Iniezione intramuscolare (IM): consegna composta nel muscolo dorsale di un pesce zebra adulto

- Trasferire un pesce anestetizzato tricaina su una spugna bagnata con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Posizionare la spugna che trasporta il pesce al microscopio. Posizionare un ago di microiniezione con un angolo di 45 gradi dall'asse del corpo vicino al muscolo dorsale.

Successivamente, individuare il punto di fronte alla pinna dorsale che non è coperto da squame in cui è possibile inserire l'ago senza applicare una grande forza. Quindi inserire delicatamente l'ago e iniettare lentamente il composto di interesse insieme a un marcatore come il rosso fenolo nel muscolo.

Se il composto di interesse contiene materiale genetico, elettroporare le cellule posizionando elettrodi su entrambi i lati del sito di iniezione e somministrando la corrente. La corrente rende le cellule muscolari permeabili e in grado di assumere in modo efficiente il materiale genetico. Dopo la procedura, trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio di recupero. Nel seguente protocollo eseguiremo un'iniezione intramuscolare su un pesce zebra adulto per fornire un vaccino contro la micobatteriosi.

Per mantenere il pesce in una posizione fissa durante l'iniezione, utilizzare un pezzo di spugna con una scanalatura tagliata al centro come imbottitura. Immergere accuratamente la spugna nell'acqua del sistema e impostarla in una piastra di Petri. Utilizzando un cucchiaio di plastica, trasferire un pesce zebra anestetizzato nella spugna bagnata con il lato ventrale del pesce giù nel solco. Al microscopio, posizionare l'ago con un angolo di 45 gradi vicino al muscolo dorsale del pesce zebra. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo muscolo. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo muscolo. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo muscolare. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo muscolo muscolo. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo muscolo muscolo. Quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo muscolo.

Se si sente una resistenza, provare un punto adiacente. Utilizzare un interruttore del piede per iniettare gradualmente la soluzione plasmide nel muscolo. Al microscopio, il rosso fenolo dovrebbe essere visibile quando entra nel tessuto muscolare.

Elettroporate il pesce subito dopo l'iniezione posizionando gli elettrodi di tipo tweezer su ciascun lato del sito di iniezione. Premere il pulsante Start sull'elettroporatore e assegnargli sei impulsi da 40 volt e 50 millisecondi. Quindi trasferire delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero. Infine, dopo aver anestetizzato il pesce secondo il protocollo di testo, utilizzare una luce UV per vedere l'espressione EGFP vicino al sito di iniezione.