全胚培養法は、培養マウスやラットの胚に連絡することができます生体外で条件。このビデオプロトコルでは、ローテータ型ボトルの培養系を用いて12.5日後にラットの全胚培養の私達の標準的な手順を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
全胚培養（WEC）技術は、新しいと彼の同僚によって1950年代に開発され、発生生物学1に適用されている。開発と哺乳類の胚の成長は、胎盤の機能に深く依存しているが、WECの技術は、胚の日中の妊娠中期の段階に対応する限られた期間の培養マウスやラットの胚ex vivoでの条件（E）が6.5 - E12.5に連絡することができますマウスまたはラット2、3、4のE8.5 - E14.5。胚を顕微鏡下で操作できるので、WECでは、我々が直接微細なガラスキャピラリーを用いた胚の所望の領域をターゲットにすることができます。我々はpostimplanted哺乳類胚のダイナミックな発生過程を研究する場合したがって、齧歯類のWECは、非常に有用な技術である。最新の、WECシステムのいくつかのタイプは、1が開発されている。これらのうち、ローテーター型ボトル培養系は、それぞれ1マウス及びラットにおけるE9.5およびE11.5、後に、最も人気があり、妊娠中期、すなわちにおける胚の長期培養に適しています。このビデオプロトコルでは、我々は、新規およびコックロフト5で設計されたオリジナルのローテータのシステム、洗練されたモデルを使用して12.5日後に6をラットのWECの私達の標準的な手順を示し、そして哺乳類の発達の研究にWECの技術の様々なアプリケーションを紹介生物学。
プロトコル
1。 WECシステムのセットアップ
- ）WECシステム内の入口シリコンチューブ〜0.22μmのメンブランフィルタージョイント。
- O 2（95％）とCO 2（5％）を含むガスのボンベの バルブを開きます。オートクレーブ水を含む、バブルボトルを経由してドラム内に混合ガスを流し込む。
- 50ccのために混合ガスの流量を調整します。
- 外は水のボトルにシリコンチューブを聞かせて混合ガスの流れをチェックアウト挿入。
- 20回転/分の速度でドラムを回転させる。
2。培地の調製
- 融解ラット直ちに遠心分離（IC）血清37.0℃においてB）。オートクレーブした100mlのビーカーに解凍した血清中にD -グルコース（2 mg / mL）を追加します。培地は初代培養のレベル（例えば、フードを使用して）で準備する必要があります。
- 400希釈：1の血清に抗生物質 - 抗真菌剤（100倍）液体を追加。
- 室温で20分間血清（RT）c）から（採血時のラットの麻酔に起因する）、残りのイソフルランを気化。
- 0.45μmのメンブランフィルターを用いて培養液を滅菌する。
- 各培養瓶の培地3.0 mlを注ぐとシ....
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ディスカッション
成功のための齧歯類のWECの2つの重要なステップがあります。最初に、解剖の手順は、しないように、特に被害の胚、血管に正確でなければなりません。酸素と栄養がもはや子宮からの分離後の胎盤を介して供給されていないので、第二、手続きはできるだけ早くする必要があります。これは古い胚にとって非常に重要です。 E12.5後のラットのWECのケースでは、我々は30分以内に培養ボトルに切除した胚を転送する必要があります。
我々は、蛍光色素のDIIと細胞の小さな数字をラベルまたは野生型と変異体背景7のラット胚におけるDII -標識細胞を移植することにより、野生型およびPax6変異ラット胚の神経堤細胞の移動パターンを分析した。前方神経板の運命のマップは24時間8 DIIと培養した神経上皮細胞のラベリングからマウスで描かれています。 WECは、Pax6変異ラット9に示すように、移行の不具合で、細胞の自律性を調べるためにE12.5ラット胚の終脳にGFPを発現する細胞の移植にも使用されています。様々な阻害剤が.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は、ビデオを編集するためのビデオ録画および有用な助言のために氏肇輝に感謝。我々はまた、ビデオ録画のための親切なアシスタントのためDrs.Yuji恒川とカイチ吉崎に感謝。この作業は若手Bで、日本の文部科学省から重点領域 - 分子脳科学に関する科研費でサポートされています。我々は日本の文部科学省と日本の科学技術振興機構（JST）から日本の科学とテクノロジー社から戦略的創造科学技術（CREST）のためのコアの研究から、グローバルCOEプログラム"グローバル脳科学のための基本とトランスレーショナルリサーチセンター"のサポートを認める。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| の名前 | タイプ | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| WECの設定 | ||||
| WECシステム（10〜0310） | ツール | 池本リカ | 010-0310 | 別のスモールモデルも用意されています。 |
| 穴のないシリコンプラグ | ツール | 池本リカ | 010-032-08 | |
| 混合ガスのシリンダー | ツール | 日光山荘 | - | 酸素95％と5％の二酸化炭素を含む。カスタムオーダー。 |
| ガスレギュレータ | ツール | 小野製作所 | WR - 11 | |
| 0.22μmのフィルターマイレクスGS | ツール | ミリポア | SLGS033SS | |
| 麻酔と子宮の分離 | ||||
| 大きなはさみ | ツール | Napox | B - 7H | |
| 鉗子 | ツール | Napox | - 3 - 2 | |
| 廃棄ペトリ皿 （90ミリメートル× 15ミリメートル） | ツール | いわき市 | SH90 - 15 | 深型シャーレは、解剖に最適です。 |
| イソフルレン | 試薬 | アボット | B506 | 麻酔のための |
| ペントバルビタールナトリウム | 試薬 | シェリングプラウアニマルヘルス | - | 麻酔のための |
| タイロードの生理食塩水 | 試薬 | - | - | 文献[プロトコルとしてよると。 2。 4℃で保存℃、 |
| 時限妊娠Sprague - Dawleyラット | 動物 | チャールズ川ラボラトリーズジャパン | - | |
| 培地の調製 | ||||
| 文化ガラス瓶 | ツール | 池本リカ | 010-032-05 | |
| 処分の培養瓶 | ツール | 池本リカ | 010-032-06 | |
| 穴付きシリコン栓 | ツール | 池本リカ | 010-032-07 | |
| アルミ箔 | ツール | どのような企業 | - | |
| オートクレーブ袋 | ツール | カル | HM - 26 | 培養ボトル用 |
| オートクレーブ袋 | ツール | カル | HM - 14A | シリコンプラグ用 |
| 0.45μmのフィルターマイレクスHA | ツール | ミリポア | SLHA033SS | |
| 50 mlコニカルチューブ | ツール | ベクトンディッキンソン | 352070 | |
| 100mlのビーカー | ツール | いわき市 | TE - 32 | |
| ラットIC血清 | 試薬 | チャールズ川ラボラトリーズジャパン | - | 、氏邦彦森崎：を参照してください。 TEL：+81-（0）45-474-9336、FAX：+81-（0）45-474-9340 |
| D（+） - グルコース | 試薬 | 和光 | 041から00595 | |
| 抗生物質antimyotic液体 | 試薬 | ギブコ | 15240 | |
| 胚の解剖 | ||||
| 眼科ストレートはさみ | ツール | Napox | MB50 - 7 | 子宮壁を切断するための |
| 眼科曲がったはさみ | ツール | Napox | MB54 - 2 | 卵黄嚢を切断するための |
| 鉗子＃5 | ツール | 活力 | T6715 | |
| 鉗子＃5F | ツール | レギ | T6819 | |
| ガラスピペット | ツール | - | - | パスツールピペットを用いて手で作ら。 |
| オートクレーブ袋 | ツール | カル | HM - 4 | ガラスピペットを用 |
| 双眼顕微鏡 | ツール | ライカ | Mz7s | |
| 軽 | ツール | ライカ | CLS 150XD | |
| 石油石 | ツール | 内田洋行 | 833-2000 | 鉗子のシャープニング用 |
| マシン油 | ツール | 内田洋行 | 835-0000 | 鉗子のシャープニング用 |
参考文献
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplanta....
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再版と許可
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