Метод грызунов Всего культуры эмбрионов использованием Rotator типа бутылки культуры система
Summary
Всего техника культуре эмбрионов позволяет мыши культуры и крысиных эмбрионов<em> Исключая виво</em> Состоянии в течение ограниченного периода соответствующее середине беременности этапов. В этом видео-протокол, мы демонстрируем наши стандартные процедуры крысы целая культура эмбриона после E12.5 использовании поворотного устройства типа бутылки системе культуры.
Abstract
Всего культивирования эмбрионов (ВЭС) методика была разработана в 1950 году по количеству новых и его коллегами, и применяется для биологии развития 1. Хотя развитие и рост эмбрионов млекопитающих критически зависят от функции плаценты, ВЭС техника позволяет мыши культуры и крысиных эмбрионов бывших естественных условиях в течение ограниченного периода соответствующее середине беременности этапах эмбрионального день (E) 6,5-E12.5 в мышь или E8.5-E14.5 у крыс 2, 3, 4. В ВЭС, мы можем непосредственно целевой требуемых областях эмбрионов с использованием тонких стеклянных капилляров, поскольку эмбрионы можно управлять под микроскопом. Таким образом, грызунов ВЭС очень полезный метод, когда мы хотим для изучения динамических процессов развития в postimplanted эмбрионов млекопитающих. На сегодняшний день, несколько видов ВЭС системы были разработаны 1. Среди тех, поворотное устройство типа бутылки культуре системы наиболее популярны и подходят для долгосрочных культуры эмбрионов в середине беременности, т. е. после E9.5 и E11.5 у мышей и крыс, соответственно 1. В этом видео-протокол, мы демонстрируем наши стандартные процедуры крысы ВЭС после E12.5 использованием изысканные модели оригинального поворотного устройства системы, который был разработан новый и 5 Кокрофт, 6, и внедрить различные приложения ВЭС технику для исследований в развитии млекопитающих биологии.
Protocol
Discussion
Есть два важных шагов в грызун ВЭС для успеха. Во-первых, процедура вскрытия должна быть точной, чтобы не повредить эмбрионов, особенно кровеносные сосуды. Во-вторых, процедура должна быть как можно быстрее, потому что кислород и питательные больше не поставляется через плаценту после в…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-н Хадзимэ Ichijo для видео-записи и полезные советы для редактирования видео. Мы также благодарим Drs.Yuji Tsunekawa и кайчи Yoshizaki за добрые помощник для видео-записи. Эта работа проводится при поддержке KAKENHI на молодых ученых и B в приоритетных областях,-молекулярной наук о мозге от MEXT Японии. Мы признаем, поддержке Глобального COE Программа «Базовые и трансляционных исследований Центра глобального науке мозга" от MEXT Японии и основной исследовательской эволюционной науки и техники (CREST) от японской науки и техники от японской корпорации науки и техники агентство (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).
- Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
