Summary
وأعدت خلايا جذعية عصبية من الحصين غير أخلاقي السبات رضيع أبن سنة السناجب البرية في القطب الشمالي (AGS). ويمكن توسيع هذه الخلايا الجذعية العصبية من خلال ممرات عديدة ، متباينة ، والحفاظ على الخلايا العصبيه 50:50 تقريبا لثقافة الدبقية.
Abstract
السناجب البرية في القطب الشمالي (Urocitellus parryii ، AGS) هي فريدة من نوعها في قدرتها على السبات مع درجة حرارة الجسم الأساسية القريب أو ما دون درجة التجمد 1. هذه الحيوانات كما تقاوم الإصابة الدماغية الى الدماغ في الجسم الحي و2،3 الأوكسجين الجلوكوز الحرمان 4،5 في المختبر. وفرت هذه الصفات الفريدة دافعا لعزل الخلايا العصبية لدراسة خصائص AGS العصبية الكامنة التي يمكن أن تشكل قدرة على مقاومة الخلايا العصبية AGS الإصابات والوفيات الناجمة عن نقص التروية الخلية ودرجات حرارة شديدة البرودة. ويمكن التعرف على البروتينات أو أهداف الجينات التي تسمح للخصائص المميزة لهذه الخلايا تساعد في اكتشاف علاجات فعالة لعدد من المؤشرات ونقص تروية لدراسة التسامح الباردة. الكبار AGS الحصين يحتوي على خلايا الجذعية العصبية التي لا تزال تتكاثر ، مما يسمح للتوسع سهل من هذه الخلايا الجذعية في الثقافة. نحن هنا وصف الأساليب التي يمكن للباحثين الاستفادة من هذه الخلايا الجذعية العصبية ومتمايزة عن أي عدد من الأغراض. ويمكن باتباع هذه الخطوات بشكل وثيق يمكن توسيع الخلايا الجذعية العصبية AGS من خلال اثنين من الممرات أو أكثر ومن ثم كانت متباينة إلى ثقافة عالية في TUJ1 إيجابية الخلايا العصبية (~ 50 ٪) دون اللجوء إلى استخدام المواد الكيميائية السامة إلى تقليل عدد الخلايا المنقسمة. الإسكيمية يدفع الخلايا العصبية (6) وتكوين الخلايا العصبية التي العائدات عبر مجاهدي خلق / إرك ومسارات بقاء PI3K/Akt يشير يساهم في مقاومة نقص التروية في الجسم الحي في المختبر 7 و 8 (كيليهر اندرسون ، ودرو وآخرون ، قيد الإعداد). ويمكن توصيف هذه الخلايا مزيد من العصبية فريدة من نوعها تقدم على جبهات عديدة ، وذلك باستخدام بعض أو كل من هذه الأساليب.
Protocol
1. AGS الخلية الجذعية العصبية ، وإعداد وسائل الإعلام
- ويمكن الآن للبالغين الارض في القطب الشمالي الحصين السنجاب (AGS) عزل الخلايا الجذعية العصبية بطريقة الموصوفة سابقا يمكن الحصول على 9 تجاريا باسم قارورة cryopreserved. يتم شحنها بين عشية وضحاها في الخلايا التي تحتوي على مجموعات معزولة الثلج الجاف للتأكد من أن الخلايا تبقى في حالة cryopreserved. للحفاظ على سلامتها ، فك الخلايا فور استلامها وتخزينها في أقل من -150 درجة مئوية ، أو في مرحلة البخار من ديوار النيتروجين السائل.
- إعداد بصل متوسطة agsNSC بإضافة 5 مل FBS (LS - 1012) إلى 95 مل بصل متوسطة agsNSC FBS + 5 ٪
- إعداد agsNSC متوسطة التوسع من خلال إضافة 500 B - 27 ميكرولتر الملحق (Invitrogen) إلى 50 مل بصل متوسطة agsNSC. تقسيم ما تبقى من B27 إلى 1mL aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- دافئ 25 مل من بصل متوسطة agsNSC FBS + 5 ٪ و 20 مل من متوسطة agsNSC التوسع في حمام المياه 37 درجة مئوية.
- معطف القوارير المستخدمة للتوسع مع بولي - L - الأورنيثين
- أذاب الحل بولي - L - الأورنيثين (10 ميكروغرام / مل) العمل. تخزين حل بين 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد إذابة مرة واحدة.
- إضافة 8 حل بولي - L - الأورنيثين مل العمل إلى واحد قارورة T - 75 وتوزيعها بالتساوي تنفيس الحل على سطح الثقافة كامل من القارورة. (ضبط كمية من محلول العمل من أجل ثقافة السفن الأخرى التي يمكن أن تستخدم استخدام 0.5 -- 1.0 مل بولي - L - الأورنيثين حل العاملة بنسبة 10 سم السطح ثقافة 2)
- احتضان القوارير في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. (يفضل استخدام حاضنة دون CO 2 المضافة للاحتضان من بولي - L - الأورنيثين السفن الثقافة المغلفة.) يمكن تخزين قوارير المغلفة لمدة تصل إلى أسبوعين في الحاضنة.
- قبل الاستخدام ، نضح بولي - L - حل الأورنيثين العمل من القارورة ويغسل مرتين مع الماء المعقم نسيج ثقافة الصف. نضح السوائل حتى قارورة جافة تقريبا قبل الاستخدام.
- إزالة قارورة من ديوار والتأكد من أن مختومة بإحكام غطاء القارورة. الاستمرار على رأس القنينة ترك النصف السفلي من القارورة في حمام مائي 37 ° مئوية لمدة حوالي 60-90 ثانية أو حتى يتم بالكامل تقريبا إذابة قارورة ؛ كمية صغيرة من الجليد لا يزال ينبغي أن يكون مرئيا. لتجنب التلوث المحتملة ، والحفاظ على غطاء قنينة من الماء. لا أكثر من ذوبان الجليد ، والقيام بما قد يؤدي إلى تلف الخلايا.
- الرذاذ الخارج من القارورة مع الايثانول 70 ٪ أو الأيزوبروبانول ، ثم ضع القارورة في خزانة السلامة البيولوجية. إزالة الغطاء بعناية لتجنب التلوث أو بقع.
- بلطف اعادة تعليق الخلايا في قارورة وذلك بإضافة 1 مل من وسائل الاعلام agsNSC بصل + 5 ٪ FBS باستخدام ماصة معقمة. نقل الخلايا إعادة علقت الى 25 مل من بصل متوسطة الدافئة agsNSC مل في أنبوب الطرد المركزي 50 5 ٪ FBS +.
- شطف البرد القارورة مرة واحدة مع وقف الخلية المخففة. الطرد المركزي الخلايا عند 150 x ج لمدة 6 دقائق. للحصول على أفضل النتائج ، وحساب سرعة أجهزة الطرد المركزي لكل نوع على حدة.
- في حين أن الخلايا هي الغزل إلى أسفل ، إضافة 10 مل من متوسطة التوسع agsNSC إلى T - 75 - L - بولي الأورنيثين الجافة المغلفة القارورة وإضافة 40 ميكرولتر من FGF - RH الأساسية (40ng/mL). بعد الطرد المركزي ، ونضح السوائل طاف مع الحرص على عدم نضح الكرية. اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من التوسع agsNSC متوسطة. نقل الخلايا إعادة معلقة في متوسطة agsNSC التوسع في وسائل الإعلام في القارورة T - 75.
- صخرة بلطف سفينة الثقافة جنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي الخلايا داخل السفينة.
- سفينة الثقافة مكان المصنفة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة. وينبغي أن نعلق على الخلايا القارورة والبدء في تشكيل العمليات في غضون ساعتين من البذر. إذا كانت الخلايا لا تزال عائمة وتكور في غضون المتوسط ، ثم الخلايا في جهاز الطرد المركزي FBS 5 ٪ وتشغيل الخطوات 1،8-1،10 الطازجة والمتوسطة مع القارورة.
2. توسيع AgsNSC
- يومين (~ 48 ساعة) بعد ذوبان الجليد وبذر الخلايا ، ينبغي إجراء الاستبدال الكامل المتوسطة باستخدام 20 مل من التوسع agsNSC متوسطة بالاضافة الى ارتفاع 40 ميكرولتر من FGF - RH الأساسية.
- قوارير ارتفاع بنسبة 40 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل RH - الأساسية في اليوم التالي التلقيح. سوف تكون على استعداد لخلايا يعرض للتريبسين عندما وصلت إلى نقطة التقاء 75-80 ٪ في اليوم الثالث أو الرابع بعد التلقيح. لا ينصح زراعة الخلايا الجذعية غير المتمايزة لمدة أطول من 4 أيام بعد التلقيح بسبب حضانة أطول سيسمح الخلايا للبدء في التفريق إلى الخلايا العصبية والخلايا العصبية قد يكون أصيب trypsinization خلال الخطوة 3. ويمكن تخزين FGF - RH الأساسية في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد لا تزال تحافظ على النشاط. يمكن للجمعية جيل المستقبل RH - الأساسية يذهب ايضا من خلال واحدة إضافية تجميد / الذوبان عند درجة حرارة -20 درجة مئوية اذا كانت هناك حاجة الى مزيد من الوقت.
3. Trypsinization من الخلايا
- وينبغي passaged agsNSC 3 إلى 4 أيام بعد التلقيح. إعداد قارورة بولي - L - الأورنيثين المغلفة بين 24 ساعة وأسبوع واحد قبل الركض إذا كان سيتم توسيع agsNSC مرة أخرى.
- ونضحمتوسطة من سفينة الثقافة. إضافة 2.5 مل من 0.05 ٪ Trypsin/0.02 ٪ EDTA (CM - 0017) إلى وعاء لكل 75 سم 2 من مساحة السطح. والمغلفة دوامة بلطف لضمان أن جميع الخلايا مع التربسين / EDTA. تبدأ الخلايا عادة إلى فصل من السطح في غضون 60 ثانية ، اعتمادا على التقاء الخلايا. لا يعرض للتريبسين أكثر ، هذا فضلا عن القيام بذلك إلى تلف الخلايا. سوف التنصت بلطف سفينة الثقافة من الجانبين عدة تشجع انفصال.
- مرة واحدة تصبح فصل الخلايا ، إضافة 10 مل من بصل متوسطة agsNSC إلى القارورة 5 ٪ FBS +. بلطف هو تحييد دوامة لضمان حل كافة التربسين. باستخدام التقنيات المخبرية العقيم ، ماصة للخلايا في أنبوب الطرد المركزي معقمة تحتوي على 10 مل من agsNSC بصل متوسطة +5 ٪ FBS. تكرار الغسيل بواسطة القارورة مرة أخرى مع 10 مليلتر إضافية متوسطة بصل + 5 ٪ agsNSC FBS ويتحد مع غسل الأولى.
- خلايا جهاز الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 6 دقائق كما هو موضح أعلاه. بعد الطرد المركزي ، ينبغي أن تشكل خلايا بيليه نظيفة فضفاضة. نضح التربسين تحييد والمتوسطة من أنبوب الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل (T - 75 في قارورة) من قبل حرارة متوسطة بصل + 5 ٪ agsNSC FBS بواسطة pipetting بلطف صعودا وأسفل مع 2X ماصة 10 مل. تنفيذ عدد الخلايا كما هو موضح أدناه.
4. القياسية لحساب التصفيحات من الخلايا
- باستخدام تقنية العقيم ، وقف دوامة الخلية ونقل 15 ميكرولتر من تعليق لخلية أنبوب microcentrifuge. إضافة 15 ميكرولتر من التريبان الأزرق 0.4 ٪. المزيج بلطف وتحميل 10 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل دائرة من الدوائر لعدادة الكريات النظيفة مثل خط برايت العد غرفة (كتالوج # 1490 : Hausser العلمية و http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
- عدد لا يقل عن 4 الأرباع على عدادة الكريات. الخلايا الزرقاء التي هي ايجابية للأزرق التريبان لقوا حتفهم ، وينبغي أن لا تحسب. لتعداد خلايا دقيقة ، وينبغي أن العدد الأمثل من الخلايا في الربع 25-75 تكون الخلايا.
- بعد عد الخلايا ، وحساب متوسط الأرباع 4. مضاعفة متوسط عدد الخلايا التي كتبها 10000 عامل والتخفيف (2 في حالة استخدام وحدات التخزين الموصى بها) لتحديد عدد الخلايا في مليلتر. ملاحظة أنه إذا كان مجموع بقاء نسبة أقل من 92 ٪ قد يكون هناك عدد من الأسباب. قد يكون أحد أسباب انخفاض يكون أكثر جدوى trypsinization ، قبل التربسين التعادل مع FBS. قد يكون سبب آخر أن تركيز مصل الدم (FBS) لالتربسين منخفض جدا وهذه الخلايا لا تزال trypsinized. وثالثا ، قد تكون خلايا متكدسة جدا ، مما تسبب في الخلايا الجذعية للتمييز بسبب خلية خلية الاتصال ، مما أدى إلى إصابة أثناء trypsinization. ربما اذا تم اتباع هذا الأسلوب بشكل وثيق من المتوقع تحقيق عائد من 3 أو أكثر من الأضعاف ، وإعطاء السكان من الخلايا 4000000> من العدد الأولي لل~ 500000.
5. تلقيح آخر قارورة التوسع
- لتحديد عدد الخلايا اللازمة لتطعيم سفينة واحدة ، ومضاعفة كثافة بذر المطلوب (6600 الخلايا لكل سم 2 أو 500،000 الخلايا T - 75 في قارورة) من مساحة السطح (في سم 2) من السفينة إلى أن تلقيح. إذا بتلقيح أكثر من سفينة واحدة مضاعفة عدد الخلايا لكل سفينة من العدد الإجمالي للسفن. لتحديد الحجم (مل) من التعليق الخلية اللازمة لتطعيم كل سفينة ، وتقسيم عدد من الخلايا اللازمة لتطعيم سفينة واحدة من قبل عدد من خلايا قابلة للحياة / مل في التعليق الخلية. إذا بتلقيح أكثر من سفينة واحدة لحساب الحجم الكلي للتعليق الخلية التي يحتاجها مضاعفة حجم اللازمة للسفينة واحدة من العدد الإجمالي للسفن أن يكون تلقيح.
- أجهزة الطرد المركزي لحجم المطلوب من الخلايا في متوسطة بصل + 5 ٪ agsNSC FBS ، وترك بيليه فضفاضة. عادة يتم إحضارها 500000 الخلايا إلى وحدة تخزين ما مجموعه 25 مل في متوسطة بصل agsNSC FBS +5 ٪ كما هو موضح سابقا. نضح السائلة وإعادة تعليق فضفاضة بيليه في 10 مل من متوسطة التوسع agsNSC هذا هو المطلوب خطوة إضافية لإزالة الطرد المركزي FBS قبل التلقيح. إضافة 10 مل من قبل حرارة متوسطة لتوسيع agsNSC القارورة T - 75. إضافة 10 مل من تعليق معلق الخلية إلى القارورة T - 75 ثم إضافة 40 ميكرولتر من FGF - RH الأساسية للالقارورة. أعتبر أن trypsinization وينبغي أن تأخذ التطعيم لم يعد من 1.5 ساعة عند تحديد الحد الأقصى لعدد القوارير للعمل مع في أي وقت واحد. وينبغي للمرء أن يكون أيضا وسائل الإعلام وسائل الإعلام بما يكفي لإجراء تغييرات كاملة في حالة استخدام قوارير عديدة.
- صخرة القارورة بلطف من جانب إلى آخر لتوزيع بالتساوي الخلايا ومكان السفن الثقافة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة ، كما هو موضح سابقا.
6. التخفيف من الخلايا لتلقيح لوحات حسنا عن التمايز
- يمكن استخدام أي تنسيق متعددة أيضا ، ولكن التلقيح في Biocoat دينار بحريني بولي - L - 96 ليسين لوحات مغلفة جيدا هو قصرcribed هنا. تحديد حجم الخلايا اللازمة لوقف التجربة الخاصة بك عن طريق ضرب عدد من الآبار لتلقيح بنسبة 0.2 مل لكل بئر لوحة متعددة كذلك 96 و تضيف نحو 10 ٪ لتغطية أي خسائر في الحجم خلال التلقيح. حساب لتخفيف كثافة خلية من خلايا 75000 / مل. تحديد مقدار FBS التي يمكن ان تضاف الى متوسطة التمايز لتحقيق تركيز النهائي من FBS 2 ٪ (الجدول 1). مزيج FBS ومتوسطة التمايز. مزيج دقيق لحجم الخلايا مع المحسوب متوسطة التمايز مع FBS. (ملاحظة : أثناء الطرد المركزي في الخلايا متوسطة بصل agsNSC + 5 ٪ بينما FBS FBS يحمي الخلايا خلال الطرد المركزي ويسهل التصاق الخلية FBS يمنع differention تمييع FBS إلى 2 ٪ سيسمح للالتصاق الخلايا على السطح متعدد جيدا... ثم يتم تخفيف FBS 2 ٪ إضافية لتعزيز التمايز. الانسولين ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS الإلكتروني) تم تضمينه أيضا في متوسطة التمايز لتعزيز التمايز.
- في خزانة السلامة الأحيائية ، والاستغناء عن 200 UL التعليق الخلية المخففة من خزان combitip العقيمة إلى كل بئر من لوحة مغلفة بولي - L - 96 - يسين جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات ونصائح فوهة كبيرة. لوحات لاحتضان 1،5-2 ساعة على 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. بعد أن تعلق في الخلايا ، وبعد دقائق 90-120 حول إزالة بعناية 50 ٪ (100 ميكرولتر ل96 - جيدا لوحات) من المتوسط من كل جانب كبير باستخدام ماصة نصائح فوهة. استبدال الدقيق لحجم دافئ مع إزالة متوسطة التمايز agsNSC ، مرة أخرى باستخدام فتحة كبيرة نصائح ماصة. (استخدام نصائح فوهة القياسية قد تصيب الخلايا).
- بعد يومين من التلقيح (~ 48 ساعة) ، إجراء تغيير المتوسطة 50 ٪ باستخدام agsNSC متوسطة وكبيرة التمايز نصائح ماصة الفوهة.
7. صيانة الخلايا العصبية
- إعداد متعلق بالخلايا العصبية متوسطة الصيانة باستخدام NeuraLife ، والجلوتامين B27 وفقا للتعليمات. وينبغي إعداد العصبية متوسطة الصيانة الأسبوعية.
- بعد يومين من مشاركة agsNSC تغيير متوسطة التمايز ، عادة يوم آخر تلقيح 4 ، إجراء استبدال المتوسطة 50 ٪ باستخدام متعلق بالخلايا العصبية متوسطة الصيانة.
- الاستمرار في تنفيذ بدائل المتوسطة 50 ٪ باستخدام متعلق بالخلايا العصبية متوسطة صيانة كل 2 إلى 3 أيام. وينبغي أن العمليات العصبية تظهر في غضون أيام قليلة من تغيير إلى متوسط صيانة العصبية. وينبغي أن تستخدم الخلايا في غضون 3 أسابيع من نقله إلى متوسطة صيانة العصبية. يمكن التعرف على الخلايا العصبية باستخدام عدد من علامات العصبية متاحة تجاريا. كما يمكن الملاحظة دائما النجمية.
- التعبير عن ثقافة السكان عادة على نسبة أكبر من 40 ٪ من الخلايا العصبية إلى إجمالي عدد الخلايا. ربما استخدام وسائل الإعلام الأخرى من الخلايا العصبية صيانة NeuraLife توفير الخلايا السفلية التي لا تبدو ناضجة شكليا وربما لم البقاء على قيد الحياة ما دام في الثقافة.
8. ممثل النتائج :
والسنجاب أرض القطب الشمالي الكبار الخلايا الجذعية العصبية لا تزال تتضاعف كل 24 ساعة لمدة 3 إلى 5 أيام على الأقل اثنين من الممرات عند المصنف في 500،000-600،000 cells/75mm القارورة. وهذه الخلايا تفرق بسهولة مع إزالة basicFGF وB27 وجود FBS ٪ 1-2 و 1 ٪ الأنسولين / ترانسفيرين / السيلينيوم ، وسوف تصبح TUJ1 (كوفانس) الخلايا العصبية الإيجابية داخل 14-21 يوما (انظر الشكل 2). فإن نسبة من الخلايا العصبية إلى الخلايا إجمالي يتراوح ما بين 40-60 ٪ ، اعتمادا على سن وثقافة (الشكل 3). ويمكن استخدام الخلايا العصبية للتجريب من 12 يوما بعد البذر من خلال ما لا يقل عن 21 يوما بعد البذر.
الشكل 1. صورة مجهرية من AGS الحصين الكبار الخلايا الجذعية العصبية.
صورة مجهرية لمرحلة الكبار AGS الحصين الخلايا الجذعية العصبية التالية 3 أيام من النمو في وسائل الإعلام في القاعدية agsNSC بولي - L - الأورنيثين قوارير المغلفة. مضاعفة يحدث تقريبا كل 24hrs. الصورة في التكبير 100X.
الشكل 2. صورة مجهرية من الفلورسنت متباينة AGS الحصين الكبار الخلايا الجذعية العصبية
وتعرض الخلايا الجذعية العصبية AGS إلى وسائل الإعلام التمايز لمدة 4 أيام ، ثم في المحافظة Neuralife لمدة 17 ايام اخرى قبل تحديد. تم إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4 ٪ والخلايا العصبية التي تم تحديدها باستخدام TUJ1 الضد الابتدائي (كوفانس) واليكسا فلور 568 الضد الثانوية (الخضراء) من Invitrogen. وأضيف إلى 33343 هويشت صبغ صمة جميع النوى (الأزرق). تم تحديد عدد الخلايا ، وعدد الخلايا العصبية ونسبة الخلايا العصبية باستخدام برمجيات neurite ثمرة والصك Arrayscan من Cellomics. هذه الصورة تمثل ما يقرب من 57 ٪ الخلايا العصبية. 10X التكبير
الشكل 3. أرقام ونسب الخلايا العصبية الخلية العصبية من الخلايا المتمايزة AGS الجذعية العصبية في ثلاثةثقافة العصور
وتعرض الخلايا الجذعية العصبية AGS إلى وسائل الإعلام التمايز لمدة 4 أيام ، ثم الاحتفاظ بها في Neuralife لمدة 12 يوما و 15 و 17 قبل التثبيت. تم إصلاح الخلايا والخلايا العصبية التي تم تحديدها مع TUJ1 الضد الابتدائي (كوفانس). وأضاف هويشت صبغ لصبغ كل نواة الخلية لتحديد المجموع. تم تحديد عدد الخلايا ، وعدد الخلايا العصبية والخلايا العصبية في المئة نسبة نمو استخدام البرمجيات neurite والصك Arrayscan من Cellomics. تمثل القيم يعني من 15 بئرا في حالة + SD.
حسابات الجدول نموذج 1. المستخدمة في الركض والبذر
- 700000 باستخدام خلايا / مل تعليق خلية
- باستخدام الكثافة خلية من خلايا 75000 / مل أو خلايا 15000 لكل بئر من 0.2 مل في حجم كل بئر.
- بتلقيح 96 بئرا بنسبة 0.2 مل لكل بئر = 19.2 مل 21 مل أو الحجم النهائي المطلوب.
- (المجلد العاشر التركيز النهائي النهائي) ÷ التركيز الأولي = حجم الأولية
(21 مل س 75000 خلية / مل) ÷ 700000 = 2.25 مل - حجم FBS تعليق في الخلية. 2.25 مل = 2.25 مل س = 0.05 مل 0.1125
- يحتاج حجم FBS في 21 مل = 21 X 0.02 مل = 0.42 مل
- حجم FBS إضافة إلى متوسطة التمايز = 0.42 مل -- 0.1125 = 0.3075 مل مل
- حجم التمايز متوسطة = 21 مل -- 2.25 مل تعليق الخلية -- 0.3075 مل 5 ٪ = 18.44 مل FBS.
- الجمع بين 18.44 مل متوسطة التمايز مع 0.308 مل FBS وإضافة 2.25 مل من التعليق الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AGS خلايا البالغين الجذعية العصبية هي قوية ويمكن توسيعها لفقرات عديدة مما يجعلها مصدرا ممتازا للخلايا الجذعية العصبية لدراسة الخصائص الأساسية في الخلايا الجذعية العصبية. معدل التوسع هو واحد تقريبا يتضاعف كل 24 ساعة ، ولكن يجب أن تكون هذه الخلايا passaged قبل الوصول إلى نقطة التقاء لأن الاتصال بين الخلايا والتمايز لصالح النجمية. سوف اتصل بوساطة تمايز سبب ذلك نسبة لعدد من الخلايا العصبية خلية الإجمالي إلى الانخفاض بشكل كبير ، وإذا كان التمايز يبدأ قبل trypsinization والمرور. ويوضح الشكل 1 جذع الخلية العصبية AGS الثقافة التي ينبغي passaged في غضون 24 ساعة.
AGS الخلايا الجذعية العصبية التمسك بقوة بولي - L - يسين Biocoat المغلفة لوحات ويمكن أن ينخفض إلى 1 ٪ FBS في غضون 90 دقيقة دون رفع الخلايا. كما تتم إزالة FBS وrhFGFbasic ، فإن الخلايا العصبية تفرق نحو نصف والنجمية ونصف. وسوف تكون الخلايا العصبية TUJ1 إيجابية في غضون أسبوعين (الشكل 2) ، وMAP2. إيجابية في غضون ثلاثة أسابيع بعد الاستقراء (إذا تم استخدام NeuraLife متوسطة) توصيف أكثر اكتمالا للتعبير مستقبلات وظيفة الخلايا العصبية الناضجة معلقة. TUJ1 MAP2 والتعبير هو سمة من أسلاف الخلايا العصبية التي هي ملتزمة مصير الخلايا العصبية ولكن مع الاحتفاظ النشاط الإنقسامية 10.
استجابة لنقص الأكسجين أو الأكسجين الحرمان الجلوكوز (OGD) التغيرات في الفترة بين 2 و 3 أسابيع في الثقافة. في حين ، قد خفض عدد الخلايا العصبية بعد 16 يوما من زراعة (4 أيام من التمايز والصيانة لمدة 12 يوما) نسبة إلى الخلايا العصبية لا تزال بالقرب من مجموع 50 ٪ (الشكل 3). ويمكن مع ذلك ، أو نقص الأكسجة OGD تطبيقها على بذر آخر 12-19 يوما لحث على تكوين الخلايا العصبية في هذه الثقافات من التعبير عن TUJ1 الخلايا العصبية. تكوين الخلايا العصبية التي يسببها ويبدو أن آلية واحدة من قبل هذه الخلايا التي تقاوم الإصابة التي لوحظت في متمايزة خلايا الجذعية العصبية يتعرضون للإهانات يعادل (قيد الإعداد). قد فهم أفضل للآليات تكوين الخلايا العصبية التي يسببها نقص الأكسجة وOGD في الثقافات AGS العصبية تؤدي إلى تطوير علاجات جديدة لعلاج السكتة الدماغية والسكتة القلبية والخرف المرتبطة إمدادات الدم محدودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JA - كيليهر اندرسون هو مؤسس وNeuronascent هو مخترع على أرض الواقع في القطب الشمالي تطبيقات براءات الاختراع السنجاب. Neuronascent يتلقى الإتاوات على بيع وسائل الاعلام AGS والخلايا الجذعية. ويعمل الصليب الأحمر ماكجي بواسطة شريان الحياة ، وشركة والتي تقوم بتوزيع وسائل الإعلام وAGS الخلايا الجذعية العصبية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق البحث الطبي التابع للجيش الأميركي والعتاد منح قيادة # 05178001 و06 - NS041069 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية. نشكر جويل Vonnahme لتعليقات مفيدة على البروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agsNSC | Lifeline Cell Technology | FC-0004 | |
| agsNSC Expansion kit | Lifeline Cell Technology | LL-0008 | Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com) |
| agsNSC differentiation kit | Lifeline Cell Technology | LL-0009 | Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com) |
| NeuraLife maintenance media kit | Lifeline Cell Technology | LL-0012 | Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com) |
| Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm |
| Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates | BD Biosciences | 356516 | www.bdbiosciences.com |
| Large orifice pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-141 | Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com |
References
- Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
- Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
- Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
- Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
- Christian, S. L. Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).
- Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
- Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
- Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).
