Summary
Toda técnica de cultivo de embriones de ratón nos permite la cultura y embriones de rata
Abstract
Toda una cultura de embriones (WEC) técnica ha sido desarrollada en 1950 por nuevas y sus colegas, y se aplica para la biología del desarrollo 1. Aunque el desarrollo y el crecimiento de los embriones de mamíferos son críticamente dependientes de la función de la placenta, la técnica del CME de ratón nos permite la cultura y la condición de embriones de rata ex vivo durante períodos limitados correspondientes a las etapas mitad de la gestación durante el día embrionario (E) de 6.5 E12.5 en el ratón o E8.5-E14.5 en la rata 2, 3, 4. En WEC, podemos directamente de destino deseado áreas de embriones utilizando finos capilares de vidrio porque los embriones pueden ser manipulados bajo el microscopio. Por lo tanto, el CME de roedores es una técnica muy útil cuando queremos estudiar los procesos dinámicos de desarrollo de los embriones de mamíferos postimplanted. Hasta la fecha, varios tipos de sistemas de CME han sido desarrollados 1. Entre ellos, el sistema rotatorio botella-el tipo de cultivo es el más popular y apto para el cultivo prolongado de embriones en mitad de la gestación, es decir, después de E9.5 y E11.5 en el ratón y la rata, respectivamente 1. En este protocolo de video, demostramos nuestros procedimientos estándar de WEC ratas después de E12.5 con un modelo perfeccionado del sistema original de los rotadores, que fue diseñado por nuevos y Cockroft 5, 6, y la introducción de diversas aplicaciones de la técnica del CME para los estudios en mamíferos de desarrollo la biología.
Protocol
1. La creación del sistema WEC
- Conjunto de una membrana de 0,22 micras filtro a la entrada del tubo de silicona dentro del sistema de WEC a).
- Abra la válvula de un cilindro de gas que contiene O 2 (95%) y CO 2 (5%). El flujo de la mezcla de gas en el tambor a través de la botella de burbujas que contienen agua esterilizada.
- Ajustar el volumen del flujo de la mezcla de gas de 50 cc.
- Inserte el tubo de silicona a dejar en una botella de agua de salida y el flujo de la mezcla de gases.
- Girar el tambor a la velocidad de 20 rpm / min.
2. Preparación del medio de cultivo
- Rata descongelar inmediatamente a centrifugar (IC) de suero a 37,0 ° C b). Añadir D-glucosa (2 mg / ml) en suero descongelado en un vaso de precipitados en autoclave 100. El medio de cultivo debe estar preparado a nivel de cultivo primario (por ejemplo, usando una capucha).
- Añadir antibiótico-antimicótico (100X) que el líquido del suero, con 1: 400 dilución.
- Vaporizar isoflurano restantes (debido a la anestesia de las ratas durante la recogida de sangre) en el suero durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) c).
- Esterilizar el medio de cultivo utilizando un filtro de membrana de 0,45 micras.
- Verter 3,0 ml del medio en cada frasco de cultivo y sellar la parte superior de cada botella con un tapón de silicona, cubierta con papel de aluminio (ver ref. 14) d).
- Prepare tres o cuatro placas de Petri que contiene disposición e salina de Tyrode).
3. La anestesia de la rata y el aislamiento del útero
- Anestesiar a una rata de tiempo del embarazo profundamente con anestésicos por inhalación o por vía parenteral.
- Limpie la zona abdominal de la rata anestesiada embarazadas con etanol al 70%.
- Levante la piel con una pinza y exteriorización de la pared abdominal mediante la reducción de la piel con unas tijeras grandes f).
- Recogida de la pared abdominal con un par de pinzas y hacer en forma de U grandes incisiones longitudinales en la pared abdominal con una tijera grande hasta el nivel torácico g).
- Llevarse el intestino hacia el lado izquierdo con un par de pinzas y exponer un extremo del útero conectado al ovario.
- Levante el extremo del útero con una pinza y corta la posición entre el útero y ovario con unas tijeras de gran tamaño.
- Sacar el útero de la rata embarazada mediante la reducción de la grasa alrededor del útero hasta el otro extremo del útero.
- Transferencia al útero de una placa de Petri que contiene solución salina de Tyrode.
- La eutanasia a las ratas mediante la administración excesiva de anestésicos o la dislocación cervical después de la extirpación del útero.
4. La eliminación de los embriones en el útero
- Brevemente enjuague el útero en una solución salina de Tyrode y su transferencia a la segunda placa de Petri con un par de pinzas finas h).
- Bajo un microscopio binocular, recoger la pared del útero con una pinza fina y cortar la pared del útero en el lado opuesto a la mesometrio conexión con los vasos sanguíneos con tijeras rectas oftálmica.
- Inserte la punta de la tijera oftálmica recta en el espacio entre la pared uterina y la decidua. Cortar la pared uterina longitudinalmente a lo largo del lado antimesometrial.
- Grupo de la decidua en el lado mesometrial y conceptuses separa del útero con dos pares de pinzas finas i).
- Transferencia conceptuses a la tercera placa de Petri con una pipeta de vidrio esterilizado con un diámetro adecuado.
5. La disección de embriones de rata
- Inserte una punta de la microforceps en la decidua y hacer una incisión transversal en la decidua en todo el embrión con dos pares de pinzas.
- Inserte las puntas de la pinza en la decidua en el lado de la placenta y hacer dos incisiones longitudinales en la decidua a la cima.
- Retire la decidua placentaria en el lado de desgarramiento que con dos pares de pinzas. Retire la decidua restante con dos pares de pinzas.
- Recoger la membrana de Reichert, hacer una incisión horizontal en ella, y separado de la membrana del embrión en el lado anti-placentaria.
- Haz un pequeño agujero en el saco vitelino, cerca de la cabeza del embrión con los dos pares de pinzas y corta el saco vitelino con un par de tijeras curvas oftálmica. Es importante no dañar los vasos sanguíneos principales.
- Levante el amnios en el sitio alrededor de la cabeza del embrión con los dos pares de pinzas finas, y tire suavemente el embrión desde el saco vitelino por romper el amnios h). El cuerpo del embrión debe ser sacado de la bolsa de la yema para aumentar el suministro de oxígeno para el embrión en la etapa de gestación.
6. Cultivo de embriones todo
- Comprobar los daños en la placenta, saco vitelino, y la condición de latidos del corazón y la circulación sanguínea.
- Ser consciente de no estirar el cordón umbilical, la transferenciael embrión de un frasco de cultivo con una pipeta de vidrio esterilizado. Aporte de solución salina de Tyrode a las botellas de la cultura debe ser lo menos posible.
- Quitar un tapón de silicona no orificio del tambor rotatorio. Conectar el frasco de cultivo con un tapón con un agujero en el tambor rotatorio del sistema de WEC perpendicularmente. Tenga cuidado de no poner la fuerza en el tambor en direcciones inadecuadas desde el tambor rotatorio es un equipo muy bien. Los frascos que contienen el embrión disecados son transferidos a la cultura de uno en uno, la apertura de la puerta de la incubadora debe ser minimizado para evitar que la temperatura de la incubadora se reduce j).
- Después de 10 horas de la cultura, aumentar el volumen de flujo de la mezcla de gas de hasta 75 cc y hasta 100 cc después de 24 horas (Tabla 1).
- El medio de cultivo se debe cambiar alrededor de 24 horas mediante la transferencia de los embriones cultivados en una botella nueva cultura con el medio recién preparado. Aumentar el volumen de flujo de hasta 125 cc después de 34 horas y hasta 150 cc después de 48 horas (Tabla 1)
- De vez en cuando comprobar el estado de los embriones cultivados por contar el ritmo cardíaco (por ejemplo, 120-150/min es óptimo) y mediante la observación de la circulación sanguínea. Si es necesario contar el número de somitas para juzgar el crecimiento de los embriones en una solución salina de Tyrode. En el desarrollo normal, un somite se agrega en dos horas.
- Cuando WEC haya finalizado la alimentación de la mezcla de gas y desconecte el tubo de entrada y el filtro de membrana para evitar el reflujo en el tubo de entrada de la botella de burbujas.
7. Notas
- La temperatura dentro del sistema de WEC se mantiene constantemente en 37.0-37.5 ° C.
- 100% IC rata suero se utiliza rutinariamente en nuestra WEC de embriones de rata y ratón, y se mantiene a -20 ° C antes de su uso.
- Compramos rata IC suero, que se obtiene de las ratas que son anestesiados con isoflurano.
- Botellas desechables también están disponibles en Ikemoto Rika. Botellas y tapones de silicona debe ser esterilizados en autoclave.
- La disección de embriones debe realizarse a temperatura ambiente, porque el mantenimiento de los embriones a temperatura alta o baja durante la disección afectar el desarrollo posterior en el WEC.
- Herramientas para la disección se esterilizan con calor seco.
- La piel y la pared abdominal se debe cortar por separado para evitar la contaminación de los pelos en un plato como sea posible. Cambiamos un par de tijeras grandes y pinzas con un nuevo par de ellos cuando se corta la piel y aislar el útero, respectivamente.
- Con unas pinzas cuyas puntas están muy bien es muy importante para diseccionar los tejidos sin duda. Nos manualmente afilar las puntas de unas pinzas con una piedra y aceite de la máquina.
- Nosotros utilizamos un lado de la pinza como un cuchillo para evitar el exceso de presión a los embriones.
- Cuando la temperatura dentro del sistema de WEC disminuye al abrir la puerta varias veces, seguimos para encender la luz para mantener la temperatura dentro del sistema.
8. Los resultados representativos
La figura 1 muestra los procedimientos de la disección de los embriones de ratas y embriones de rata cultivadas.
Figura 1. Cultivo de embriones enteros del embrión de rata E12.5. (A) Un embrión disección del útero de las ratas preñadas. (B) La eliminación de la decidua en el lado de la placenta. (C) La eliminación de la membrana de Reichert. (D) La apertura del saco vitelino. (E) La rata de cultivo de embriones en la botella durante 6 horas después del comienzo de la WEC. (F) El embrión de rata en cultivo durante 42 horas. d, decidua, R, la membrana de Reichert, p, la placenta, ys, del saco vitelino; e, embrión.
| 0 horas | 12 horas | 24 horas | 36 horas | 48 horas | |
| E12.5 embrión de rata | 95% 50 cc | 95% 75 cc (10 horas) | 95% de 100 cc | 95% 125 cc (34 horas) | 95% de 150 cc |
Tabla 1. Condición óptima de oxígeno.
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Discussion
Hay dos pasos críticos en el CME de roedores para el éxito. En primer lugar, el procedimiento de disección debe ser precisa, no para los embriones de los daños, especialmente en los vasos sanguíneos. En segundo lugar, el procedimiento debe ser lo más rápido posible porque el oxígeno y los nutrientes no son suministrados a través de la placenta después del aislamiento del útero. Esto es crítico para mayores embriones. En el caso de las ratas después de WEC E12.5, debemos transferir embriones disecados en frascos de cultivo dentro de los 30 minutos.
Hemos analizado los patrones de migración de las células de la cresta neural en el tipo salvaje y Pax6 embriones de rata mutante mediante el etiquetado, un pequeño número de células fluorescentes con tinte o DII DII trasplante células marcadas en los embriones de rata de la de tipo salvaje y mutante de fondo 7. Un mapa del destino de la placa neural anterior se ha elaborado en el ratón de etiquetado células neuroepiteliales con DII y el cultivo durante 24 horas 8. WEC también se ha utilizado para el trasplante de células que expresan GFP en el telencéfalo de E12.5 embriones de rata para examinar la autonomía de células en los defectos de la migración se muestra en la rata mutante Pax6 9. Varios inhibidores se puede aplicar al medio de cultivo para examinar las vías de señalización implicadas en la formación del eje y el ciclo celular durante el desarrollo de 10, 11. Además, sólo puede introducir plásmidos de expresión y de siRNA en el desarrollo de los cerebros de embriones cultivados por electroporación para analizar las funciones de genes 12,13,14. También se investigó el comportamiento de las células neuroepiteliales marcado con proteínas fluorescentes en cultivos de órganos o la cultura rebanada siguientes WEC (ver ref. 14 y sus referencias) 14. Por lo tanto, el CME de roedores es muy útil no sólo para analizar el linaje celular, sino también para aclarar las funciones de genes por la pérdida de la función y los experimentos de ganancia de función.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Hajime Ichijo por los consejos de grabación en vídeo y útil para la edición de vídeo. También agradecemos a Drs.Yuji Tsunekawa y Yoshizaki Kaichi de tipo asistente para la grabación en vídeo. Este trabajo es apoyado por KAKENHI en B para jóvenes científicos y la ciencia del cerebro áreas prioritarias-molecular de MEXT de Japón. Queremos agradecer el apoyo de Global COE Programa "Centro de investigación básica y traslacional de la Ciencia del Cerebro Global" de MEXT de Japón y la investigación central para la Ciencia Evolutiva y de la Tecnología (CREST) de la Ciencia y la Corporación Japonesa de Ciencia Tecnología japonesa y Tecnología (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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