Iniezione intramuscolare (IM): consegna composta nel muscolo dorsale di un pesce zebra adulto

Overview

Questo video descrive la tecnica dell'iniezione intramuscolare per fornire composti nei muscoli dorsali di un pesce zebra adulto.

Protocol

1. Iniezione del vaccino contro il DNA ed elettroporazione

1. Per le vaccinazioni secondo questo protocollo, utilizzare zebrafish adulti sani di età da 6 a 12 mesi. Conservare il pesce in un sistema flow-through con un ciclo chiaro/scuro di 14/10 h, con un massimo di sette pesci per 1 L di acqua.
2. Preparare una soluzione di 0,02% di acido 3-amminobenzoico estere etilico (tricaina) (pH 7) in acqua del serbatoio per anestetizzare il pesce. Usa una piastra di Petri di 10 cm o qualcosa di simile.
3. Preparare un serbatoio di recupero riempiendo un becher da 5 litri con 3 L di acqua pulita del sistema.
4. Preparare un'imbottitura vaccinale per mantenere il pesce in posizione fissa durante la vaccinazione. Prendi un pezzo da 5 x 7 cm² di una spugna spessa da 2 a 3 cm. Tagliare una scanalatura nella spugna con una lama bisturi o forbici affilate.
   NOTA: La stessa imbottitura vaccinale può essere utilizzata in più esperimenti. Disinfettare la spugna tra gli esperimenti immergendola nel 70% di alcol etilico e lasciare asciugare.
5. Immergere accuratamente la spugna nell'acqua del sistema e impostare la spugna su una piastra di Petri.
6. Digiunare il pesce 24 ore prima delle vaccinazioni.
7. Anestetizzare un pesce zebra posizionandolo su una piastra di Petri contenente lo 0,02% di tricaina. Attendere che il pesce non risponda alla stimolazione del tatto e fino a quando non ci sarà movimento delle branchie. Anestetizza un singolo pesce alla volta.
8. Utilizzando un cucchiaio di plastica, trasferire il pesce zebra anestetizzato sulla spugna bagnata e impostare il lato ventrale del pesce verso il basso nel solco. Nella posizione corretta, assicurarsi che la testa e la maggior parte del corpo del pesce siano all'interno della scanalatura e la pinna dorsale e la coda sporgono dalla scanalatura.
9. Al microscopio, posizionare con cura l'ago in un angolo di circa 45° vicino al muscolo dorsale del pesce zebra, utilizzando le ruote di messa a punto dell'asse x e y sul micromanipolatore.
10. Trova il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale, dove spingere l'ago non richiede forza. Se si sente resistenza, provare un punto adiacente. Evitare di ferire la colonna vertebrale, la pinna dorsale o le squame.
    NOTA: Se l'ago si piega mentre spinge, accorcia leggermente l'ago tagliandolo.
11. Utilizzare l'interruttore del piede per iniettare gradualmente la soluzione vaccinale nel muscolo. Osserva l'iniezione attraverso il microscopio: il rosso fenolo è visibile mentre entra nel tessuto muscolare. Regolare la durata dell'impulso, se necessario.
    NOTA: In alternativa, utilizzare il pulsante dell'iniziatore a impulsi sul pannello frontale della pompa pneumatica per l'iniezione. Tuttavia, l'uso di un interruttore a pedale remoto consente di utilizzare l'altra mano per regolare la lunghezza dell'impulso dalla ruota del quadrante a 10 giri. Evitare di iniettare la soluzione troppo velocemente, poiché ciò può causare danni eccessivi ai tessuti. Assicurarsi di non iniettare aria.
12. Elettroporare il pesce subito dopo l'iniezione. Assicurarsi che il pesce sia ancora in anestesia. Tenere il pesce sulla spugna e impostare il pesce tra elettrodi di tipo tweezer, in modo che gli elettrodi si trovino su ciascun lato del sito di iniezione. Non premere troppo strette le pinzette degli elettrodi, ma tenere entrambi gli elettrodi a contatto con il pesce.
    1. Premere il pulsante di avvio sull'elettroporatore per dare sei impulsi da 40 V e 50 ms.
    2. Trasferire delicatamente il pesce nel serbatoio di recupero.
    3. Pulire gli elettrodi dopo ogni elettroporazione scorrendoli con il 70% di etanolo.
       NOTA: Monitorare attentamente il benessere del pesce dopo la vaccinazione. Eutanasia di qualsiasi pesce che mostri segni di disagio (un lento recupero dall'anestesia, nuoto aberrante, ansimante) nello 0,04% di tricaina. Dopo il recupero, trasferire il pesce nell'unità di flusso e alimentarlo normalmente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench