Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Summary

Abstract

Metagenomica frammenti di archiviare librerie di grandi dimensioni contigue sequenze genomiche da microrganismi senza la necessità di coltivazione precedente. Generazione di una procedura semplificata per la creazione e lo screening librerie metagenomiche è quindi utile per una efficiente high-throughput indagini sulle proprietà genetiche e metaboliche di assemblaggi microbica incolti. Qui, i protocolli chiave sono presentati in video, che vi proponiamo è il formato più utile per descrivere con precisione un lungo processo che dipende alternativamente sulla strumentazione robotica e (umano) interventi manuali. In primo luogo, abbiamo impiegato robotica di individuare cloni biblioteca su membrane ad alta densità macroarray, ognuno dei quali può contenere colonie duplicati da ventiquattro tavole biblioteca da 384 pozzetti. L'automazione è fondamentale per questa procedura non solo per precisione e velocità, ma anche per la miniaturizzazione di scala necessarie per montare il gran numero di cloni biblioteca accordi spaziali ad alta densità. Una volta generato, siamo prossimi dimostrato come le membrane macroarray possono essere sottoposti a screening per geni di interesse utilizzando versioni modificate di protocolli standard per l'etichettatura della sonda, l'ibridazione della membrana, e la rilevazione del segnale. Abbiamo completato la dimostrazione visiva di queste procedure, con dettagliate descrizioni scritte delle fasi coinvolte ed i materiali necessari, che sono tutti disponibili online a fianco del video.

Protocol

1. Ibridazione procedura

Un tubo di ibridazione sono necessari 1 o 2 membrane (taglia 22 per 22 cm). Utilizzare 50 ml di miscela di ibridazione e 0,5 mg di DNA sonda (10 ng / ml concentrazione finale) per tubo ibridazione. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare gel purificato DNA come sonda. Se scaling up preparazione della sonda, aumentare il numero di tubi, piuttosto che aumentando la quantità di reagenti per provetta.

Sonda preparazione (0,5 mg DNA):

1. Diluire 15 ml di cross-linker soluzione con 60 ml di acqua.
2. Diluire il DNA a 10 ng / mL con acqua a 50 microlitri di volume totale in un tappo a vite microprovette.
3. DNA denaturare per 5 minuti in acqua bollente.
4. Trasferire rapidamente al ghiaccio e lasciate raffreddare per 5 min. Spin brevemente.
5. Aggiungere 50 ml di tampone di reazione e mescolare delicatamente.
6. Aggiungere 10 ml di etichettatura dei reagenti e mescolare delicatamente.
7. Aggiungere 50 microlitri della diluito cross-linker soluzione dal punto 1 e mescolare delicatamente. Vortex delicatamente e centrifugare brevemente.
8. Incubare a 37 ° C per 30 min.
9. Tenere sul ghiaccio per un massimo di 2 ore o aggiungere un uguale volume di 100% glicerolo e conservare a -20 ° C.
   
   Nota: utilizzare l'acqua fornita con il kit. Conservare tutti i reagenti su ghiaccio salvo diversa indicazione.

Preparazione della membrana e l'ibridazione

1. Preriscaldare 50 ml di tampone di ibridazione e tubo di ibridazione a 60 ° C.
2. Aggiungere la soluzione tampone di ibridazione al tubo di ibridazione. Arrotolare membrana (s) e aggiungere al tubo ibridazione. (Se l'aggiunta di 2 membrane per ogni tubo, primo tiro alto di una membrana completamente, poi arrotolare la membrana sopra l'altra nella stessa direzione.)
3. Incubare la provetta in ibridazione a 60 ° C per almeno ½ h. (Assicurarsi membrana (s) ottiene bagnato accuratamente.)
4. Trasferire circa 1 ml di tampone di ibridazione con una pipetta lunga dal tubo di ibridazione per il tubo contenente la sonda marcata. Vortex delicatamente e centrifugare brevemente. Trasferimento miscela di nuovo al tubo di ibridazione.
5. Incubare a 60 ° C durante la notte.
   
   Nota: Utilizzare pinze e guanti quando si maneggiano le membrane. Contenuto mix di tubi di ibridazione con delicatezza perché l'agitazione eccessiva provoca la formazione permanente di schiuma indesiderati. Membrane dovrebbero essere aggiunti in caso di pioggia; immergere in tampone di ibridazione o di acqua se necessario e scaricare il liquido in eccesso prima di aggiungere.

2. Procedura di rilevamento

Membrane lavaggio

1. Preriscaldare il tampone di lavaggio primario a 60 ° C. (Usa forno a microonde e / o la piastra di riscaldamento).
2. Se ci sono 2 membrane in una provetta di ibridazione, il trasferimento di una membrana di un ambiente pulito, caldo, tubo di ibridazione vuoto.
3. Brevemente risciacquare tubo ibridazione con circa 50 ml di tampone di lavaggio primario.
4. Aggiungere circa 100 ml di tampone di lavaggio per tubo primario ibridazione e incubare a 60 ° C per 10 min.
5. Ripetere il punto 3 e 4.
6. Trasferimento membrana per il lavaggio del contenitore e incubare con almeno 250 ml di tampone di lavaggio secondario a temperatura ambiente per 5 min.
7. Ripetere il passaggio 6.
   
   Nota: Le membrane possono essere conservati nel tampone di lavaggio secondario a temperatura ambiente per un massimo di ½ h prima della generazione del segnale.

Generazione del segnale e la rilevazione (procedura per una membrana)

1. Due pezzi di nastro SaranWrap piatto sul tavolo (una per la fase 2 e uno per il punto 4).
2. Cura di scarico il tampone in eccesso dalla membrana toccando gli angoli della membrana contro il lato del contenitore e trasferire la membrana sul SaranWrap (lato di campionamento fino).
3. Versare 6-7 ml di reagente ECF oltre a membrana e piega avvolgere Saran su membrana. Cura la distribuzione del reagente ECF oltre membrana con delicatezza lo spostamento di un Kimwipe il SaranWrap. Incubare per 5 min.
4. Defluire reagente in eccesso ECF dalla membrana e trasferirlo sul nuovo SaranWrap, avvolgere volte rispetto a membrana, e sigillare i bordi con del nastro adesivo. Coprire la membrana con un foglio di alluminio. Incubare per 1-2 ore.
5. Preparare la lastra di vetro dello scanner, distribuendo 1-2 ml di reagente ECF sopra la lastra di vetro. Poi trasferire la membrana sulla lastra di vetro (lato campione verso il basso) e distribuire un altro 1-2 ml di reagente ECF sulla membrana. Sovrapposizione con SaranWrap e spingere le bolle d'aria lontano dalla membrana. (Si può mettere una piastra rigida sulla parte superiore della membrana SaranWrap tenere premuto contro la lastra di vetro.)
6. Utilizzare il Fuji FLA-5100 scanner a fluorescenza ("1 laser 1 immagine" mode) con le seguenti impostazioni: eccitazione 473 nm, filtro di rilevamento LPB (510 nm), la risoluzione 50 micron, laurea segnale a 16-bit, CH1 400 V. (Scan dura circa 15-20 minuti per membrana di taglia 22 per 22 cm.)
   
   Opzionale:
   
   
7. Lasciate riposare per 2-4 ore (o più).
8. Ripetere la scansione del passaggio 6.

3. Smontaggio e stoccaggio procedura (NUF versione)

1. Trasferimento della membrana al 100% ethanol e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti con agitazione.
2. Sostituire con fresca etanolo al 100% e incubare una notte a temperatura ambiente. (Membrana può rimanere in etanolo per diversi giorni.)
3. Sostituire l'etanolo con acqua distillata e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
4. Aggiungere 100 ml di acqua e 5 ml di 10% SDS (finale 0,5% SDS) a un tubo di ibridazione e mescolare delicatamente. Aggiungi membrana.
5. Incubare a 80 ° C per 1 h.
6. Trasferimento a membrana su un contenitore pulito e vuoto.
7. Aggiungere 500 ml di acqua e 5 ml di 10% SDS (finale 0,1% SDS) e un bicchiere di calore a bollore vigoroso nel forno a microonde.
8. Versare la quasi bollente soluzione 0,1% SDS sopra la membrana e agitare delicatamente per alcuni minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
9. Sciacquare in almeno 250 ml di soluzione sterile 100 mM Tris pH 8 per almeno 10 min.
10. Membrana avvolgere in SaranWrap e chiudere i bordi accuratamente con nastri. Conservare a 4 ° C. (Membrane non deve mai asciugarsi.)

Discussion

La procedura di stripping non è stato ottimizzato. Tuttavia, la procedura di stripping dato nelle istruzioni del produttore (2 lavaggi ciascuno, 10 minuti in 100% di etanolo, 1 lavaggio di 1 ora a 60 ° C a 0,5% SDS) è insufficiente. Almeno notte di incubazione in etanolo al 100% è necessario per sciogliere il prodotto di reazione ECF; diversi giorni di incubazione in 100% di etanolo non sembra avere effetti negativi sulla capacità di reprobe la membrana. Trattamento SDS del produttore sembra essere insufficiente. NUF ha provato 1 ora a 80 ° C con 0,5% SDS seguito da un trattamento con quasi bollente 0,1% SDS con successo. Tracy ha dimostrato che una volta versando-over con quasi bollente 0,1% SDS è sufficiente.

Suggerimenti utili:
Il buffer di ibridazione, tubo di ibridazione, e tampone di lavaggio principale deve essere preriscaldato a 60 ° C prima dell'uso, e deve essere mantenuto a tale temperatura per tutto l'esperimento. Per esempio, tenere il buffer su un piatto di riscaldamento con un termometro immerso; su una piastra di riscaldamento Corning, un ambiente di circa 3 risultati a 60 ° C.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685