Summary
전체 배아 문화 기술 문화 마우스 및 쥐 배아 우리에게 수
Abstract
전체 배아 문화 (WEC) 기술은 신규 및 그의 동료에 의해 1950 년대에 개발하고, 발달 생물학 1 적용되었습니다. 포유 동물 배아의 발전과 성장은 태반의 기능에 매우 의존하고 있지만, WEC 기술은 우리의 배아 일 (E) 6.5 - E12.5 동안 midgestation 단계에 해당하는 제한된 기간 동안 문화 마우스 및 쥐 배아 전 생체내 조건 수 마우스 또는 쥐 2, 3, 4 E8.5 - E14.5. 배아는 현미경으로 조절할 수 있기 때문에 WEC에서, 우리는 직접적으로 고급 유리 모세관을 사용하여 태아의 영역을 원하는 타겟팅할 수 있습니다. 우리가 postimplanted 포유류의 배아 발달의 동적 과정을 공부하고 싶을 때 따라서, 쥐 WEC는 매우 유용한 기술입니다. 최신, WEC 시스템을 여러 종류의는 1을 개발하고 있습니다. 그 중에서도 회전 형 병 문화 시스템은 각각 1 마우스 및 쥐에 E9.5와 E11.5, 후 가장 인기있는 midgestation 즉,에서 배아의 장기적인 문화에 적합합니다. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 새로 콕크 로프트 5, 6에 의해 설계되었지만 원래 회전 시스템의 세련된 모델을 사용 E12.5 후 쥐 WEC의 표준 절차를 입증하고, 포유류의 발달에 연구 WEC 기술의 다양한 응용 프로그램을 소개합니다 생물학.
Protocol
1. WEC 시스템을 설정
- 공동 WEC 시스템 내에서 유입 실리콘 튜브 필터 0.22 μm의 막).
- O 2 (95 %)과 CO 2 (5 %)이있는 가스 실린더의 밸브를 엽니다. autoclaved 물이 들어있는 버블링 병을 통해 드럼에 가스 혼합물을 흐름.
- 50 CC로 가스 혼합물의 흐름 볼륨을 조정합니다.
- 밖은 물통에 실리콘 튜브를하자 및 가스 혼합물의 흐름을 체크 아웃 넣습니다.
- 20 RPM / 분 속도로 드럼을 회전합니다.
2. 문화 매체의 준비
- 37.0에서 해동 랫 즉시 - centrifuged (IC) 혈청 ° C B). autoclaved 100 ML의 비커에 해동 혈청에 추가 D를 포도당 (2 MG / ML). 문화 매체는 기본 문화 수준 (예, 후드를 사용)에서 준비되어야합니다.
- 400 희석 : 1 혈청에 항생제 - antimycotic (100X) 액체를 추가합니다.
- 남은 isoflurane을 날려 버리기 (때문에 혈액을 수집하는 동안 쥐를 마취)를 실온 (RT) C)에서 20 분 동안 혈청에서.
- 0.45 μm의 막 필터를 사용하여 배지를 소독.
- 각각의 문화 병의 매체의 3.0 ML를 부어 및 (심판을 참조하십시오. 14) D) 알루미늄 호일로 덮인 실리콘 플러그 각 병의 상단을 밀봉.
- ) Tyrode의 생리 전자를 포함한 서너 처리 배양 접시를 준비합니다.
3. 자궁의 쥐, 고립의 마취
- inhalational 또는 비경 anesthetics와 깊이 초과 - 임신 쥐 마취.
- 70 % 에탄올로 anesthetized 임신 쥐의 복부 지역을 청소하십시오.
- 포셉로 피부를 들고) 대형 가위 F로 피부를 절단하여 복벽을 외면 화하다.
- 포셉 한 쌍의로 복벽을 들고) 흉부 수준 g으로 큰 가위로 복부 벽에 U 자형의 큰 길이 incisions을합니다.
- 포셉 한 쌍의으로 왼쪽에 소장 멀리 베어와 난소에 연결된 자궁의 한쪽 끝을 노출.
- 포셉 한 쌍의와 자궁의 끝을 들고 큰 가위로 자궁과 난소의 위치를 잘라.
- 자궁의 다른 쪽 끝을 때까지 자궁 주위의 지방을 절단하여 임신 쥐의 자궁을 가져가라.
- Tyrode의 생리를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 전송합니다.
- 자궁을 제거 후 anesthetics의 과도한 행정이나 자궁 전위로 쥐를 안락사.
4. 자궁에서 태아의 제거
- 간단히 Tyrode의 호수에있는 자궁을 씻어) 고급 포셉 H 한 쌍의 두 번째 페트리 접시로 전송할 수 있습니다.
- 쌍안경 현미경, 괜찮아요 포셉 한 쌍의과 자궁 벽을 선택하고 안과 바로 가위를 사용하여 혈관과 연결 mesometrium에 사이드 맞은편에 이번에는 질 벽에 상처를 냈어.
- 이번에는 질 벽에와 decidua 사이의 공간으로 안과 직선 가위 끝에 삽입합니다. 길이 방향 antimesometrial 측면을 따라 자궁 벽을 잘라.
- mesometrial 측면에서 decidua 훌륭한 포셉 I)의 두 쌍을 사용하여 자궁에서 분리 conceptuses 클럼프.
- 적당한 직경 소독 유리 피펫과 함께 세 번째 페트리 접시에 conceptuses을 전송.
5. 쥐 배아의 해부
- decidua에 microforceps 중 하나 팁을 삽입하고 포셉의 두 쌍이있는 conceptus 주변 decidua에 가로 절개를합니다.
- placental 측면에서 decidua에 포셉의 도움말을 삽입하고 가기 decidua에 두 개의 세로 incisions합니다.
- 그 포셉 두 쌍이있는 밖으로 추출하여 placental 측면에서 decidua를 제거합니다. 포셉 두 쌍이있는 나머지 decidua를 제거합니다.
- , 레이처트의 막을 들고 그것에 수평 절개를하고, 안티 placental 측면에서 conceptus에서 멤브레인를 구분한다.
- 포셉의 두 쌍이있는 배아의 머리 근처의 난황에 작은 구멍을 확인하고, 안과 곡선 가위로 난황를 잘라. 주요 혈관을 손상하지 않는 것이 중요합니다.
- 좋은 포셉의 두 쌍이있는 배아의 머리 주위의 사이트에서 양막을 선택하고, 부드럽게) 양막 H를 찢어하여 난황에서 배아를 빼낸다. 배아의 본문은 midgestation 단계에서 배아에 대한 산소의 공급을 높일 수있는 난황을 꺼내해야합니다.
6. 전체 배아 문화
- 태반, 난황, 그리고 심장 박동과 혈액 순환의 상태에 대한 손해를 확인하십시오.
- 탯줄을 스트레칭하지 알고있는, 이전멸균 유리 피펫있는 문화 병으로 배아. 문화 병에 Tyrode의 생리 이상의 캐리는 최대한 조금해야합니다.
- 회전 드럼에서 비 구멍 실리콘 플러그를 제거합니다. 수직 WEC 시스템의 회전 드럼에 구멍이있는 플러그 문화 병에 연결합니다. 회전 드럼은 아주 좋은 장비이기 때문에 적합하지 방향으로 드럼에 힘을 넣어하지 않도록주의하십시오. 해부 배아를 포함하는 병은 하나의 문화 하나에 전송되며, 보육 정문의 개방)는 j를 감소하는 인큐베이터의 온도를 피하기 위해 최소화되어야합니다.
- 문화의 10 시간 후, (표 1) 24 시간 후 75 CC 최대 100 CC로 가스 혼합물의 흐름 볼륨을 높일 수 있습니다.
- 문화 매체는 신선한 매체와 새로운 문화 병으로 교양 배아를 전송하여 24 시간 주변에 변경해야합니다. 34 시간 후에 125 CC로 흐름 볼륨을 증가 및 48 시간 후에 150 CC (표 1)
- 때로는 심장 박동 속도 (즉, 120-150/min 최적)을 계산하여하고 혈액 순환을 관찰하여 교양 태아의 상태를 확인합니다. 필요한 경우 Tyrode의 호수에있는 태아의 성장을 판단 somites의 개수를 계산합니다. 일반적인 개발, 하나 체절 2 시간에 추가됩니다.
- WEC가 완료되면, 가스 혼합물의 공급을 중단하고 유입 관과 버블링 병의 입구 관으로 흐름을 돌려 방지 필터 멤브레인 연결을 끊습니다.
7. 노트
- WEC 시스템 내부 온도는 지속적으로 37.0-37.5 ° C.에 보관
- 백퍼센트 쥐 IC 혈청은 일상적으로 쥐, 마우스 배아 저희 WEC에서 사용하고, 사용하기 전에 -20 ° C에 보관됩니다.
- 우리는 isoflurane과 anesthetized 아르 쥐에서 수집 쥐 IC 혈청을 구입할 수 있습니다.
- 일회용 병 이케 모토 리카에서도 사용할 수 있습니다. 병 및 실리콘 플러그는 autoclaved해야합니다.
- 해부 동안 낮은 또는 높은 온도에서 배아의 유지하는 것은 WEC의 후속 개발에 영향을하기 때문에 태아의 해부는 RT에서 수행해야합니다.
- 해부를위한 도구는 건조 열 소독을하고 있습니다.
- 피부 복벽은 가능한 한 그릇에 머리카락의 오염을 피하기 위해 별도로 절단한다. 우리는 우리가 피부를자를 때 그들의 새로운 쌍을 대형 가위와 집게 한 켤레를 변경하고 각각의 자궁을 분리.
- 누구의 조언 정상입니다 포셉를 사용하면 확실하게 조직을 해부하다하는 것은 매우 중요합니다. 우리는 수동으로 돌 및 기계 기름 포셉의 도움말을 선명하게.
- 우리는 배아에 과잉 압력을 피하기 위해 칼과 같은 포셉의 한쪽을 사용합니다.
- WEC 시스템 내부의 온도가 반복 문을 열어 감소하면, 우리는 시스템 내부 온도를 유지하기 위해, 불 켜고 계속.
8. 대표 결과
그림 1은 쥐의 배아와 교양 쥐 배아의 해부의 과정을 보여줍니다.
그림 1. E12.5 쥐 배아의 전체 배아 문화. (A) conceptus은 임신 쥐의 자궁에서 해부 했어요. 태반 사이드에서 decidua의 (B) 제거. 레이처트의 막의 (C) 제거. (D) 난황을 여는. WEC의 시작 후 6 시간에 대한 병 (E) 쥐의 배아 culturing. (F) 쥐의 배아 42 시간을위한 교양. D, decidua, R, 레이처트의 멤브레인, P, 태반, YS, 난황, E, 배아.
| 0 시간 | 12 시간 | 24 시간 | 36 시간 | 48 시간 | |
| E12.5 쥐 배아 | 95% 50 CC | 95% 75 CC (10 시간) | 95% 100 CC | 95% 125 CC (34 시간) | 95% 150 CC |
표 1. 최적의 산소 상태.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
성공을 위해 쥐 WEC의 두 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 절개 절차 아니라 특히 태아 손상, 혈관을 정확하게해야합니다. 산소와 영양소가 더 이상 자궁에서 분리 후 태반을 통해 공급 없기 때문에 둘째, 절차는 가능한 한 빨리해야합니다. 이것은 기존의 배아를 위해 중요합니다. E12.5 후 쥐 WEC의 경우, 우리는 30 분 이내에 문화 병으로 해부하는 배아를 전송해야합니다.
우리는 형광 염료 DiI와 세포의 작은 숫자를 라벨이나 야생 타입과 돌연변이 배경 7 쥐의 배아에 DiI - 레이블 세포를 이식하여 야생 유형과 Pax6 돌연변이 쥐의 배아에서 신경 능선 세포의 마이 그 레이션 패턴을 분석했습니다. 앞쪽에 신경 판의 운명지도는 24 시간 8 DiI과 culturing와 neuroepithelial 세포 라벨에서 마우스로 그려왔다. WEC는 Pax6 돌연변이 쥐를 9 표시된 이주 결함의 세포 자율성을 검토 E12.5 쥐 배아의 telencephalon에 GFP를 표현하는 세포의 이식에도 사용되고 있습니다. 다양한 억제제가 개발 10, 11 중에 축 형성과 세포주기에 관련된 신호 전달 경로를 검사하는 문화 매체에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단지 유전자의 기능에게 12,13,14을 분석 electroporation에 의해 교양 태아의 두뇌를 개발로 표현 plasmids와 siRNA를 도입할 수 있습니다. 우리는 또한 (심판을 참조하십시오. 14 안에 참조) 14 WEC 다음과 같은 장기의 문화 또는 슬라이스 문화에 형광 단백질로 분류 neuroepithelial 세포의 동작을 조사 하였다. 따라서, 쥐 WEC뿐만 아니라 세포 혈통을 분석뿐만 아니라 손실의 기능과 이득의 기능을 실험으로 유전자 기능을 elucidating 매우 유용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 비디오를 편집 비디오 녹화 및 유용한 조언 씨 하지메 이치 감사합니다. 우리는 또한 비디오 녹화 종류의 조수에 대한 Drs.Yuji Tsunekawa 및 가이치 요시 자키 감사드립니다. 이 작품은 젊은 과학자의 B와 일본의 MEXT에서 우선 분야 - 분자 뇌 과학에 KAKENHI에 의해 지원됩니다. 우리의 지원을 인정 글로벌 COE 일본어 과학 기술기구 (일본 표준시)에서 일본어 과학 기술 주식 회사에서 진화론적인 과학 기술에 대한 일본의 MEXT에서 프로그램 "글로벌 브레인 과학에 대한 기본 및 Translational 연구 센터"와 핵심 연구 (크레스트) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
