Summary
Técnica de cultura todo embrião de rato permite-nos cultura e embriões de ratos
Abstract
Todo embrião cultura técnica (WEC) foi desenvolvido em 1950 pela Nova e seus colegas, e aplicadas em biologia do desenvolvimento 1. Embora o desenvolvimento e crescimento de embriões de mamíferos dependem criticamente a função da placenta, WEC técnica nos permite rato cultura e embriões de ratos condição de ex vivo durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation durante o dia embrionário (E) 6,5 E12.5 na mouse ou E8.5-E14.5 no rato 2, 3, 4. No WEC, nós podemos diretamente alvo desejado áreas de embriões utilizando capilares de vidro fina porque os embriões podem ser manipulados sob o microscópio. Portanto, WEC roedores é uma técnica muito útil quando queremos estudar processos dinâmicos de desenvolvimento de embriões de mamíferos postimplanted. Até à data, vários tipos de sistemas têm sido desenvolvidos WEC 1. Entre estes, o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa é mais popular e adequada para longo prazo de cultura de embriões em midgestation, ou seja, após E9.5 e E11.5 em camundongos e ratos, respectivamente 1. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de WEC ratos após E12.5 usando um modelo refinado do sistema original rotador, que foi desenhado por New Cockroft e 5, 6, e introduzir várias aplicações da técnica do CME para estudos em desenvolvimento de mamíferos biologia.
Protocol
1. Configurando o sistema WEC
- Conjunta de uma membrana M 0,22 filtro para o tubo de silicone de entrada no sistema um WEC).
- Abrir a válvula de um cilindro de gás contendo O 2 (95%) e CO 2 (5%). Fluxo da mistura de gases no cilindro através da garrafa borbulhando contendo água esterilizada.
- Ajustar o volume do fluxo de mistura gasosa a 50 cc.
- Insira o tubo de silicone para deixar em uma garrafa de água e verificar o fluxo de mistura gasosa.
- Girar o tambor com a velocidade de 20 rpm / min.
2. Preparação de meio de cultura
- Rat-degelo imediatamente centrifugado (IC) de soro em 37,0 ° C b). Adicionar D-glicose (2 mg / ml) em soro descongeladas em um copo ml autoclavado 100. Meio de cultura deve ser preparado no nível de cultura primária (por exemplo, usando um capuz).
- Adicionar antibióticos antimicótico líquido (100x) para o soro com 1: 400 de diluição.
- Vaporize isoflurano restantes (devido à anestesia de ratos durante a coleta de sangue) do soro por 20 minutos em temperatura ambiente (RT) c).
- Esterilizar o meio de cultura usando um filtro de membrana 0,45 mM.
- Despeje 3,0 ml do meio em cada frasco de cultura e selar a parte superior de cada frasco com uma ficha de silício, coberta com folha de alumínio (ver ref. 14) d).
- Prepare três ou quatro pratos disposição de Petri contendo solução salina e de Tyrode).
3. Anestesia do rato e do isolamento do útero
- Anestesiar um rato timed-grávidas profundamente com anestésicos inalatórios ou parenteral.
- Limpar a área abdominal do rato anestesiado grávida de etanol 70%.
- Pick up a pele com uma pinça e exteriorizar a parede abdominal, cortando a pele com uma tesoura grande f).
- Pick up da parede abdominal com um par de fórceps e fazer em forma de U grandes incisões longitudinal na parede abdominal com uma tesoura grande até o nível torácico g).
- Arribar do intestino para o lado esquerdo com um par de fórceps e expor uma extremidade do útero ligado ao ovário.
- Pegue o final do útero com uma pinça e corte a posição entre o útero e ovário com uma tesoura grande.
- Tirar o útero de ratos fêmeas grávidas, cortando a gordura ao redor do útero até a outra extremidade do útero.
- Transferência do útero para uma placa de Petri contendo solução salina de Tyrode.
- Euthanize o rato por excesso de administração de anestésicos ou deslocamento cervical após a remoção do útero.
4. Remoção dos embriões do útero
- Brevemente lavar o útero em solução salina Tyrode e transferi-lo para a segunda placa de Petri com um par de pinças finas h).
- Sob um microscópio binocular, pegar a parede uterina com um par de pinças finas e cortar a parede uterina no lado oposto ao mesométrio conectar-se com os vasos sanguíneos usando uma tesoura oftálmica em linha reta.
- Insira a ponta de uma tesoura oftálmica em linha reta no espaço entre a parede uterina e decídua. Cortar a parede uterina longitudinalmente ao longo do lado antimesometrial.
- Moita a decidua no lado mesometrial e conceptos separado do útero através de dois pares de pinças finas i).
- Transferência de conceptos à placa de Petri terceiro com uma pipeta de vidro esterilizados, com um diâmetro adequado.
5. Dissecação de embriões de ratos
- Inserir uma ponta do micropinças na decídua e fazer uma incisão transversal na decídua em torno do concepto com dois pares de fórceps.
- Inserir as pontas dos pinça na decídua no lado placentário e fazer duas incisões longitudinais na decídua até o topo.
- Remova a decídua no lado placentário rasgando que com dois pares de fórceps. Remover o decidua restantes com dois pares de fórceps.
- Pick up membrana de Reichert, faça uma incisão horizontal sobre o mesmo, e separar a membrana do concepto no lado anti-placentária.
- Faça um pequeno furo no saco vitelino perto da cabeça do embrião com os dois pares de fórceps, e cortar o saco vitelino com uma tesoura oftálmica curvas. É importante para não danificar os vasos sanguíneos.
- Pegue o âmnio no local em torno da cabeça do embrião com os dois pares de pinças finas, e retire com cuidado o embrião a partir do saco vitelino, rasgando o âmnio h). O corpo do embrião deve ser puxado para fora do saco vitelino para aumentar a oferta de oxigênio para o embrião no estágio midgestation.
6. Cultura de embriões todo
- Verificar danos na placenta, saco vitelino, e da condição do coração batendo e circulação sanguínea.
- Estar ciente de não esticar o cordão umbilical, a transferênciao embrião de um frasco de cultura com uma pipeta de vidro esterilizado. Reporte de solução salina Tyrode para garrafas de cultura deve ser o mínimo possível.
- Remover um plug de silicone não-buraco do tambor rotador. Conectar o frasco de cultura com uma ficha com um buraco no tambor rotator do sistema WEC perpendicularmente. Tenha cuidado para não colocar força no tambor em direções inadequadas desde o drum rotador é um equipamento muito bem. Os frascos contendo o embrião dissecados são transferidos para a cultura, um por um; abertura da porta da frente da incubadora devem ser minimizados para evitar que a temperatura da incubadora é diminuída j).
- Após 10 h de cultura, aumentar o volume de fluxo da mistura de gás de até 75 cc e até 100 cc após 24 h (Tabela 1).
- O meio de cultura deve ser mudado em torno de 24 horas através da transferência dos embriões cultivados em uma garrafa nova cultura com o meio recém preparado. Aumentar o volume de fluxo de até 125 cc, depois de 34 horas e até 150 cc após 48 h (Tabela 1)
- Ocasionalmente verificar a condição dos embriões cultivados contando taxa de batimentos cardíacos (ie, 120-150/min é ótima) e observando a circulação sanguínea. Se necessário contar o número de somitos para julgar o crescimento de embriões em solução salina de Tyrode. No desenvolvimento normal, um somito é adicionado em duas horas.
- WEC quando estiver terminada, pare de alimentação de mistura de gás e desconectar o tubo de entrada eo filtro de membrana para evitar o refluxo para dentro do tubo de entrada da garrafa borbulhando.
7. Notas
- A temperatura dentro do sistema WEC é constantemente mantido a 37,0-37,5 ° C.
- 100% rat IC soro é utilizado rotineiramente em nosso WEC de embriões de rato e do rato, e mantidos a -20 ° C antes do uso.
- Nós compramos rato IC soro, que é coletado de ratos que estão anestesiados com isoflurano.
- Garrafas descartáveis também estão disponíveis a partir de Ikemoto Rika. Garrafas e plugs de silicone devem ser autoclavados.
- Dissecação de embriões devem ser realizados à temperatura ambiente porque a manutenção de embriões em temperatura baixa ou alta durante a dissecção afetam o desenvolvimento posterior no WEC.
- Ferramentas para dissecção são esterilizados por calor seco.
- A pele e parede abdominal devem ser cortados separadamente para evitar a contaminação dos cabelos em um prato possível. Mudamos um par de tesouras e pinças grandes com um novo par deles quando cortamos a pele e isolar o útero, respectivamente.
- Utilizando uma pinça, cujas pontas são muito bem é muito importante para dissecar tecidos com certeza. Nós manualmente afiar as pontas de uma pinça com uma pedra e óleo de máquina.
- Usamos um lado da pinça como uma faca para evitar excesso de pressão de embriões.
- Quando a temperatura dentro do sistema WEC diminui, abrindo a porta repetidamente, continuamos a acender a luz para manter a temperatura dentro do sistema.
8. Resultados representativos
A Figura 1 mostra os procedimentos de dissecação do embrião de rato e embriões de ratos cultivadas.
Figura 1. Cultura de embriões Whole do embrião de rato E12.5. (A) A concepto dissecados do útero de ratos fêmeas grávidas. (B) Remoção da decídua no lado placenta. (C) remoção da membrana de Reichert. (D) Abertura do saco vitelino. (E) O cultivo de embriões de rato na garrafa durante 6 horas após o início do WEC. (F) O embrião de rato cultivadas por 42 hr. d, decidua; R; membrana de Reichert; p, placenta; ys, saco vitelino, e, embrião.
| 0 hr | 12 hr | 24 hr | 36 hr | 48 horas | |
| E12.5 embrião de rato | 95% 50 cc | 95% 75 cc (10 h) | 95% 100 cc | 95% 125 cc (34 hr) | 95% a 150 cc |
Tabela 1. Condições de oxigênio Optimal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Existem dois passos críticos no WEC roedores para o sucesso. Primeiro, o procedimento de dissecção deve ser preciso para não danificar embriões, especialmente os vasos sanguíneos. Segundo, o procedimento deve ser o mais rápido possível, porque o oxigênio e nutrientes não são mais fornecidos através da placenta após o isolamento do útero. Isto é crítico para os embriões mais velhos. No caso do WEC de ratos após E12.5, devemos transferir embriões dissecado em garrafas de cultura em 30 minutos.
Analisamos os padrões de migração das células da crista neural no tipo selvagem e Pax6 embriões de ratos mutantes, rotulando um pequeno número de células com corante fluorescente DII ou transplante DII marcado com células em embriões de ratos do tipo selvagem e mutante de fundo 7. Um mapa de destino da placa neural anterior foi elaborado no rato da rotulagem células neuroepiteliais com DII e cultura por 24 hr 8. WEC também tem sido utilizada para o transplante de células expressando GFP no telencéfalo de embriões de ratos E12.5 autonomia para examinar células em defeitos de migração mostrado no rato mutante Pax6 9. Vários inibidores podem ser aplicados ao meio de cultura para examinar as vias de sinalização envolvidos na formação do eixo e do ciclo celular durante o desenvolvimento 10, 11. Além disso, podemos simplesmente introduzir plasmídeos expressão e de siRNA para desenvolver cérebros de embriões cultivados por eletroporação para analisar as funções dos genes 12,13,14. Também investigamos o comportamento das células neuroepiteliais rotulados com proteína fluorescente em cultura de órgão ou cultura fatia seguintes WEC (ver ref. 14 e referências citadas) 14. Portanto, WEC roedores é muito útil não só para analisar a linhagem de células, mas também para elucidar as funções dos genes por perda de função e de ganho de função-experimentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nós agradecemos o Sr. Hajime Ichijo conselhos para a gravação de vídeo e útil para editar o vídeo. Agradecemos também Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki para assistente de tipo para gravação de vídeo. Este trabalho é apoiado por KAKENHI em B Jovem Cientista ea prioridade Ciência Cérebro Áreas-Molecular de MEXT do Japão. Agradecemos o apoio da Global COE Programa "Centro de Investigação Básica e translacional para a Ciência do Cérebro Global" a partir MEXT do Japão e de Pesquisa Núcleo de Ciência e Tecnologia Evolutiva (CREST) de Ciência japonês e Corporação de Tecnologia de Ciência do Japão e Agência de Tecnologia (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M.
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K.
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
