Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Overfør en tricaine anæstesiiseret fisk på en våd svamp med den dorsale side vendt op. Placer svampen transporterer fisken under et mikroskop. Placer en mikro-injektion nål i en 45 graders vinkel fra kroppen aksen nær dorsal muskel.
Find derefter stedet foran rygfinnen, der ikke er dækket af skalaer, hvor du kan indsætte nålen uden at anvende stor kraft. Indsæt derefter forsigtigt nålen og injicerer langsomt forbindelsen af interesse sammen med en markør som phenolrød ind i musklen.
Hvis interessetilstjeningen indeholder genetisk materiale, elektroporate cellerne ved at placere elektroder på hver side af injektionsstedet og administrere strømmen. Strømmen gør muskelcellerne gennemtrængelige og i stand til effektivt at optage det genetiske materiale. Efter proceduren overføres fisken straks til en genopretningstank. I den følgende protokol udfører vi en intramuskulær injektion på en voksen zebrafisk for at levere en DNA-vaccine mod mycobakteriose.
For at holde fisken i en fast position under injektionen skal du bruge et stykke svamp med et rilleskåret i midten som polstring. Blød svampen grundigt i systemvand og sæt den i en petriskål. Ved hjælp af en plastikske skal du overføre en bedøvet zebrafisk til den våde svamp med fiskens ventrale side ned i rillen. Under mikroskopet skal du placere nålen i en 45 graders vinkel tæt på zebrafiskens rygmuskel.
Hvis der mærkes modstand, kan du prøve et tilstødende sted. Brug en fodkontakt til gradvist at injicere plasmidopløsningen i musklen. Under mikroskopet skal phenolrøden være synlig, når den kommer ind i muskelvævet.
Elektroporate fisken umiddelbart efter injektionen ved at placere pincet type elektroder på hver side af injektionsstedet. Tryk på startknappen på elektroporatoren og give det seks 40 volt, 50 millisekund pulser. Derefter forsigtigt overføre fisken til en nyttiggørelse tank. Endelig, efter bedøvelse af fisk i henhold til tekstprotokollen, skal du bruge et UV-lys for at se EGFP udtryk nær injektionsstedet.
