Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Overfør en trikain bedøvet fisk på en våt svamp med dorsalsiden vendt opp. Plasser svampen som bærer fisken under et mikroskop. Plasser en mikroinjeksjonsnål i en 45 graders vinkel fra kroppsaksen nær dorsalmuskelen.
Deretter finner du stedet foran ryggfinnen som ikke er dekket med vekter der du kan sette inn nålen uten å bruke stor kraft. Sett deretter forsiktig inn nålen og injiser sakte forbindelsen av interesse sammen med en markør som fenolrød i muskelen.
Hvis forbindelsen av interesse inneholder genetisk materiale, elektroporate cellene ved å plassere elektroder på hver side av injeksjonsstedet og administrere strømmen. Strømmen gjør muskelcellene gjennomtrengelige og i stand til effektivt å ta opp det genetiske materialet. Etter prosedyren, umiddelbart overføre fisken til en utvinningstank. I følgende protokoll vil vi utføre en intramuskulær injeksjon på en voksen sebrafisk for å levere en DNA-vaksine mot mykobakteriose.
For å holde fisken i fast stilling under injeksjon, bruk et stykke svamp med et spor kuttet i midten som polstring. Bløtlegg svampen grundig i systemvann og sett den i en Petri-tallerken. Bruk en plastskje, overfør en bedøvet sebrafisk til den våte svampen med fiskens ventrale side ned i sporet. Under mikroskopet plasserer du nålen i en 45 graders vinkel nær sebrafiskens dorsale muskel.
Hvis det merkes motstand, prøv et tilstøtende sted. Bruk en fotbryter for gradvis å injisere plasmidoppløsningen i muskelen. Under mikroskopet skal fenolrøden være synlig når den kommer inn i muskelvevet.
Elektroporate fisken umiddelbart etter injeksjon ved å plassere pinsett type elektroder på hver side av injeksjonsstedet. Trykk på Start-knappen på elektroporatoren og gi den seks 40 volt, 50 millisekunder pulser. Deretter overfører du fisken forsiktig til en utvinningstank. Til slutt, etter bedøvelse av fisken i henhold til tekstprotokollen, bruk et UV-lys for å se EGFP-uttrykk nær injeksjonsstedet.
