Overview
このビデオは、成体ゼブラフィッシュの後部筋肉に化合物を送達するための筋肉内注射の技術を説明します。.
Protocol
1. DNAワクチンの注入とエレクトロポレーション
- このプロトコルに従って予防接種のために、健康な、6〜12ヶ月齢の成類ゼブラフィッシュを使用してください。14/10時間の明暗サイクルで、水の1 Lあたり最大7匹の魚で、フロースルーシステムで魚を保ちます。
- 魚を麻酔するために、0.02%3アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン)溶液(pH7)をタンク水に調製します。10cmのペトリ皿か、似たものを使用してください。
- 5 L ビーカーに 3 L のクリーンシステム水を充填して回収タンクを準備します。
- 予防接種の間、魚を固定した位置に保つために、ワクチン接種のパディングを準備します。厚さ2~3cmのスポンジを5×7cm2個取ります。スポンジに溝をカズの刃または鋭いはさみで切る。
注: 同じワクチン接種のパディングは複数の実験で使用することができる。実験の間にスポンジを70%エチルアルコールに浸して消毒し、乾燥させます。 - 徹底的にシステム水にスポンジを浸し、ペトリ皿にスポンジを設定します。
- 予防接種の24時間前に魚を速くする。
- ゼブラフィッシュを0.02%トリカインを含むペトリ皿に置いて麻酔します。魚がタッチ刺激に反応しないまで、そしてエラの動きがなくなるまで待ちます。一度に1匹の魚を麻酔します。
- プラスチック製のスプーンを使用して、麻酔したゼブラフィッシュを濡れたスポンジに移し、魚の腹側を溝に下に置きます。正しい位置では、魚の頭と体の大部分が溝の内側にあり、背びれと尾が溝から突き出ているかどうかを確認してください。
- 顕微鏡下では、マイクロマニピュレーターのx軸とy軸の微調整ホイールを使用して、ゼブラフィッシュの後筋に近い約45°の角度で針を慎重に配置します。
- 針を押しても力を要求しない背びれの前にスケールのない小さなスポットを見つけます。抵抗が感じられる場合は、隣接するスポットを試してみてください。背骨、背びれ、または鱗を傷つけることを避けてください。
注: 押しながら針が曲がった場合は、針を切って少し短くします。 - 徐々に筋肉にワクチン溶液を注入するためにフットスイッチを使用してください。顕微鏡を通して注射を観察する:フェノールレッドは、それが筋肉組織に入ると見える。必要に応じてパルスの持続時間を調整します。
注: あるいは、空気圧ポンプのフロントパネルのパルスイニシエータボタンを使用して、注入を行います。ただし、リモートフットスイッチを使用すると、10ターンのダイヤルホイールでパルス長を調整するためにもう一方の手を使用できます。過度の組織損傷を引き起こす可能性があるため、あまりにも速く溶液を注入しないでください。空気を注入しないようにしてください。 - 注射直後に魚を電気ポポレートする。魚がまだ麻酔下にあることを確認してください。スポンジ上の魚を維持し、電極が射出部位の両側に配置されるように、トゥイザー型電極の間に魚を設定します。電極ピンセットをあまりにしっかり押し込まず、両方の電極を魚と接触させないでください。
- エレクトロポレーターの開始ボタンを押して、6つの40 V、50 msパルスを与えます。
- 魚を回収槽にそっと移します。
- 各エレクトロポレーション後に70%エタノールでスワイプして電極を洗浄します。
注: 予防接種後の魚の幸福を注意深く監視します。不快感の兆候を示す任意の魚を安楽死させる (麻酔からの遅い回復, 異常な水泳, あえぎ) で 0.04% トリカイン.回収後、魚をフロースルーユニットに移し、通常の状態で供給します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| Plastic spoon | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench |
