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Neuroscience

Crecimiento y diferenciación de las células del hipocampo adulto ardilla de tierra del Ártico troncales nerviosas

Published: January 7, 2011 doi: 10.3791/2199
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Alaska Basic Neuroscience Program, Institute of Arctic Biology, University of Alaska at Fairbanks, 2Department Biochemistry, Hood College, 3Department of Cell Biology, Neuronascent, Inc., 4Research and Development, Neuronascent, Inc.

Summary

Las células madre neurales se prepararon desde el hipocampo de los adultos no hibernan las ardillas de tierra del Ártico año de edad (AGS). Estas células madre neurales se puede ampliar a través de numerosos pasajes, diferenciados y se mantiene como una neurona cerca de 50:50 a la cultura gliales.

Abstract

Ardillas terrestres del ártico (Urocitellus parryii, AGS) son únicos en su habilidad para hibernar con una temperatura corporal central por debajo de cero o cerca de 1. Estos animales también se resisten a la lesión isquémica en el cerebro in vivo 2,3 y el oxígeno, la glucosa en la privación in vitro 4,5. Estas cualidades únicas proporcionó el impulso para aislar las neuronas AGS para examinar las características inherentes neuronal que podría explicar la capacidad de las neuronas AGS para resistir las lesiones y la muerte celular causada por la isquemia y temperaturas extremadamente frías. La identificación de proteínas o genes diana que permiten las propiedades distintivas de estas células podría ayudar en el descubrimiento de terapias efectivas para una serie de indicaciones isquémica y para el estudio de la tolerancia al frío. Hipocampo adulto AGS contiene las células madre neurales que siguen proliferando, lo que permite una fácil expansión de estas células madre en cultivo. Se describe aquí los métodos por los cuales los investigadores pueden utilizar estas células madre y neuronas diferenciadas para cualquier propósito. Siguiendo muy de cerca los pasos de las células madre neurales AGS se puede ampliar a través de dos o más pasajes y diferenciado a una alta cultura en Tuj1 positivo neuronas (~ 50%) sin utilizar productos químicos tóxicos para reducir al mínimo el número de células en división. La isquemia induce la neurogénesis 6 y la neurogénesis que procede a través de MEK / ERK y las vías de señalización de supervivencia PI3K/Akt contribuye a la resistencia a la isquemia in vivo e in vitro 7 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., En preparación). Además de la caracterización de estas células neuronales única puede avanzar en muchos frentes, con todos o algunos de estos métodos.

Protocol

1. AGS de células madre neurales y la preparación de medios

  1. Adulto ardilla de tierra ártica del hipocampo (AGS), las células madre neurales aisladas en una manera previamente descrita 9 ahora se puede obtener comercialmente como viales congelados. Las células son enviadas durante la noche en los paquetes de aislamiento que contienen hielo seco para asegurarse de que las células permanecen en un estado crioconservados. Para mantener la integridad, descomprimir las células inmediatamente después de recibir y almacenar a precios inferiores a -150 ° C, o en la fase de vapor de nitrógeno líquido Dewar.
  2. Preparar el medio basal agsNSC + 5% de SFB mediante la adición de 5 ml de FBS (LS-1012) a 95 ml de medio basal agsNSC
  3. Preparar el medio de expansión agsNSC añadiendo 500 B-27 l Suplemento (Invitrogen) a 50 ml de medio agsNSC basal. Divide el resto de la B27 en 1 ml alícuotas y guardar a -20 ° C hasta su uso.
  4. Caliente 25 ml de medio basal agsNSC + 5% de SFB y 20 ml de medio de expansión agsNSC en un baño de agua 37 ° C.
  5. Frascos de abrigo para la expansión con poli-L-ornitina
    1. Descongele la solución de poli-L-ornitina (10 mg / mL) de trabajo. Guarde la solución a 2-8 ° C hasta por un mes, una vez descongelado.
    2. Añadir 8 ml de solución de poli-L-ornitina trabajando para una ventilación T-75 frasco y distribuir uniformemente la solución sobre la superficie de cultivo de todo el frasco. (Ajuste la cantidad de la solución de trabajo en los buques de otras culturas que pueden ser utilizados Use 0,5 -.. 1,0 ml de poli-L-ornitina solución de trabajo por 10 cm de la superficie de cultivo 2)
    3. Incubar frascos a 37 ° C durante un mínimo de 24 horas. (El uso de una incubadora sin adición de CO 2 es el preferido para la incubación de poli-L-ornitina recipientes de cultivo cubierto.) Frascos recubierto puede ser almacenado hasta por dos semanas en la incubadora.
    4. Antes de su uso, aspirar poli-L-ornitina solución de trabajo del frasco y lavar dos veces con agua estéril de cultivo de tejidos de grado. Aspirar el contenido hasta que el frasco está casi seco antes de usarlo.
  6. Saca una ampolla de la Dewar y comprobar que el tapón del vial está bien sellada. Mantenga la parte superior del frasco dejando la mitad inferior del vial en un baño de agua 37 º C durante unos 60-90 segundos o hasta que se vial es casi completamente descongelado, una pequeña cantidad de hielo aún debe ser visible. Para evitar una posible contaminación, mantenga la tapa del frasco fuera del agua. No más de deshielo, ya que podría dañar las células.
  7. Rocíe el exterior del vial con el 70% de etanol o isopropanol, a continuación, coloque el frasco en una cabina de seguridad biológica. Retire la tapa con cuidado para evitar la contaminación o salpicaduras.
  8. Suavemente volver a suspender las células en el vial mediante la adición de 1 ml de medio basal agsNSC + 5% de SFB con una pipeta estéril. Transferencia de las células suspendidas de nuevo a 25 ml de agua tibia Medio Basal agsNSC + 5% de SFB en un tubo de centrífuga de 50 ml.
  9. Enjuague la crio-vial una vez con la suspensión celular diluida. Centrifugar las células a 150 xg durante 6 minutos. Para mejores resultados, calcular la velocidad del centrifugado para cada tipo de persona.
  10. Mientras que las células están girando hacia abajo, agregar 10 ml de medio de expansión agsNSC a la seca poli-L-ornitina T-75 recubierto matraz y agregar 40 ml de FGF-rh básicos (40ng/mL). Después de la centrifugación, se aspira el líquido sobrenadante, teniendo cuidado de no aspirar el pellet. Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio de expansión agsNSC. Transferencia de las células suspendidas nuevamente en medio de expansión agsNSC en los medios de comunicación en el frasco T-75.
  11. Agite suavemente el recipiente de cultivo de lado a lado para distribuir uniformemente las células dentro del recipiente.
  12. Colocar recipiente de cultivo sembradas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Las células deben adjuntar al matraz y se empiezan a formar los procesos dentro de dos horas de la siembra. Si las células quedan flotando y una bola con en el medio, centrifugar las células en un 5% de SFB y ejecutar los pasos de 1,8 a 1,10 con un nuevo medio y el frasco.

2. La expansión de AgsNSC

  1. Dos días (~ 48 horas) después de la descongelación y la siembra de las células, un reemplazo de medio completo se debe realizar con 20 ml de medio de expansión agsNSC además de un alza de 40 l hr FGF-básico.
  2. Pico de frascos con 40 ml de FGF-rh básica sobre la inoculación al día siguiente. Las células estarán listos para trypsinize cuando han llegado a 75-80% de confluencia por el tercer o cuarto día después de la inoculación. El cultivo de células madre indiferenciadas por más de 4 días de la inoculación no es recomendable porque ya incubación permiten a las células comienzan a diferenciarse en neuronas y las neuronas pueden ser dañados por tripsinización durante el paso 3. La humedad relativa FGF-básico se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de una semana y aún así mantener la actividad. La humedad relativa FGF-básico también puede ir a través de una congelación adicional / descongelación a -20 º C si se necesita más tiempo.

3. Tripsinización de las células

  1. agsNSC deben ser pasados ​​3 a 4 días después de la inoculación. Prepare un recipiente recubierto con poli-L-ornitina entre 24 horas y una semana antes de los pases si el agsNSC se ampliará de nuevo.
  2. Aspirar elmedio del recipiente de cultivo. Añadir 2,5 ml de 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) a la embarcación por cada 75 cm 2 de superficie. Hágalo girar suavemente para asegurar que todas las células están cubiertas con la tripsina / EDTA. Células que normalmente empiezan a desprenderse de la superficie en 60 segundos, dependiendo de la confluencia de las células. No más de trypsinize, ya que esto puede dañar las células. Golpeando suavemente el recipiente de cultivo de varios lados animará desprendimiento.
  3. Una vez que las células se separan, agregar 10 ml de medio basal agsNSC + 5% de SFB en el matraz. Agitar suavemente para asegurar que toda la solución se neutraliza la tripsina. El uso de técnicas de laboratorio aséptico, pipeta las células en un tubo de centrífuga estéril que contiene 10 ml de medio base agsNSC 5% de SFB. Repita el lavado del matraz de nuevo con un adicional de 10 ml de medio basal agsNSC + 5% de SFB y se combinan con el primer lavado.
  4. Las células se centrifugan a 150 xg durante 6 minutos como se describió anteriormente. Después de la centrifugación, las células deben formar una bolita suelta limpia. Aspirar tripsina neutraliza y medio del tubo de centrífuga y vuelva a suspender el pellet de células en 10 ml (T-75 por frasco) de la pre-calentado medio basal agsNSC + 5% de SFB pipeteando suavemente hacia arriba y abajo 2 veces con una pipeta de 10 ml. Realizar un recuento de células como se describe a continuación.

4. El cálculo estándar para la siembra de las células

  1. Utilizando una técnica aséptica, agitar la suspensión celular y la transferencia de 15 ul de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Añadir 15 ul de tripán 0,4% azul. Mezclar suavemente y carga de 10 l de la suspensión celular a cada una de las cámaras en un hemocitómetro limpio como una línea brillante cámara de recuento (catálogo # 1490: Hausser Científico, http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
  2. Contar con un mínimo de cuatro cuadrantes en el hemocitómetro. Las celdas azules que son positivas para azul tripán están muertos y no debe ser contado. Para el recuento de células precisa, el número óptimo de las células por cuadrante debe ser 25-75 células.
  3. Después de contar las células, se calcula el promedio de los 4 cuadrantes. Multiplique el número medio de células por 10.000 y por el factor de dilución (2 si se utiliza el volumen recomendado) para determinar el número de células por ml. Tenga en cuenta que si la viabilidad porcentaje total es inferior al 92%, puede ser un número de causas. Una de las razones para la viabilidad de baja puede ser más de tripsina, antes de la tripsina neutralización con FBS. Otra razón puede ser que la concentración de suero (FBS) a la tripsina es muy bajo y las células siguen siendo trypsinized. En tercer lugar, las células pueden haber sido demasiado confluentes, causando que las células madre se diferencien por el contacto célula-célula, dando lugar a una lesión durante tripsinización. Si este método es seguido muy de cerca con un rendimiento de 3 o más doblajes se puede esperar, dando una población de> 4.000.000 células de un número inicial de ~ 500.000.

5. La inoculación de otro frasco de expansión

  1. Para determinar el número total de células necesarias para inocular un recipiente, se multiplica la densidad de siembra deseada (6.600 células por cm 2 o 500 mil células por frasco T-75) por la superficie (en cm 2) de la embarcación para ser inoculados. Si la inoculación de más de un buque multiplicar el número de células por buque por el número total de buques. Para determinar el volumen (ml) de suspensión de células necesarias para inocular a cada buque, dividir el número de células necesarias para vacunar a un buque por el número de células viables / mL en la suspensión celular. Si la inoculación de más de un buque calcular el volumen total de la suspensión celular que necesita multiplicar el volumen necesario para un buque por el número total de buques a ser inoculados.
  2. Centrifugar el volumen deseado de las células en medio basal agsNSC + 5% de SFB, dejando un sedimento suelto. Normalmente 500.000 células se ponen a un volumen total de 25 ml en el medio basal agsNSC 5% de SFB como se describió anteriormente. Aspirar el contenido y volver a suspender las sueltas precipitado en 10 ml de medio de expansión agsNSC es obligatorio Este paso de centrifugación adicional para eliminar FBS antes de la inoculación. Agregar 10 ml de pre-calentado medio de expansión agsNSC al frasco T-75. Añadir los 10 ml de suspensión celular se resuspendió en el matraz T-75 a continuación, agregar 40 ml de FGF-rh básicos en el matraz. Considere la posibilidad de que la tripsina y la inoculación no debe tardar más de 1,5 horas al momento de decidir el número máximo de frascos de trabajar con él en un momento dado. Uno debe también tener los medios suficientes para completar los cambios medios de comunicación si se utiliza numerosos frascos.
  3. Agite suavemente el frasco de un lado a otro para distribuir uniformemente las células y el lugar los recipientes de cultivo en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora, como se describió anteriormente.

6. Dilución de las células para la inoculación de las placas para la diferenciación

  1. Cualquier formato multi-bien podría ser utilizado, pero la inoculación en BD Biocoat poli-L-lisina recubierto placas de 96 pocillos se described aquí. Determinar el volumen de suspensión celular necesario para el experimento de multiplicar el número de pozos que se inocularon 0,2 ml por pocillo de un 96 multi-así placa y añadir aproximadamente un 10% para cubrir cualquier pérdida en el volumen durante la inoculación. Calcular la dilución a una densidad celular de 75.000 células / ml. Determinar la cantidad de FBS que se añade al medio de diferenciación para lograr una concentración final de FBS al 2% (Tabla 1). Mezcle el FBS y medio de diferenciación. Mezclar con cuidado las células con el volumen calculado de medio de diferenciación con el FBS. (Nota: Durante la centrifugación las células se encuentran en Medio Basal agsNSC + 5% de SFB Mientras FBS protege a las células durante la centrifugación y facilita la adhesión celular FBS inhibe differention dilución FBS al 2% es el porcentaje de adhesión de las células de la superficie de pozos múltiples... El FBS al 2% se diluye aún más para promover la diferenciación. insulina-transferrina-selenio (ITS-e) también se incluye en el medio de diferenciación para promover la diferenciación.
  2. En un gabinete de bioseguridad, prescindir de 200 l de suspensión celular diluida de un depósito Combitip estéril a cada pocillo de una poli-L-lisina placa recubierta de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal y puntas de gran orificio. Las placas se incuban durante 1,5-2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Después las células se han unido, después de unos 90 a 120 minutos, retirar con cuidado el 50% (100 l de placas de 96 pocillos) del medio de cada pocillo con puntas de gran orificio de la pipeta. Vuelva a colocar cuidadosamente el volumen extraído con medio caliente diferenciación agsNSC, de nuevo con grandes puntas de pipeta de orificio. (El uso de puntas de orificio estándar puede dañar las células).
  3. Dos días después de la inoculación (~ 48 horas), realizar un cambio de medio de 50% con medio de diferenciación agsNSC y grandes puntas de pipeta de orificio.

7. Mantenimiento de las neuronas

  1. Preparar medio de mantenimiento neuronal utilizando NeuraLife, glutamina y B27 según las instrucciones. Medio de mantenimiento neuronal debe ser preparado por semana.
  2. Dos días después del último cambio agsNSC medio de diferenciación, por lo general el día 4 después de la inoculación, realizar un reemplazo medio del 50% con medio de mantenimiento neuronal.
  3. Seguir para llevar a cabo el 50% reemplazos medio con medio de mantenimiento neuronal cada 2 ó 3 días. Los procesos neuronales que aparecen a los pocos días del cambio de medio de mantenimiento neuronal. Las células deben ser utilizados dentro de 3 semanas de ser transferidos a medio de mantenimiento neuronal. Las neuronas pueden ser identificados con un número de marcadores neuronales disponibles en el mercado. Los astrocitos también siempre se observa.
  4. Las poblaciones de la cultura suelen expresar una mayor proporción del 40% de las neuronas al número total de células. El uso de medios de mantenimiento de neuronas que no puede proporcionar células NeuraLife inferior que no se parecen morfológicamente maduros y no puede sobrevivir el mayor tiempo en la cultura.

8. Los resultados representativos:

El Ártico tierra células madre neurales adultas ardilla continuará duplicándose cada 24 horas durante 3 a 5 días por lo menos dos pasajes cuando se sembró a 500,000-600,000 frasco cells/75mm. Estas células se diferencian fácilmente con la eliminación de basicFGF y B27 y la presencia de FBS 1-2% y 1% de la insulina / transferrina / selenio, y se convertirá en Tuj1 (Covance), las neuronas positivas dentro de 14-21 días (ver Figura 2). La proporción de neuronas de células totales se situará entre un 40-60%, dependiendo de la edad del cultivo (Figura 3). Las neuronas pueden ser utilizados para la experimentación de 12 días post-siembra a través de al menos 21 días después de la siembra.

Figura 1
Figura 1. Microfotografía de las células del hipocampo adulto AGS madre neurales.
Fase de microfotografía de AGS del hipocampo adulto las células madre neurales siguientes 3 días de crecimiento en agsNSC medio basal de poli-L-ornitina frascos revestidos. La duplicación se produce aproximadamente cada 24 horas. Foto en un aumento de 100X.

Figura 2
Figura 2. Micrografía de fluorescencia diferenciadas AGS hipocampo adulto las células madre neurales
AGS células madre neurales fueron sometidos a los medios de diferenciación de cuatro días, luego se mantiene en Neuralife durante 17 días más antes de la fijación. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y las neuronas identificadas con Tuj1 anticuerpo primario (Covance) y Alexa Fluor 568 anticuerpo secundario (verde) de Invitrogen. Hoechst 33343 se añadió a la mancha todos los núcleos (azul). El número de células, número de neuronas y la relación de las neuronas se determinaron utilizando el software crecimiento de las neuritas y el instrumento de Arrayscan Cellomics. Esta foto representa aproximadamente el 57% las neuronas. Un aumento de 10x

Figura 3
Figura 3. Número de neuronas y relación de las neuronas de las células diferenciadas AGS madre neurales en tresedades cultura
AGS células madre neurales fueron sometidos a los medios de diferenciación de cuatro días, luego se mantiene en Neuralife para los días 12, 15 y 17 antes de la colocación. Las células fueron fijadas y las neuronas identificadas con Tuj1 anticuerpo primario (Covance). Hoechst fue agregado a la mancha para la identificación de todos los núcleos de células total. El número de células, número de neuronas y la relación de las neuronas por ciento se determinó el uso de software crecimiento de las neuritas y el instrumento de Arrayscan Cellomics. Los valores representan la media de 15 pozos por condición + SD.

Tabla 1. Cálculos de la muestra utilizada en los pases y la siembra

  1. Usando 700.000 células / ml de suspensión celular
  2. Usando una densidad celular de 75.000 células / ml o células 15,000 por pozo de 0,2 ml de volumen en cada pozo.
  3. La inoculación de 96 pocillos de 0,2 ml por bien = 19,2 ml o el volumen final deseado 21 ml.
  4. (Volumen final x concentración final) ÷ ​​concentración inicial = Volumen inicial
    (21 ml x 75.000 células / ml) ÷ 700,000 = 2,25 mL
  5. Volumen de FBS en suspensión de células. 2,25 ml = 2,25 ml x 0,05 = 0,1125 ml
  6. Volumen de FBS necesaria en 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml
  7. Volumen de FBS para añadir a medio de diferenciación = 0,42 mL - 0,1125 = 0,3075 ml ml
  8. Volumen de medio de diferenciación = 21 ml - 2,25 ml de suspensión celular - 0,3075 ml 5% de SFB = 18.44 ml.
  9. Combine 18,44 medio de diferenciación ml con 0,308 ml de FBS y añadir 2,25 ml de suspensión celular.

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Discussion

AGS células madre neurales adultas son robustos y pueden ser ampliadas por numerosos pasajes las convierte en una excelente fuente de células madre neurales para el estudio de las propiedades básicas de las células madre neurales. La tasa de expansión es de aproximadamente un duplica cada veinticuatro horas, pero estas células deben ser pasados ​​antes de la confluencia de llegar porque el contacto entre las células que favorecen la diferenciación de los astrocitos. Contacto mediada la diferenciación por lo tanto, hacer que la relación de las neuronas al número total de células que se reduzca drásticamente, si la diferenciación se inicia antes de la tripsina y la aprobación. La Figura 1 ilustra un AGS madre neurales de cultivo de células que deben ser pasados ​​dentro de las 24 hrs.

AGS células madre neurales se adhieren fuertemente a la poli-L-lisina placas recubiertas Biocoat y FBS se puede reducir a 1% en 90 minutos sin que el levantamiento de las células. Como FBS y rhFGFbasic son extraídas, las células se diferencian a unos neuronas y astrocitos media media. Las neuronas se Tuj1 positiva dentro de dos semanas (Figura 2), y MAP2 positivos dentro de tres semanas después de la inducción (si se utiliza medio NeuraLife). Una caracterización más completa de la expresión del receptor y la función de las neuronas maduras se encuentra pendiente. Tuj1 y expresión MAP2 es característico de células progenitoras neuronales que se han comprometido a un destino neuronal, pero conservan la actividad mitótica 10.

Respuesta a la hipoxia o falta de oxígeno la glucosa (OGD) varía, entre 2 y 3 semanas en cultivo. Mientras, el número de neuronas puede disminuir después de 16 días de cultivo (4 días de diferencia y 12 días de mantenimiento) el porcentaje de neuronas en las células total se mantiene cerca del 50% (Figura 3). Sin embargo, la hipoxia o la OGD aplicado a la siembra después de 12 a 19 días puede inducir la neurogénesis en estas culturas de Tuj1 las neuronas que expresan. Inducida por la neurogénesis parece ser un mecanismo por el cual estas células resisten lesiones observadas en diferenciar las células madre humanas neuronales expuestos a insultos equivalente (en preparación). Una mejor comprensión de los mecanismos de la neurogénesis y la hipoxia inducida por la OGD en cultivos de AGS neuronal puede conducir al desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de apoplejía, paro cardíaco y la demencia asociada con el suministro de sangre limitado.

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Disclosures

JA Kelleher-Andersson es el fundador de Neuronascent y es el inventor de las aplicaciones del suelo Ártico patente ardilla. Neuronascent recibe regalías por la venta de AGS los medios de comunicación y las células madre. RC McGee es empleado por Lifeline, Inc., que distribuye los medios de comunicación y las células madre neurales AGS.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material comando GRANT # 05178001 y NS041069-06 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares. Agradecemos a Joel Vonnahme por sus valiosos comentarios sobre el protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
agsNSC Lifeline Cell Technology FC-0004
agsNSC Expansion kit Lifeline Cell Technology LL-0008 Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com)
agsNSC differentiation kit Lifeline Cell Technology LL-0009 Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com)
NeuraLife maintenance media kit Lifeline Cell Technology LL-0012 Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com)
Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) Hausser Scientific 1490 http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates BD Biosciences 356516 www.bdbiosciences.com
Large orifice pipette tips Fisher Scientific 02-707-141 Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com

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References

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