Summary
Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin verir
Abstract
Tüm embriyo kültürü (WEC) tekniği, Yeni ve arkadaşları tarafından 1950'li yıllarda geliştirilmiş ve gelişim biyolojisi 1 için uygulanan olmuştur . Memeli embriyolarının gelişim ve büyüme plasentanın fonksiyonu üzerine eleştirel bağımlı olmasına rağmen, WEC teknik embriyonik gün (E) 6.5-E12.5 sırasında midgestation aşamalarına karşılık gelen sınırlı dönemlerde kültür fare ve sıçan embriyolar ex vivo durumu sağlar fare veya sıçan 2, 3, 4 E8.5-E14.5. Embriyoların mikroskop altında manipüle edilebilir, çünkü WEC, ince cam kapilerleri kullanarak embriyo alanlarda doğrudan istenen hedef yapabilirsiniz. Bu nedenle, biz postimplanted memeli embriyolarının dinamik gelişim süreçlerini incelemek için istediğiniz zaman kemirgen WEC çok yararlı bir tekniktir. Bugüne kadar, çeşitli WEC sistemleri 1 geliştirilmiştir. Bunların arasında, sırasıyla 1, fare ve sıçan E9.5 ve E11.5, sonra rotator tip şişe kültür sistemi, en popüler ve en uzun vadeli midgestation, yani embriyoların kültürü için uygundur . Bu video protokolde, Yeni ve Cockroft 5, 6 tarafından tasarlanmış orijinal rotator sistemi, zarif bir model kullanılarak E12.5 sonra sıçan WEC standart prosedürler göstermek ve memeli gelişim çalışmaları için WEC tekniğin çeşitli uygulamalarını tanıtmak biyolojisi.
Protocol
1. WEC sistemi kurmak
- Ortak WEC sistemi içinde giriş silikon tüp filtre 0.22 mikron membran).
- O 2 (% 95) ve CO 2 (% 5) içeren bir gaz silindir valfini açın. Otoklava su içeren köpürme şişe ile davul içine gaz karışımı akış.
- Gaz karışımı akışını hacmi 50 cc ayarlayın.
- Dışında bir su şişesi içine silikon tüp izin ve gaz karışımı akışını kontrol yerleştirin.
- 20 dev / dak hızında davul döndürün.
2. Kültür ortamı hazırlanması
- 37.0 çözülme sıçan hemen santrifüje (IC) serum ° C b). Otoklavlanmış 100 ml beher çözülmüş serum içine ekleyin D-glukoz (2 mg / ml). Kültür orta birincil kültür seviyesi (örneğin, bir başlık kullanarak) hazırlanmalıdır.
- 400 seyreltme: 1 ile serum antibiyotik antimikotik (100X) sıvı ekleyin.
- Kalan izofluran buharlaşacak (sıçanlarda kan toplama sırasında anestezi nedeniyle), oda sıcaklığında (RT) c) 20 dakika serum .
- 0.45 mikron membran filtre kullanılarak kültür ortamı sterilize edin.
- Her kültürün şişe, orta 3,0 ml dökün ve alüminyum folyo kaplı bir silikon fişi ile her şişe üst, mühür (ref 14) d).
- Tyrode en tuzlu e içeren üç ya da dört bertaraf Petri kapları hazırlayın).
3. Anestezi, rahim sıçan ve izolasyon
- Parenteral veya inhalasyon anesteziklerin derinden zamanlanmış bir gebe sıçan anestezisi.
- % 70 etanol ile anestezi gebe sıçan karın bölgesini temizleyin.
- Forseps ile cilde Pick up ve) büyük makasla f cilt keserek karın duvarı exteriorize.
- Forseps bir çift ile karın duvarı Pick up) torasik düzeyde g büyük makas ile karın duvarı U-şekilli büyük uzunlamasına insizyonlar makyaj.
- Forseps bir çift ile sol tarafına uzak Bear bağırsak ve rahim, yumurtalık bağlı bir ucunu göstermek.
- Forseps bir çift rahim sonuna Pick up ve büyük makas ile rahim ve yumurtalık arasındaki konumunu kesmek.
- Gebe sıçan rahim, rahim diğer sonuna kadar rahim çevresindeki yağ keserek çıkartın.
- Tyrode Kullanıcı tuzlu su içeren Petri rahim aktarın.
- Rahim çıkardıktan sonra anesteziklerin aşırı idaresi veya servikal dislokasyon sıçan Euthanize.
4. Embriyolar rahim çıkarılması
- Kısaca yıkayın ve Tyrode Kullanıcı salin rahim), ince forseps h bir çift ile ikinci Petri kabı transfer .
- Binoküler mikroskop altında, ince forseps bir çift rahim duvarına pick up ve oftalmik düz makas kullanarak kan damarları ile bağlantı mesometrium karşı tarafında rahim duvarına kesmek.
- Rahim duvarı ve desidua arasında uzaya oftalmik düz makas ucu takın. Rahim duvarına boydan boya antimesometrial kenarı boyunca kesin.
- Mesometrial tarafında desidua ve ince forseps i) iki çift rahim ayrı conceptuses tutam.
- Uygun bir çapa sahip bir steril cam pipet ile üçüncü Petri kabı conceptuses aktarın.
5. Rat embriyoları diseksiyonu
- Desidua microforceps bir ucu takın ve iki çift forseps ile konseptus etrafında desidua enine bir kesi yapmak.
- Plasenta tarafında desidua forseps ipuçları takın ve üst için desidua iki uzunlamasına insizyonlar yapmak.
- Bu iki çift forseps ile ripping tarafından plasenta tarafında desidua çıkarın. Iki çift forseps ile kalan desidua çıkarın.
- Reichert membranı Alış üzerinde yatay bir kesi yapmak ve anti-plasenta tarafında konseptus membran ayrı.
- Forseps iki çifti ile yolk kesesi embriyo kafa yakın küçük bir delik açın ve oftalmik kavisli makas bir çift ile yolk sac kesme. Büyük kan damarlarının zarar vermemek için çok önemlidir.
- Embriyo başının etrafında yerinde iki çift ince forseps amniyon Pick up ve hafifçe), amniyon h yırtılma yolk kesesi embriyo çekin . Embriyonun vücut midgestation aşamada embriyo için oksijen kaynağı artırmak için yumurta sarısı kesesi dışarı çekilmelidir.
6. Tüm embriyo kültürü
- Plasenta, yolk kesesi, kalp dayak ve kan dolaşımı durumu zararlar kontrol edin.
- Göbek kordonu uzanan farkında olmak, transfer, steril bir cam pipet ile bir kültür şişe embriyo. Tyrode Kullanıcı tuzlu su kültürü şişeleri üzerinde taşır, mümkün olduğunca az olmalıdır.
- Rotator davul delik olmayan bir silikon fişini çıkartın. WEC sistemi rotator davul dik bir deliği olan bir eklenti ile kültür şişe bağlayın. Rotator davul çok ince bir ekipman olduğundan olumsuz yönde davul tarihinde yürürlüğe koymak için dikkatli olun. Disseke embriyo içeren şişeler tek kültür tek aktarılır; kuluçka ön kapının açılması) kuluçka sıcaklığı önlemek için j azalma minimize edilmelidir.
- Kültür 10 saat sonra, 24 saat sonra (Tablo 1) gaz karışımı akış hacmi 75 cc ve 100 cc kadar varan artış.
- Kültür ortamı, yeni bir kültür ortamı ile taze hazırlanmış şişeye kültürlü embriyo transfer ederek 24 saat etrafında değiştirilmesi gerekir. 34 saat sonra 125 cc akış hacmini artırmak ve 48 saat sonra 150 cc (Tablo 1)
- Bazen, kalp atışı hızı (yani, 120-150/min optimum) sayarak ve kan dolaşımını gözlemleyerek kültürlü embriyoların durumunu kontrol edin. Gerekirse Tyrode Kullanıcı salin embriyoların büyüme yargılamak için Somitlerin sayısını. Normal bir gelişme olarak, bir iki saat hücre gruplarının eklenir.
- WEC bittiğinde, gaz karışımı kaynağı durdurmak ve giriş borusu ve köpürme şişe giriş tüpe geri akışı önlemek için filtre membran kesmek.
7. Notlar
- WEC sistem içinde sıcaklığı sürekli 37,0-37,5 ° C tutulur
- Sıçan ve fare embriyoları WEC% 100 sıçan IC serum rutin olarak kullanılan ve kullanımdan önce -20 ° C'de muhafaza edilir.
- Biz sıçan IC serum, izofluran anestezisi sıçan toplanan satın alın.
- Tek kullanımlık şişe Ikemoto Rika da mevcuttur. Şişeler ve silikon fişler otoklava olmalıdır.
- Diseksiyon sırasında embriyoların düşük ya da yüksek ısıda muhafaza WEC sonraki gelişimini etkileyebilir, çünkü embriyo Diseksiyon RT yapılmalıdır.
- Diseksiyon için Araçlar kuru ısı ile sterilize edilir.
- Deri ve karın duvarı, mümkün olduğunca bir çanak içine kılların bulaşmayı önlemek için ayrı ayrı kesilmesi gerekir. Biz deri kestiğiniz zaman onlara yeni bir çift ile bir çift büyük makas ve forseps değiştirmek ve sırasıyla rahim izole.
- Ipuçları ince forseps kullanılması kesinlikle dokuları incelemek için çok önemlidir. Biz bir taş ve makine yağı ile elle forseps ipuçları keskinleştirmek.
- Biz embriyoların aşırı basıncı önlemek için forseps bir tarafında bir bıçak gibi kullanın.
- WEC sistemi içindeki sıcaklık, tekrar tekrar kapıyı açarak düştüğünde, ışığı açmak için sistem içinde sıcaklıkta tutmaya devam ediyor.
8. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1, rat embriyo ve kültürlü sıçan embriyolar diseksiyon prosedürleri gösterir.
Şekil 1 E12.5 rat embriyo Tüm embriyo kültürü. (A) konseptus gebe sıçan rahim disseke. (B) plasenta tarafında desidua kaldırılması. Reichert membranı (C) Kaldırma. (D) yolk kesesi açılması. (E) WEC başından sonra 6 saat süreyle şişe rat embriyo kültür. (F) sıçan 42 saat için embriyo kültür. d desidua; R Reichert Kullanıcı membran, p, plasenta, ys, yolk kesesi, e, embriyo.
| 0 saat | 12 saat | 24 saat | 36 saat | 48 saat | |
| E12.5 rat embriyo | % 95, 50 cc | 95% 75 cc (10 saat) | % 95 100 cc | % 95 125 cc (34 saat) | % 95 150 cc |
Tablo 1. Optimal oksijen durumu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemirgen WEC başarısı için iki önemli adım vardır. İlk olarak, diseksiyon prosedür değil zarar embriyolar, özellikle kan damarları doğru olmalıdır. İkincisi, oksijen ve besin artık rahim izolasyon sonra plasenta yoluyla sağlanan çünkü prosedürü mümkün olduğunca çabuk olmalıdır. Bu büyük embriyoları için kritik öneme sahiptir. E12.5 sonra sıçan WEC durumda, biz 30 dakika içinde disseke embriyoların kültürü şişeleri içine aktarmanız gerekir.
Biz, hücrelerin az sayıda floresan boya DII etiketleme veya vahşi tip ve mutant arka plan 7 sıçan embriyolarında DII-işaretli hücrelerin nakli yabani tip ve mutant Pax6 sıçan embriyolar nöral krest hücrelerinin göç yollarını analiz ettik . 24 saat 8 DII ve kültür nöroepitelyal hücrelerin etiketleme ön nöral plaka kaderi haritası fare hazırlanmıştır. WEC Pax6 mutant sıçan 9 gösterilen göç kusurları hücre özerklik incelemek için E12.5 sıçan embriyoların telencephalon GFP ifade hücrelerinin nakli için de kullanılır olmuştur. Çeşitli inhibitörleri ekseni oluşumu ve hücre döngüsü gelişimi 10, 11 sırasında yer alan sinyalizasyon yolaklar incelemek için kültür ortamına uygulanabilir. Ayrıca, biz sadece ifade plazmidler ve gen fonksiyonlarını 12,13,14 analiz elektroporasyon kültürlü embriyoların beyinleri gelişmekte içine siRNA tanıtabilirsiniz. Biz de (ref bakın. 14 ve oradaki referanslar) 14 WEC aşağıdaki organ kültür veya dilim kültür floresan protein etiketli nöroepitelyal hücrelerin davranışları araştırıldı. Bu nedenle, sadece hücre soy analiz etmek için değil, aynı zamanda genlerin fonksiyonlarının kaybı fonksiyon ve fonksiyon-kazanç deneyler nedenlerine açıklık kemirgen WEC çok yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Sayın Hajime Ichijo yararlı tavsiyelerde video kayıt ve video düzenleme için teşekkür ederim. Ayrıca video kayıt için türlü yardımcısı Drs.Yuji Tsunekawa ve Kaichi Yoshizaki teşekkür ederim. Bu çalışma Genç Bilimci B ve Japonya MEXT öncelik Alanları Moleküler Beyin Bilimi KAKENHI tarafından desteklenmektedir. Biz destek kabul Küresel COE Japon Bilim ve Teknoloji Kurumu (JST) Japon Bilim ve Teknoloji Kurumu Evrimsel Bilim ve Teknoloji Japonya MEXT Programı "Küresel Beyin Bilim Temel ve Translasyonel Araştırma Merkezi" ve Çekirdek Araştırma (CREST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M.
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K.
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
