Overview
Bu video, yetişkin bir zebra balığının sırt kaslarına bileşikler sunmak için kas içi enjeksiyon tekniğini açıklar.
Protocol
1. DNA Aşısı ve Elektroporasyon Enjeksiyonu
- Bu protokole göre bağışıklamalar için sağlıklı, 6 ila 12 aylık yetişkin zebra balığı kullanın. Balıkları 14/10 saat açık/karanlık döngülü, 1 L su başına en fazla yedi balık içeren bir akış sisteminde tutun.
- Balıkları uyuşturulması için tank suyunda %0,02 3 aminobenzoik asit etil ester (trikain) çözeltisi (pH 7) hazırlayın. 10 cm Petri kabı veya benzeri bir şey kullanın.
- 5 L'lik bir beheri 3 L temiz sistem suyu ile doldurarak bir geri kazanım tankı hazırlayın.
- Aşılama sırasında balıkları sabit bir konumda tutmak için bir aşı dolgusunda hazırlayın. 2 ila 3 cm kalınlığında bir süngerin5 x 7 cm 2 parçasını alın. Neşter bıçağı veya keskin makasla süngere bir oluk kesin.
NOT: Aynı aşılama dolgu birden fazla deneyde kullanılabilir. Süngeri %70 etil alkole batırarak deneyler arasında dezenfekte edin ve kurumasını bekleyin. - Süngeri sistem suyuna iyice batırın ve süngeri bir Petri kabına yerleştirin.
- Aşılardan önce balıkları 24 saat oruç tut.
- Bir zebra balığını% 0.02 trikain içeren bir Petri kabına yerleştirerek uyuştur. Balık dokunma stimülasyonuna yanıt verene kadar ve solungaçların hareketi olmayana kadar bekleyin. Bir seferde tek bir balığı uyuştur.
- Plastik bir kaşık kullanarak, uyuşturulmuş zebra balığını ıslak süngere aktarın ve balığın ventral tarafını oluğa ayarlayın. Doğru pozisyonda, balığın başının ve vücudunun çoğunun oluğun içinde olduğundan ve sırt yüzgecinin ve kuyruğun oluktan çıkıntı yaptığından emin olun.
- Mikroskop altında, iğneyi mikromanipülatördeki x ve y ekseni ince ayar tekerleklerini kullanarak zebra balığının sırt kasına yakın yaklaşık 45 ° açıya dikkatlice yerleştirin.
- İğneyi itmenin kuvvet gerektirmediği sırt yüzgecinin önünde pulsuz küçük noktayı bulun. Direnç hissediliyorsa, bitişik bir nokta deneyin. Omurgayı, sırt yüzgecini veya teraziyi yaralamaktan kaçının.
NOT: İğne iterken bükülürse, iğneyi keserek hafifçe kısaltın. - Aşı çözeltisini yavaş yavaş kas içine enjekte etmek için ayak anahtarını kullanın. Enjeksiyonu mikroskoptan gözlemleyin: fenol kırmızısı kas dokusuna girerken görülebilir. Gerekirse darbenin süresini ayarlayın.
NOT: Alternatif olarak, enjeksiyon için pnömatik pompanın ön panelinde darbe başlatıcı düğmesini kullanın. Bununla birlikte, uzak bir ayak anahtarının kullanılması, darbe uzunluğunu 10 dönüşlü tuş tekerleğiyle ayarlamak için diğer elin kullanılmasına izin verir. Çözeltiyi çok hızlı enjekte etmekten kaçının, çünkü bu aşırı doku hasarına neden olabilir. Hava enjekte etmeyin. - Enjeksiyondan hemen sonra balığı elektroporat. Balığın hala anestezi altında olduğundan emin olun. Balıkları süngerin üzerinde tutun ve balıkları cımbız tipi elektrotlar arasında ayarlayın, böylece elektrotlar enjeksiyon bölgesinin her iki tarafında bulunur. Elektrot cımbızlarını çok sıkı bastırmayın, ancak her iki elektrotu da balıkla temas halinde tutun.
- Altı adet 40 V, 50 ms darbe vermek için elektroporatördeki başlat düğmesine basın.
- Balıkları yavaşça kurtarma tankına aktarın.
- Elektrotları her elektroporasyondan sonra % 70 etanol ile kaydırarak temizleyin.
NOT: Aşılamadan sonra balığın refahını dikkatlice izleyin. %0.04 trikainde rahatsızlık belirtileri gösteren herhangi bir balığı (anesteziden yavaş iyileşme, anormal yüzme, nefes darlığında) ötenazi edin. İyileştikten sonra, balığı akış ünitesine aktarın ve normal şekilde besleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| Plastic spoon | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench |
