Summary
Hele embryo cultuur techniek stelt ons in staat om de cultuur muis en rat embryo's
Abstract
Hele embryo cultuur (WEC) techniek is ontwikkeld in 1950 is door de New en zijn collega's, en toegepast voor ontwikkelingsbiologie 1. Hoewel de ontwikkeling en groei van zoogdieren embryo's zijn sterk afhankelijk van de functie van de placenta, WEC-techniek stelt ons in staat om de cultuur muizen en ratten embryo's ex vivo conditie tijdens een beperkte periode die overeenkomt met midgestation etappes tijdens de embryonale dag (E) 6.5-E12.5 in de muis of E8.5-E14.5 in de rat 2, 3, 4. In de WEC, kunnen we direct richten gewenste gebieden van embryo's met behulp van fijne glazen capillairen, omdat embryo's kunnen worden gemanipuleerd onder de microscoop. Daarom, knaagdier WEC is erg nuttige techniek als we willen dynamische ontwikkelingsprocessen van postimplanted zoogdieren embryo's te bestuderen. Tot op heden hebben verschillende types van WEC systemen ontwikkeld: 1. Onder hen, de rotator-type fles cultuur-systeem is het meest populair en geschikt voor de lange termijn de cultuur van embryo's op midgestation, dat wil zeggen, na E9.5 en E11.5 in de muis en rat, respectievelijk 1. In deze video protocol, tonen wij onze standaard procedures van de rat WEC na E12.5 met behulp van een verfijnd model van de oorspronkelijke rotator systeem, dat werd ontworpen door nieuwe en Cockroft 5, 6, en de invoering van de verschillende toepassingen van WEC techniek voor studies in zoogdieren ontwikkeling biologie.
Protocol
1. Het opzetten van de WEC-systeem
- Gezamenlijk een 0.22 um membraanfilter naar de inlaat siliconenslang binnen WEC-systeem een).
- Open de klep van een gasfles met O 2 (95%) en CO 2 (5%). Doorstroming het gasmengsel in de trommel via de bruisende fles met geautoclaveerd water.
- Stel de flow volume van het gas mengsel tot 50 cc.
- Plaats de uit siliconen tube te laten in een fles water en bekijk de stroom van gas mengsel.
- Draai de trommel met de snelheid van 20 rpm / min.
2. De voorbereiding van kweekmedium
- Dooi rat onmiddellijk-gecentrifugeerd (IC) serum bij 37,0 ° C b). Voeg D-glucose (2 mg / ml) in serum ontdooid in een autoclaaf bekerglas van 100 ml. Kweekmedium moeten worden voorbereid op de primaire cultuur-niveau (bijvoorbeeld met behulp van een kap).
- Voeg antibiotica-antimycotische (100X) vloeistof aan het serum met 1: 400 verdunning.
- Verdampen resterende isofluraan (als gevolg van anesthesie van de ratten tijdens het verzamelen van bloed) uit het serum gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT), c).
- Steriliseer het kweekmedium met behulp van een 0,45 um membraanfilter.
- Giet 3,0 ml van het medium in elke cultuur fles en sluit de top van elke fles met een siliconen plug, bedekt met aluminiumfolie (zie ref. 14) d).
- Bereid drie of vier beschikking platen met zoutoplossing e Tyrode's).
3. Anesthesie van de rat en het isolement van de baarmoeder
- Diep verdoven een timed-zwangere ratten met inhalatie-of parenterale anesthetica.
- Maak de buik van de zwangere ratten verdoofd met 70% ethanol.
- Pak de huid met een tang en exterioriseren de buikwand door het snijden van de huid met grote schaar f).
- Pak de buikwand met een pincet en maak U-vormige grote longitudinale incisies op de buikwand met een grote schaar tot aan de thoracale niveau g).
- Beer weg de darm naar de linkerkant met een pincet en bloot een uiteinde van de baarmoeder is aangesloten op de eierstok.
- Pick-up aan het einde van de baarmoeder met een pincet en knip de positie tussen de baarmoeder en eierstokken met een grote schaar.
- Haal de baarmoeder van de zwangere rat door het snijden van de vet rond de baarmoeder tot aan de andere kant van de baarmoeder.
- Overdracht van de baarmoeder om een petrischaal met Tyrode's zoutoplossing.
- Euthanaseren de rat door overmatige toediening van anesthetica of cervicale dislocatie na het verwijderen van de baarmoeder.
4. Verwijdering van embryo's uit de baarmoeder
- Kort spoelen de baarmoeder in een zoutoplossing Tyrode en overbrengen naar het tweede petrischaal met een paar fijne tang h).
- Onder een binoculaire microscoop, pak de baarmoederwand met een paar fijne pincetten en snijd de baarmoederwand aan de kant tegenover de mesometrium verbinden met bloedvaten met behulp van oogheelkundige rechte schaar.
- Steek de punt van oogheelkundige rechte schaar in de ruimte tussen de baarmoederwand en de decidua. Snijd de baarmoederwand lengterichting langs de antimesometrial kant.
- Clump de decidua aan de mesometrial zijkant en gescheiden conceptuses uit de baarmoeder gebruik van twee paar fijne tang i).
- Overdracht conceptuses naar de derde petrischaal met een gesteriliseerde glazen pipet met een geschikte diameter.
5. Dissectie van de rat embryo's
- Steek een uiteinde van de microforceps in de decidua en maak een dwarse incisie op de decidua rond de conceptie met twee paar pincetten.
- Steek de uiteinden van de tang in de decidua aan de placenta kant en maken twee longitudinale incisies op de decidua naar de top.
- Verwijder de decidua aan de placenta kant door scheuren, dat met twee paar pincetten. Verwijder de resterende decidua met twee paar pincetten.
- Pick-up Reichert's membraan, een horizontale incisie op, en scheiden de membraan van het bevruchte ei in de anti-placenta kant.
- Maak een klein gaatje aan de dooierzak in de buurt van de kop van het embryo met de twee paren van forceps, en snijd de dooierzak met een paar van oogheelkundige gebogen schaar. Het is belangrijk om niet te beschadigen grote bloedvaten.
- Pak de amnion op de site rond het hoofd van het embryo met de twee paren van fijne pincet, en trek uit het embryo van de dooierzak door het scheuren van de amnion h). Het lichaam van het embryo moet worden getrokken uit de dooierzak de levering van zuurstof voor het embryo te verhogen in de midgestation stadium.
6. Hele embryo cultuur
- Controleer schade aan de placenta, dooierzak en de toestand van de hartslag en de bloedsomloop.
- Zich bewust zijn van het niet uitrekken van de navelstreng, de overdrachthet embryo tot een cultuur fles met een gesteriliseerde glazen pipet. Overdracht van een zoutoplossing Tyrode om cultuur van flessen moeten worden zo weinig mogelijk.
- Verwijderen van een niet-gat silicium stekker uit de rotator trommel. Sluit de cultuur fles met een stekker met een gat om de rotator trommel van de WEC-systeem loodrecht. Wees voorzichtig niet te dwingen op de trommel in ongeschikte richtingen, omdat de rotator trommel is een zeer fijn materiaal. De flessen met de opengesneden embryo worden overgedragen aan de cultuur een voor een openen van de voordeur van de incubator moet worden beperkt om de temperatuur van de incubator te voorkomen is verlaagd j).
- Na 10 uur van de cultuur, te verhogen van de doorstroming van gasmengsel tot 75 cc en tot 100 cc na 24 uur (tabel 1).
- Het kweekmedium moet worden veranderd rond 24 uur door de overdracht van de gekweekte embryo in een nieuwe cultuur fles met vers bereide medium. Verhoog de flow volume tot 125 cc na 34 uur en tot 150 cc na 48 uur (tabel 1)
- Af en toe controleert de toestand van de gekweekte embryo's door het tellen van hartslag-tarief (dwz, 120-150/min is optimaal) en door het observeren van de bloedcirculatie. Indien nodig tellen het aantal somieten om de groei van embryo's in zoutoplossing Tyrode's te beoordelen. In de normale ontwikkeling, is een somiet toegevoegd in twee uur.
- Wanneer WEC klaar is, stop levering van gas mengsel en verwijder de inlaat buis en het membraan filter om te voorkomen terugstromen in de inlaatbuis van de bruisende fles.
7. Opmerkingen
- De temperatuur in de WEC-systeem wordt constant gehouden op 37,0-37,5 ° C.
- 100% rat IC serum wordt routinematig gebruikt in onze WEC voor rat en muis embryo's en bewaard bij -20 ° C voor gebruik.
- Wij kopen rat IC serum, dat is verzameld van ratten die zijn verdoofd met isofluraan.
- Wegwerpflessen zijn ook verkrijgbaar bij Ikemoto Rika. Flessen en silicium stekkers moet worden geautoclaveerd.
