל כדי להזריק בהדרגה את פתרון החיסון לשריר. שימו לב להזרקה דרך המיקרוסקופ: פנול אדום נראה כשהוא נכנס לרקמת השריר. יש להתאים את משך הדופק במידת הצורך.
    שים לב: לחלופין, השתמש בלחצן יוזם הדופק בלוח הקדמי של המשאבה הפנאומטית להזרקה. עם זאת, השימוש במתג רגל מרוחקת מאפשר שימוש ביד השנייה להתאמת אורך הדופק על ידי גלגל החיוג 10-סיבוב. הימנע הזרקת הפתרון מהר מדי, שכן זה עלול לגרום נזק לרקמות מוגזמות. הקפד לא להזריק אוויר.
12. אלקטרופולאט הדג מיד לאחר ההזרקה. ודא כי הדג הוא עדיין תחת הרדמה. שמור את הדגים על הספוג והגדר את הדגים בין אלקטרודות מסוג פינצטה, כך האלקטרודות ממוקמות בכל צד של אתר ההזרקה. אין ללחוץ על פינצטה אלקטרודה חזק מדי אבל לשמור על שתי האלקטרודות במגע עם הדג.
    1. לחץ על כפתור ההתחלה על האלקטרופורטור כדי לתת שישה פולסים 40 V, 50 ms.
    2. בעדינות להעביר את הדג למיכל ההתאוששות.
    3. לנקות את האלקטרודות לאחר כל electroporation על ידי החלקת אותם עם 70% אתנול.
       שים לב: בזהירות לפקח על רווחת הדגים לאחר החיסון. המתת חסד לכל דג מראה סימנים של אי נוחות (התאוששות איטית מהרדמה, שחייה חריגה, התנשפות) ב 0.04% tricaine. לאחר ההחלמה, מעבירים את הדג ליחידת הזרימה ומאכילים אותו כרגיל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench