Summary
ثقافة بأكملها تقنية الجنين يسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران
Abstract
وقد وضعت كلها الجنين الثقافة (WEC) في عام 1950 أسلوب جديد من قبل وزملائه ، وقدم طلبا للعلم الأحياء التطوري 1. على الرغم من تطور ونمو أجنة من الثدييات التي تعتمد بشكل حاسم على وظيفة المشيمة ، WEC تقنية تسمح لنا الماوس الثقافة وأجنة الفئران السابقين شرط المجراة خلال فترات محدودة الموافق المراحل الجنينية midgestation خلال اليوم (E) 6.5 في E12.5 الماوس أو E8.5 - E14.5 في الفئران 2 ، 3 ، 4. في WEC ، يمكننا مباشرة الهدف المنشود مجالات الاجنة باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاج لأنه لا يمكن التلاعب بها أجنة تحت المجهر. لذلك ، WEC القوارض هو تقنية مفيدة جدا عندما نريد دراسة العمليات التنموية الحيوية للأجنة الثدييات postimplanted. حتى الآن ، وقد تم تطوير عدة أنواع من النظم WEC 1. من بين هؤلاء ، زجاجة الثقافة المدورة من نوع النظام هو الأكثر شعبية ومناسبة على المدى الطويل ثقافة أجنة في midgestation ، أي بعد وE9.5 E11.5 في الفأر والجرذان ، على التوالي 1. في هذا البروتوكول الفيديو ، ونظهر بمستوى إجراءاتنا WEC الفئران بعد E12.5 باستخدام نموذج راق في النظام المدورة الأصلي ، الذي صممه كوكروفت جديدة و 5 و 6 ، وإدخال مختلف تطبيقات تقنية WEC للدراسات الإنمائية في الثدييات البيولوجيا.
Protocol
1. إعداد نظام WEC
- مشترك غشاء 0.22 ميكرون تصفية لمدخل أنبوب السيليكون داخل النظام WEC أ).
- فتح صمام اسطوانة الغاز التي تحتوي على O 2 (95 ٪) وثاني أكسيد الكربون 2 (5 ٪). تدفق خليط الغاز في طبلة عن طريق زجاجة تحتوي على فقاعات الماء تعقيمها.
- ضبط حجم تدفق خليط الغاز إلى 50 سم.
- تضاف إلى ترك أنبوب السيليكون في زجاجة المياه وفحص تدفق خليط الغاز.
- تدوير أسطوانة بسرعة 20 دورة في الدقيقة / دقيقة.
2. إعداد مستنبت
- الفئران ذوبان الجليد على الفور ، طرد (IC) في مصل الدم 37.0 درجة مئوية ب). إضافة D - غلوكوز (2 ملغ / مل) في المصل مذوبة في الدورق 100 مل تعقيمها. وينبغي إعداد المتوسطة الثقافة على مستوى الثقافة الأساسية (على سبيل المثال ، وذلك باستخدام غطاء محرك السيارة).
- إضافة مضاد فطري للمضادات الحيوية (100X) السائل إلى المصل مع 1 : 400 التخفيف.
- تبخير isoflurane المتبقية (بسبب تخدير الفئران خلال جمع الدم) من المصل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ج).
- تعقيم مستنبت باستخدام الغشاء 0.45 ميكرون التصفية.
- صب 3.0 مل من المتوسط في كل زجاجة الثقافة وختم أعلى كل زجاجة مع المكونات السيليكون ، مع تغطية احباط الالومنيوم (أنظر المرجع 14) د).
- إعداد ثلاثة أو أربعة أطباق بتري تحتوي على التخلص من المياه المالحة Tyrode ه).
3. التخدير من الفئران والعزلة الرحم
- تخدير الفئران الحوامل توقيت - عميقا مع التخدير بالحقن أو الاستنشاق.
- تنظيف منطقة البطن من الفئران الحوامل في تخدير مع الايثانول 70 ٪.
- يلتقط الجلد مع ملقط وexteriorize جدار البطن عن طريق قطع الجلد مع و مقص كبير).
- التقط جدار البطن مع زوج من الملقط واجري على شكل حرف U شقوق طولية كبيرة على جدار البطن مع مقص كبير يصل إلى مستوى الصدر ز).
- الدب بعيدا الأمعاء إلى الجانب الأيسر مع زوج من الملقط وفضح واحدة من نهاية الرحم متصلة المبيض.
- التقط نهاية الرحم مع زوج من الملقط وقطع الموقف بين الرحم والمبيض مع مقص كبير.
- اخراج الرحم من الفئران الحوامل عن طريق خفض الدهون حول الرحم حتى نهاية أخرى من الرحم.
- نقل الرحم على طبق بتري تحتوي على Tyrode المالحة.
- الموت ببطء الفأر من قبل إدارة المفرط للمواد التخدير أو خلع عنق الرحم بعد إزالة الرحم.
4. إزالة الأجنة من الرحم
- شطف لفترة وجيزة في الرحم Tyrode المالحة وتحويلها إلى طبق بيتري الثانية مع زوج من غرامة ملقط ح).
- تحت المجهر مجهر ، والتقاط جدار الرحم مع زوج من غرامة وملقط قطع جدار الرحم في الجانب المعاكس للmesometrium التواصل مع الأوعية الدموية باستخدام مقص العيون على التوالي.
- إدراج غيض من مقص العيون مباشرة الى المسافة بين جدار الرحم والساقط. قطع جدار الرحم طوليا على طول الجانب antimesometrial.
- تتجمع في الساقط على الجانب mesometrial conceptuses ومنفصلة عن الرحم باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة ط).
- conceptuses نقل إلى طبق بيتري الثالث برصيد ماصة زجاجية معقمة بقطر مناسب.
5. تشريح للأجنة الفئران
- إدراج أحد غيض من microforceps في الساقط وإحداث شق عرضي على الساقط حول محصول الحمل مع اثنين من أزواج من الملقط.
- إدراج نصائح من الملقط في الساقط على الجانب المشيمة وجعل اثنين من الشقوق الطولية على الساقط إلى الأعلى.
- إزالة الساقط على الجانب المشيمة التي باقتلاع ذلك مع اثنين من أزواج من الملقط. إزالة الساقط المتبقية مع اثنين من أزواج من الملقط.
- تلتقط غشاء رايخرت ، وجعل شق أفقي على ذلك ، وفصل الغشاء من الحمل المستكن في الجانب المعادي المشيمة.
- جعل ثقب صغير في كيس المح بالقرب من رأس الجنين مع اثنين من أزواج الملقط ، وقطع كيس المح مع زوج من مقص العيون منحنية. فمن المهم ألا يدمر الاوعية الدموية الرئيسية.
- التقط السلى في موقع حول الرأس الجنين مع اثنين من أزواج ملقط غرامة ، وبرفق خارج الجنين من كيس المح من قبل تمزيق ح سلى). ينبغي سحب جسم الجنين من كيس المح لزيادة المعروض من الاوكسجين للجنين في مرحلة midgestation.
6. ثقافة بأكملها الجنين
- التحقق من الأضرار على المشيمة ، كيس المح ، وحالة الضرب القلب والدورة الدموية.
- يكون على علم لا تمتد الحبل السري ، ونقلالجنين الى زجاجة الثقافة مع ماصة الزجاج المعقمة. وينبغي أن تحمل أكثر من المياه المالحة Tyrode لزجاجات ثقافة يكون أقل قدر ممكن.
- إزالة المكونات غير السيليكون من ثقب طبلة المدورة. توصيل زجاجة الثقافة مع المكونات مع وجود ثقب في طبلة المدورة للنظام WEC عموديا. يجب الحرص على عدم وضع القوة على الطبل في اتجاهات غير مناسبة منذ طبل المدورة هي معدات دقيقة للغاية. يتم نقل الزجاجات التي تحتوي على الجنين تشريح للثقافة واحدا تلو الآخر ، وينبغي التقليل من فتح الباب أمام حاضنة لتجنب حرارة الحاضنة وانخفض ي).
- بعد 10 ساعة من الثقافة ، وزيادة حجم تدفق خليط الغاز يصل الى 75 سم وحتى 100 سم مكعب بعد 24 ساعة (الجدول 1).
- ينبغي تغيير الثقافة المتوسطة نحو 24 ساعة عن طريق نقل الجنين مثقف في زجاجة جديدة مع الثقافة المتوسطة الطازجة. زيادة حجم تدفق ما يصل الى 125 سم مكعب بعد 34 ساعة وحتى 150 سم مكعب بعد 48 ساعة (الجدول 1)
- الاختيار في بعض الأحيان حالة من أجنة مثقف عن طريق العد معدل ضربات القلب (أي 120-150/min هو الأمثل) ، ومراقبة الدورة الدموية. إذا كان المطلوب حساب عدد somites للحكم على نمو الأجنة في المياه المالحة في Tyrode. في التطور الطبيعي ، وأضيف الجسيدة في ساعتين.
- عندما يتم الانتهاء من WEC ، ووقف إمدادات الغاز وخليط قطع أنبوب مدخل والغشاء تصفية لتجنب العودة الى تدفق أنبوب مدخل من الزجاجة محتدما.
7. تلاحظ
- يتم الاحتفاظ باستمرار على درجة الحرارة داخل النظام في WEC 37،0-37،5 درجة مئوية.
- يستخدم بشكل روتيني 100 ٪ IC المصل في الفئران WEC لدينا أجنة الجرذان والفئران ، والاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- نحن شراء المصل IC الفئران ، والتي يتم جمعها من الفئران التي تم تخدير مع isoflurane.
- زجاجات يمكن التخلص منها وتتوفر أيضا من Ikemoto ريكا. يجب تعقيمها الزجاجات والمقابس السيليكون.
- وينبغي إجراء تشريح للأجنة في RT لأن الحفاظ على الأجنة في درجة حرارة منخفضة أو مرتفعة خلال تشريح تؤثر على التطور اللاحق في WEC.
- يتم تعقيم الأدوات اللازمة لتشريح بواسطة الحرارة الجافة.
- يجب أن تقطع الجلد وجدار البطن بشكل منفصل لتجنب التلوث من الشعر في صحن ممكن. نغير مقصا كبيرا وملقط مع زوج جديد من لهم عندما نقطع الجلد وعزل الرحم ، على التوالي.
- باستخدام الملقط الذي على ما يرام نصائح مهمة جدا لتشريح الأنسجة بالتأكيد. علينا شحذ يدويا نصائح من ملقط بحجر والنفط الآلة.
- نستخدم جانب واحد من مثل سكين ملقط لتجنب الضغط الزائد على الأجنة.
- عندما تكون درجة الحرارة داخل النظام WEC النقصان من خلال فتح الباب مرارا وتكرارا ، ما زلنا لتشغيل الضوء للحفاظ على درجة الحرارة داخل النظام.
8. ممثل النتائج
الشكل 1 يبين إجراءات تشريح الجنين الجرذان والفئران مثقف الأجنة.
الشكل 1. الجامع ثقافة الجنين الجنين E12.5 الفئران. (أ) من الحمل المستكن تشريح الرحم من الفئران الحوامل. (ب) إزالة الساقط على الجانب المشيمة. (ج) إزالة غشاء رايخرت. (د) فتح الكيس المحي. (E) وزراعة الأجنة الفئران في زجاجة لمدة 6 ساعة بعد بداية WEC. (F) وجنين فأر تربيتها لمدة 42 ساعة. د ، الساقط ؛ R ؛ غشاء رايخرت ، P ، المشيمة ؛ YS ، الكيس المحي ، البريد ، الجنين.
| 0 ساعة | 12 ساعة | 24 ساعة | 36 ساعة | 48 ساعة | |
| E12.5 جنين فأر | 95 ٪ 50 سم | 95 ٪ 75 سم (10 ساعة) | 95 ٪ 100 سم مكعب | 95 ٪ 125 سم مكعب (34 ساعة) | 95 ٪ 150 سم مكعب |
الجدول 1. الشرط الأمثل الأوكسجين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في WEC القوارض للنجاح. أولا ، ينبغي إجراء تشريح لا تكون دقيقة إلى الأجنة الضرر ، لا سيما الأوعية الدموية. ثانيا ، ينبغي أن يكون الإجراء في أسرع وقت ممكن لأن الاوكسجين والمغذيات لم تعد الموردة عبر المشيمة بعد العزلة من الرحم. هذا أمر بالغ الأهمية لكبار السن من الأجنة. في حالة الفئران بعد WEC E12.5 ، ينبغي لنا أن نقل الأجنة في زجاجات تشريح الثقافة في غضون 30 دقيقة.
لقد قمنا بتحليل أنماط الهجرة من الخلايا العصبية في قمة نوع البرية وأجنة الفئران الطافرة Pax6 بواسطة وسم أعداد صغيرة من الخلايا مع صبغة الفلورسنت الجاذبة أو زرع الجاذبة المسمى الخلايا في أجنة الفئران من نوع البرية والخلفية 7 متحولة. وقد تم رسم خريطة لوحة مصير العصبية الأمامية في الماوس من الخلايا الظهارية العصبية العلامات مع صلاح الغيدان وزراعة لمدة 24 ساعة 8. WEC كما تم استخدامها لزرع الخلايا معربا عن GFP في أجنة الفئران telencephalon E12.5 لبحث الحكم الذاتي في الخلايا عيوب الهجرة هو موضح في الفئران الطافرة Pax6 9. ويمكن تطبيق مختلف مثبطات إلى مستنبت لدراسة مسارات إشارات تشارك في تشكيل محور ودورة الخلية خلال التنمية 10 ، 11. وعلاوة على ذلك ، يمكننا أن نقدم ببساطة البلازميدات التعبير وسيرنا في تطوير أدمغة الأجنة بواسطة مثقف electroporation لتحليل وظائف الجينات 12،13،14. نحن أيضا التحقيق في سلوك الخلايا الظهارية العصبية المسمى مع بروتين فلوري في الثقافة أو الثقافة الجهاز شريحة التالية WEC (انظر المرجع (14). والمراجع فيه) 14. لذلك ، WEC القوارض مفيد جدا ليس فقط لتحليل النسب الخلية ولكن أيضا لتوضيح وظائف الجينات من فقدان الوظائف ، والتجارب من مكاسب من بين وظيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر السيد هاجيمي Ichijo النصائح لتسجيل الفيديو ومفيدة لتحرير الفيديو. ونحن نشكر أيضا Drs.Yuji Tsunekawa وYoshizaki Kaichi لمساعد النوع لتسجيل الفيديو. ويدعم هذا العمل KAKENHI على B والعلماء الشباب على العلوم الأولوية مناطق الدماغ الجزيئية من وزارة التربية في اليابان. نعترف دعم البرنامج العالمي لمجلس أوروبا "مركز البحوث الأساسية وبالحركة العالمية للعلوم الدماغ" من وزارة التربية واليابان للأبحاث الأساسية للعلوم والتكنولوجيا تطوري (كريست) من العلوم اليابانية وشركة التكنولوجيا اليابانية من علوم والتكنولوجيا وكالة (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