- Dissectie van embryo's moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, omdat handhaving van embryo's bij lage of hoge temperaturen tijdens de dissectie van invloed zijn verdere ontwikkeling in de WEC.
- Tools voor dissectie worden gesteriliseerd door droge hitte.
- De huid en buikwand dienen afzonderlijk te worden teruggebracht tot verontreiniging van haren te voorkomen in een schaal mogelijk te maken. Veranderen we een paar grote schaar en pincet met een nieuw paar van hen als we snijden de huid en de baarmoeder te isoleren, respectievelijk.
- Met behulp van een tang die tips zijn prima is zeer belangrijk om zeker ontleden weefsels. We handmatig slijpen de uiteinden van pincet met een steen en machine-olie.
- We maken gebruik van een kant van de pincet als een mes om overdruk te vermijden om embryo's.
- Wanneer de temperatuur binnen in de WEC-systeem vermindert door het openen van de deur herhaaldelijk blijven we zetten het licht op temperatuur te houden binnen het systeem.
8. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont de procedures van dissectie van de rat embryo en gekweekte rat embryo's.
Figuur 1. Hele embryo cultuur van de E12.5 rat embryo. (A) Een conceptus ontleed uit de baarmoeder van de zwangere rat. (B) Afschaffing van de decidua aan de placenta kant. (C) Afschaffing van membraan Reichert's. (D) openen van de dooierzak. (E) De rat embryo kweken in de fles gedurende 6 uur na het begin van de WEC. (F) De rat embryo gekweekt voor 42 uur. d, decidua, R; Reichert's membraan, p, placenta, ys, dooierzak, e, embryo.
| 0 uur | 12 uur | 24 uur | 36 uur | 48 uur | |
| E12.5 rat embryo | 95% 50 cc | 95% 75 cc (10 uur) | 95% 100 cc | 95% 125 cc (34 uur) | 95% 150 cc |
Tabel 1. Optimale zuurstof conditie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen in het knaagdier WEC voor het succes. Ten eerste moet de dissectie procedure nauwkeurig niet te beschadigen embryo's, in het bijzonder de bloedvaten. Ten tweede moet de procedure worden zo snel mogelijk, omdat zuurstof en voedingsstoffen worden niet meer gevoed via de placenta na isolatie uit de baarmoeder. Dit is essentieel voor oudere embryo's. In het geval van rat WEC na E12.5, moeten we overdragen ontleed embryo's in de cultuur flessen binnen 30 minuten.
We hebben de migratie patronen van neurale lijst cellen in het wild type en PAX6 mutant rat embryo's door middel van etikettering een klein aantal cellen met fluorescente kleurstof DII of uitplanten DII-gemerkte cellen in ratten embryo's van de wild-type en mutant achtergrond 7. Een lot kaart van de voorste neurale plaat is opgesteld in de muis van etikettering neuro-epitheliale cellen met DII en het kweken gedurende 24 uur 8. WEC is ook gebruikt voor de transplantatie van cellen die GFP in de telencephalon van E12.5 rat embryo's naar cel autonomie onderzoeken migratie gebreken in de PAX6 mutant rat 9. Verschillende remmers kan worden toegepast op het kweekmedium te signaalwegen die betrokken zijn bij-vorming en celcyclus tijdens de ontwikkeling 10, 11 te onderzoeken. Bovendien kunnen we gewoon introduceren expressieplasmiden en siRNA in de ontwikkeling van hersenen van de gekweekte embryo's door middel van elektroporatie te analyseren genfuncties 12,13,14. We hebben ook onderzocht het gedrag van neuro-cellen gelabeld met fluorescerend eiwit in orgelcultuur of slice cultuur volgende WEC (zie ref. 14 en referenties daarin) 14. Daarom, knaagdier WEC is heel handig, niet alleen voor het analyseren van cellijn, maar ook voor het ophelderen van gen-functies door verlies-van-functie en gain-of-function experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de heer Hajime Ichijo voor video-opname en nuttige adviezen voor het bewerken van de video. We danken ook Drs.Yuji Tsunekawa en Kaichi Yoshizaki voor soort assistent voor video-opname. Dit werk wordt ondersteund door KAKENHI op Young Scientist B en op prioritaire gebieden-Molecular Brain Science van MEXT van Japan. Wij erkennen de steun van Global COE-programma 'Basic and Translational Research Center for Global Brain Science "van MEXT van Japan en de Core Research voor Evolutionaire Wetenschap en Technologie (CREST) van de Japanse Science and Technology Corporation uit Japan Science and Technology Agency (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M.
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K.
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
