Intramuskulær (IM) Injeksjon: Sammensatt levering i dorsalmuskelen til en voksen sebrafisk

Overview

Denne videoen beskriver teknikken for intramuskulær injeksjon for å levere forbindelser inn i dorsale muskler i en voksen sebrafisk.

Protocol

1. Injeksjon av DNA-vaksinen og elektroporasjon

1. For immuniseringer i henhold til denne protokollen, bruk sunn, 6 til 12 måneder gammel voksen sebrafisk. Hold fisken i et gjennomstrømningssystem med en 14/10 t lys/mørk syklus, med maksimalt syv fisk per 1 liter vann.
2. Forbered en 0,02% 3-aminobenzoic acid etyl ester (tricaine) løsning (pH 7) i tankvann for bedøvelse av fisken. Bruk en 10 cm Petri-tallerken eller noe lignende.
3. Forbered en utvinningstank ved å fylle et 5 L beger med 3 L rent systemvann.
4. Forbered en vaksinasjonspolstring for å holde fisken i fast stilling under vaksinasjonen. Ta et 5 x 7 cm² stykke av en 2 til 3 cm tykk svamp. Klipp et spor inn i svampen med et skalpellblad eller skarp saks.
   MERK: Den samme vaksinasjonspolstringen kan brukes i flere eksperimenter. Desinfiser svampen mellom forsøkene ved å suge den i 70% etylalkohol og la den tørke.
5. Bløtlegg svampen grundig i systemvannet og sett svampen på en Petri-tallerken.
6. Spol fisken 24 timer før vaksinasjonene.
7. Bedøv en sebrafisk ved å plassere den på en Petri-tallerken som inneholder 0,02% trikain. Vent til fisken ikke reagerer på berøringstimulering og til det ikke er bevegelse av gjellene. Bedøv en enkelt fisk om gangen.
8. Bruk en plastskje, overfør bedøvet sebrafisk på den våte svampen og sett fiskens ventrale side ned i sporet. I riktig posisjon må du sørge for at hodet og det meste av fiskens kropp er inne i sporet og dorsalfinen og halen stikker ut fra sporet.
9. Under mikroskopet plasserer du nålen forsiktig i en omtrent 45° vinkel nær sebrafiskens dorsalmuskel, ved hjelp av x- og y-aksen finjusteringshjul på mikromanipulatoren.
10. Finn det lille stedet uten vekter foran dorsalfinen, hvor det å skyve nålen ikke krever kraft. Hvis motstanden føles, prøv et tilstøtende sted. Unngå å skade ryggraden, ryggfinnen eller skalaene.
    MERK: Hvis nålen bøyer seg mens du skyver, forkort nålen litt ved å kutte den.
11. Bruk fotbryteren til gradvis å injisere vaksineløsningen i muskelen. Vær oppmerksom på injeksjonen gjennom mikroskopet: fenolrød er synlig når den kommer inn i muskelvevet. Juster pulsens varighet om nødvendig.
    MERK: Alternativt kan du bruke pulsinitiatorknappen på frontpanelet på den pneumatiske pumpen til injeksjonen. Bruken av en ekstern fotbryter gjør det imidlertid mulig å bruke den andre hånden til å justere pulslengden med det 10-dreiede hjulet. Unngå å injisere løsningen for fort, da dette kan forårsake overdreven vevsskade. Pass på at du ikke injiserer luft.
12. Elektroporate fisken umiddelbart etter injeksjonen. Pass på at fisken fortsatt er under anestesi. Hold fisken på svampen og sett fisken mellom pinsett-type elektroder, slik at elektrodene er plassert på hver side av injeksjonsstedet. Ikke trykk elektrode pinsettene for stramt, men hold begge elektrodene i kontakt med fisken.
    1. Trykk på startknappen på elektroporatoren for å gi seks pulser på 40 V og 50 ms.
    2. Overfør fisken forsiktig til utvinningstanken.
    3. Rengjør elektrodene etter hver elektroporasjon ved å sveipe dem med 70% etanol.
       MERK: Overvåk fiskens velvære nøye etter vaksinasjonen. Euthanize noen fisk som viser tegn på ubehag (en langsom utvinning fra anestesi, avvikende svømming, gisping) i 0,04% trikain. Etter utvinning, overfør fisken til gjennomstrømningsenheten og mate den normalt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench