Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma

Published: January 7, 2011 doi: 10.3791/2199
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Alaska Basic Neuroscience Program, Institute of Arctic Biology, University of Alaska at Fairbanks, 2Department Biochemistry, Hood College, 3Department of Cell Biology, Neuronascent, Inc., 4Research and Development, Neuronascent, Inc.

Summary

Sinir kök hücreleri, yetişkin olmayan kış uykusuna toklu Arctic zemin sincap (AGS) hipokampus hazırlanmıştır. Bu sinir kök hücreleri, sayısız kanallar sayesinde genişletilmiş, farklılaşmış ve glial kültürü neredeyse 50:50 nöron olarak muhafaza edilebilir.

Abstract

Arctic zemin sincap (Urocitellus parryii, AGS) dondurulması 1 yakınında ya da altında bir çekirdek vücut ısısı ile hibernate yeteneği benzersiz. Bu hayvanlar aynı zamanda, in vivo 2,3 ve oksijen-glikoz in vitro 4,5 mahrum beyin iskemik yaralanmalara karşı. Bu benzersiz nitelikleri, yaralanma ve iskeminin neden olduğu hücre ölümü ve son derece soğuk havalarda karşı AGS nöronların kapasitesi hesabı doğasında nöronal özellikleri incelemek AGS nöronlar izole etmek için bir ivme sağladı. Proteinler ya da bu hücrelerin ayırt edici özelliklerini sağlayan gen hedefleri belirleme iskemik endikasyon ve soğuk hoşgörü çalışması için bir dizi etkili tedavilerin keşif yardımcı olabilir. Yetişkin AGS hipokampus, bu kök hücrelerin kültür kolay genişleme için izin, yayılmaya devam etmektedir nöral kök hücreler içerir. Biz burada araştırmacılar amaçlarla herhangi bir sayı için, bu kök hücreler ve farklı nöronların yararlanabilirler hangi yöntemleri açıklanmaktadır. AGS bu adımları yakından takip ederek nöral kök hücreler, iki veya daha fazla pasajlar ile genişletilebilir ve sonra bölünen hücreleri sayısını en aza indirmek için toksik kimyasallar kullanmadan TUJ1 pozitif nöronların (~% 50) yüksek bir kültür için farklılaşmış. İskemi nöron 6 ve MEK / ERK ve PI3K/Akt hayatta kalma sinyalizasyon yolları, in vivo 7 ve in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew ve ark, hazırlanmakta) iskemi direncine katkıda bulunur üzerinden ilerler nöron neden olur. Bu eşsiz sinir hücrelerinin ileri karakterizasyonu, bazı veya tüm bu yöntemleri kullanarak, birçok cephede ilerleme.

Protocol

1. AGS Nöral Kök Hücre ve Medya Hazırlık

  1. Bir şekilde izole nöral kök hücreler, daha önce açıklanan 9 Yetişkin hipokampal Arctic zemin sincap (AGS) Kriyoprezerve şişeleri ticari olarak elde edilebilir. Hücreler, hücreleri Kriyoprezerve bir durumda kalmasını sağlamak için kuru buz içeren yalıtılmış paketleri gecede sevk edilmektedir. Bütünlüğünü korumak için, açmak -150 daha düşük hemen alınması ve depolanması ile hücreleri ° C, ya da bir sıvı nitrojen Dewar buhar fazında.
  2. AgsNSC Bazal Orta hazırlayın +% 5 FBS 95 ml agsNSC Bazal Orta 5 mL FBS (LS-1012) ekleyerek,
  3. 500 mcL B-27 Supplement (Invitrogen) 50 ml agsNSC Bazal Orta ekleyerek agsNSC Genleşme Orta hazırlayın. Kullanana kadar 1mL alikotları ve -20 ° C'de saklayın B27 kalan bölün.
  4. 25 ml Sıcak agsNSC Bazal Orta +% 5 - 37 ° C su banyosunda agsNSC Genişleme Orta FBS ve 20 ml.
  5. Poli-L-ornitin ile genişletilmesi için kullanılan Coat matara
    1. Poli-L-ornitin (10 mg / ml) çalışan bir çözüm çözülme. ° C ile bir kez çözdürülmelidir bir ay kadar 2-8 arasında çözüm saklayın.
    2. 8 mL Poli-L-Ornithine çalışma çözeltisi ekleyin ve bir Bacalı T-75 şişesi, balonun tüm kültür yüzeyi üzerinde eşit çözüm dağıtmak. (Kullanım 0.5 kullanılmış olabilecek diğer kültür gemiler için çözüm çalışma miktarını ayarlayın - 10 cm 2 kültür yüzey başına 1,0 mL Poli-L-Ornithine çözüm)
    3. 37 ° C'de en az 24 saatlik bir matara inkübe edin. (Poli-L-Ornithine kaplı kültür damarlarının eklendi CO 2 olmadan bir kuluçka inkübasyon için tercih edilir.) Kaplamalı şişeler inkübatör iki hafta kadar saklanabilir.
    4. Kullanmadan önce, şişeden Poli-L-Ornithine çalışma çözüm aspirat ve iki kez steril doku kültürü dereceli su ile yıkayın. Kullanmadan önce şişeyi neredeyse kuru hale gelene kadar sıvı aspire edin.
  6. Dewar bir şişe çıkarın ve flakon kapağı sıkıca kapatılmış olup olmadığını kontrol edin. Flakon neredeyse tamamen çözülene kadar yaklaşık 60-90 saniye veya 37 ° C su banyosunda bırakarak flakon flakon alt yarısında üst tutun; küçük bir miktar buz hala görünür olmalıdır. Potansiyel kontaminasyonu önlemek için, suyun flakon kapağı dışarı tutmak. Çözülme üzerinden yapmayın, bunu hücrelere zarar verebilir.
  7. % 70 etanol veya isopropanol flakon dış Sprey, daha sonra biyolojik güvenlik kabini flakon. Kontaminasyon veya sıçramak önlemek için dikkatli bir şekilde kapağı çıkarın.
  8. Steril bir pipet kullanarak 1 mL agsNSC Bazal medya +% 5 FBS ekleyerek yavaşça flakon hücrelerin yeniden askıya. 25 ml sıcak agsNSC Bazal Orta yeniden askıya hücreleri Transfer +% 5 FBS 50 ml santrifüj tüpüne.
  9. Kriyo-flakon sulandırılmış hücre süspansiyonu ile bir kez durulayın. 6 dakika boyunca 150 xg'de hücreleri santrifüjleyin. En iyi sonuç için, her bir santrifüj tipi için hızı hesaplar.
  10. Hücreleri aşağı dönerken, kuru poli-L-ornitin kaplı T-75 balonuna 10 ml agsNSC Genişleme Orta ve rh FGF-temel (40ng/mL) 40 mcL ekleyin. Santrifüj sonrasında, pelet aspire özen Süpernatant sıvı aspire. 10 ml agsNSC Genişleme Orta hücrelerin yeniden askıya aldı. AgsNSC Genişleme Orta yeniden askıya hücreler, T-75 balonuna ortama aktarın.
  11. Kültür gemi yan-yan damar içindeki hücreler eşit olarak dağıtmak için yavaşça sallayın.
  12. 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör Yeri numaralı seribaşı kültür gemi. Hücreler balon eklemek ve süreçleri tohumlama iki saat içinde oluşmaya başlar. Kayan hücreleri kalır ve orta içinde tıkıştırılmış, sonra% 5 FBS hücreler santrifüj ve taze orta ve balon adımları 1,8-1,10 çalıştırmak.

2. AgsNSC, genişletilmesi

  1. Çözülme ve tohum hücreleri iki gün (48 saat) sonra, tam orta yerine 20 mL agsNSC Genişleme Orta artı rh FGF-temel bir mcL 40 başak kullanarak yapılmalıdır.
  2. 40 gün aşağıdaki aşılama rh FGF-bazik mcL Spike şişeler. Hücreler, üçüncü veya dördüncü gün sonra aşılama ile% 75-80 izdiham ulaştığınızda trypsinize hazır olacaktır. 4 gün sonra aşılama daha uzun süre kültür farklılaşmamış kök hücreleri uzun kuluçka hücreleri 3. adımında trypsinization tarafından yaralı olabilir, nöronlarda ve nöron ayırt başlamak için izin verecek, çünkü tavsiye edilmez. Rh FGF-temel bir haftaya kadar 4 ° C'de saklanır ve hala faaliyet sürdürmek olabilir. Daha fazla zamana ihtiyaç duyulması halinde rh FGF-temel -20 ° C'de bir ek donma / çözülme de gidebilirsiniz.

3. Hücre, Trypsinization

  1. agsNSC aşılama 3 ila 4 gün sonra geçişli olmalıdır. AgsNSC tekrar genişletilmiş olacak Pasajlanması önce 24 saat ve bir hafta arasında bir poli-L-ornitin kaplı şişesi hazırlayın.
  2. Aspirekültür geminin orta. 2.5 mL% 0.05% Trypsin/0.02 yüzey alanının her 75 cm 2 geminin EDTA (CM-0017). Tüm hücreleri sağlamak için hafifçe Swirl tripsin / EDTA ile kaplanmıştır. Hücreler normal hücrelerin birleştiği bağlı olarak, 60 saniye içinde yüzeyden ayırmak için başlar. Trypsinize üzerinde etmeyin, bunu hücrelere zarar verir. Hafifçe birkaç taraftan kültür damarı dokunarak dekolmanı teşvik edecektir.
  3. Hücrelerin müstakil hale sonra, 10 ml agsNSC Bazal Orta eklemek +% 5 FBS balon. Tripsin çözüm sağlamak için yavaşça girdap nötralize edilir. Aseptik laboratuvar teknikleri kullanarak, agsNSC Bazal orta +5% FBS 10 ml içeren steril bir santrifüj tüpü içine hücreleri pipetle. AgsNSC Bazal Orta ek olarak 10 mL şişeyi tekrar yıkanarak +% 5 FBS tekrarlayın ve ilk yıkamada ile birleşir.
  4. 6 dakika boyunca 150 xg'de Santrifüj hücreleri yukarıda açıklandığı gibi. Santrifüj sonra, hücreler temiz bir gevşek pelet oluşturmalıdır. Hafifçe yukarı aşağı pipetleme ve 10 ml pipet ile 2X santrifüj tüpüne nötralize tripsin ve orta aspire edin ve önceden ısıtılmış agsNSC Bazal Orta 10 ml yeniden askıya hücre pelletini (kişi başına T-75 balon) +% 5 FBS. Aşağıda açıklandığı gibi bir hücre sayımı gerçekleştirin.

4. Hücre Kaplama için Standart Hesaplama

  1. Aseptik teknik kullanarak, girdap hücre süspansiyonu ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer hücre süspansiyonu 15 mcL. % 0.4 Tripan Blue 15 mcL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve hücre süspansiyon Odası (katalog # 1490: Hausser Bilimsel, Sayma Parlak Hattı gibi temiz bir hemasitometre odalarının her biri için 10 mcL yük http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm) .
  2. Hemasitometre 4 kadranın en az güvenin. Tripan Blue pozitif mavi hücreler ölü ve sayılmamalıdır. Doğru hücre sayımı için, optimum sayıda kadran başına hücre 25-75 hücreleri olmalıdır.
  3. Hücrelerinin sayımı sonra, ortalama 4 kadranın hesaplar. Hücre sayısı ortalama 10.000 ve seyreltme faktörü ile çarpın (2 tavsiye edilen hacim kullanarak) mL başına hücre sayısını belirlemek için. Toplam yüzdesini canlılığı% 92 den az olması durumunda bir takım nedenleri olabileceğini unutmayın. Bir nedeni düşük canlılığı FBS ile nötralizasyon tripsin önce, trypsinization üzerinde olabilir. Tripsin serum (FBS) konsantrasyonu çok düşük olduğu ve hücrelerin tripsinize olmaya devam başka bir nedeni olabilir. Üçüncü olarak, hücreler, kök hücreler, hücre-hücre teması nedeniyle ayırt trypsinization sırasında yaralanmaya yol açan neden çok konfluent olabilir. Bu yöntem yakından takip ise 3 veya daha fazla çiftlenmeler verim> bir başlangıç ​​sayısı 500.000 ~ 4.000.000 hücrelerinin bir nüfus veren, beklenen olabilir.

5. Başka bir Genişleme Flask Aşılanması

  1. Bir gemi aşılamak için gerekli olan hücrelerin toplam sayısını belirlemek için, inoküle damar yüzey alanı (cm 2) (cm 2 başına 6.600 hücreleri ya da T-75 şişesi ortalama 500.000 hücreleri) tarafından istenen ekim yoğunluğu çarpın . Birden fazla gemi aşılama gemilerin toplam sayısı gemi başına bir hücre sayısını çarpın. Her iki tekne de aşılamak için gerekli hücre süspansiyonu hacmi (ml) belirlemek için, canlı hücre / hücre süspansiyonu mL sayısına göre bir gemi aşılamak için gerekli hücrelerin sayısı bölün. Birden fazla gemi aşılama hücre süspansiyonu inoküle edilecek gemilerin toplam sayısı bir gemi için gerekli olan hacim çarpılarak gerekli toplam hacmi hesaplarsanız.
  2. Gevşek bir pelet bırakarak agsNSC Bazal Orta istenen hücre hacmi +% 5 FBS santrifüjleyin. Normalde 500.000 hücreleri +5% FBS daha önce açıklandığı gibi agsNSC Bazal Orta toplam hacmi 25 mL getirilir. Sıvı aspire ve 10 ml Bu ekstra santrifüj adım aşılamadan önce FBS kaldırmak için gerekli agsNSC Genişleme Orta gevşek pelet yeniden askıya. T-75 balona 10 ml önceden ısıtılmış agsNSC Genişleme Orta ekleyin. T-75 balona yeniden süspanse hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin, daha sonra rh erlene FGF-temel 40 mcL ekleyin. Herhangi bir zamanda çalışmak için maksimum sayıda şişe karar verirken trypsinization ve aşılama 1.5 saat daha uzun sürer gerektiğini düşünün. Bir de sayısız şişeler kullanıyorsanız, tam bir medya değişiklikler için yeterli medya olmalıdır.
  3. Yavaşça şişeyi yan yana gelen hücreler eşit olarak dağıtmak için rock ve daha önce açıklandığı gibi 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör, kültür damarları.

6. Farklılaşma için Well plakalar Aşılama için Hücreler seyreltilmesi

  1. Herhangi bir çok iyi formatı kullanılır, ancak BD Biocoat Poli-L-lisin kaplı 96 kuyucuğu inokülasyon des olabilirburada açıklanan şekilde değiştirin. 96 çok iyi plaka için ortalama 0.2 ml inoküle kuyu sayısı çarpılarak denemeniz için gerekli hücre süspansiyonu hacmi belirlemek ve aşılama esnasında herhangi bir hacim kaybı karşılamak için yaklaşık% 10 ekleyin. 75.000 hücre / mL 'lik bir hücre yoğunluğu seyreltme hesaplayın. % 2 FBS bir final konsantrasyonu (Tablo 1) elde etmek için Farklılaşma Orta eklenecek FBS miktarını belirlemek. FBS ve Farklılaşma Orta karıştırın. Hücreler Farklılaşma Orta FBS ile hesaplanan hacmi ile dikkatlice karıştırın. (Not: santrifüj sırasında hücreler agsNSC Bazal Orta +% 5 FBS FBS santrifüj sırasında hücreleri korur ve hücre adezyon FBS inhibe differention kolaylaştırır iken% 2 FBS Sulandırma hücreleri çok iyi bir yüzeye yapışma sağlayacaktır. 2% FBS farklılaşma teşvik için daha fazla seyreltilir. İnsülin Transferrin-Selenyum (ITS-e) da farklılaşma tanıtmak için Farklılaşma Orta yer almaktadır.
  2. Biyogüvenlik kabini, her iyi, çok kanallı pipet ve büyük orifis ipuçları kullanarak Poli-L-lizin kaplı 96-plaka seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir combitip rezervuar 200 uL dağıtmak. 37 1.5-2 saat plakaları ° C'de,% 5 CO 2. Hücreleri, bağlı, yaklaşık 90-120 dakika sonra, her bir kuyunun kullanarak büyük orifis pipet uçları dikkatlice orta (96 kuyucuğu için 100 mcL)% 50 çıkarmak sonra. Dikkatlice tekrar büyük orifis pipet uçları kullanarak, sıcak agsNSC Farklılaşma Orta ile kaldırıldı hacim değiştirin. (Standart orifis ipuçları Kullanım hücrelere zarar olabilir).
  3. İki gün sonra aşılama (~ 48 saat),% 50 orta değişikliği agsNSC Farklılaşma Orta ve büyük orifis pipet uçları kullanarak gerçekleştirin.

7. Nöronların Bakım

  1. Nöronal Bakım Orta talimatları başına NeuraLife, glutamin ve B27 kullanarak hazırlayın. Nöronal Bakım Orta haftalık hazırlanmalıdır.
  2. Son agsNSC Farklılaşma Orta değişikliği, normalde 4. Gün yazılan aşılama iki gün sonra,% 50 orta değiştirme Nöronal Bakım Orta kullanarak gerçekleştirin.
  3. Her 2 ila 3 gün Nöronal Bakım Orta kullanarak% 50 orta değiştirmeleri gerçekleştirmeye devam etmektedir. Nöronal süreçleri Nöronal Bakım Orta değişen bir kaç gün içinde görünmelidir. Hücreleri Nöronal Bakım Medium aktarılıyor 3 hafta içinde kullanılmalıdır. Nöronlar, piyasada bulunan nöronal belirteçlerin bir numarayı kullanarak tespit edilebilir. Astrositler da her zaman görülecektir.
  4. Kültür popülasyonları genellikle, toplam hücre sayısı nöronların% 40 den daha büyük bir oranı ifade eder. NeuraLife başka nöron bakım medya kullanımı morfolojik olgun görünmüyor ve kültür sürece hayatta olmayabilir alt hücreleri sağlayabilir.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Arktik kara sincap yetişkin sinir kök hücreleri 500.000-600.000 cells/75mm şişesi numaralı seribaşı için 3 ile 5 gün boyunca her 24 saatte en az iki geçit çift devam edecektir. Bu hücreler basicFGF ve B27 kaldırma ve% 1-2 FBS varlığı ve% 1 İnsülin / Transferrin / Selenyum ile kolayca ayırt edecek ve 14-21 gün içinde TUJ1 (Covance) pozitif nöronların (bkz. Şekil 2) olacak. Toplam hücreleri nöronların oranı% 40-60, kültür yaşına bağlıdır (Şekil 3) arasında değişmektedir. Nöronlar-tohumlama sonrası en az 21 gün ile 12 gün sonrası tohumlama deneyleri için kullanılabilir.

Şekil 1
Şekil 1. AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler yüzey elde.
Poli-L-Ornithine kaplı şişelerde agsNSC bazal medyada büyüme 3 gün sonra AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler Faz yüzey elde. Katlama yaklaşık her 24 saatte bir gerçekleşir. 100X büyütme Foto.

Şekil 2
Şekil 2. Farklılaştırılmış AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler Floresan mikrografı
AGS nöral kök hücreler, sonra sabitleme için önce 17 gün daha Neuralife muhafaza 4 gün, farklılaşma medyaya maruz kaldılar. Hücreler,% 4 paraformaldehid ve Invitrogen TUJ1 birincil antikor (Covance) ve Alexa Fluor 568 sekonder antikoru (yeşil) kullanarak tespit nöronlar ile tespit edildi. Hoechst boyası 33343 tüm çekirdeklerin (mavi) leke eklendi. Hücre sayısı, nöron sayısı ve nöron oranı neurite akıbet Cellomics gelen yazılım ve Arrayscan araç kullanılarak tespit edildi. Bu fotoğraf yaklaşık% 57 nöronlar temsil eder. 10X büyütme

Şekil 3
Şekil 3. Nöron numaraları ve üç Farklılaştırılmış AGS nöral kök hücrelerin Nöron Oranıkültür yaşları
AGS nöral kök hücreler, 12, 15 ve 17 gün önce tespit Neuralife tutulan, daha sonra 4 gün boyunca farklılaşma medyaya maruz kaldılar. Hücreleri sabit ve nöronlar TUJ1 birincil antikor (Covance) ile tespit edilmiştir. Hoechst boyası, toplam hücre tanımlaması için tüm çekirdekleri leke eklendi. Hücre sayısı, nöron sayısı ve yüzde nöron oranı neurite akıbet Cellomics gelen yazılım ve Arrayscan araç kullanılarak tespit edildi. Değerler ortalama 15 kuyu durumu + SD ortalama temsil eder.

Tablo 1: Pasajlanması ve tohumlamada kullanılan Örnek hesaplamalar

  1. 700.000 hücre / ml hücre süspansiyonu
  2. 75.000 hücre / mL ya da 15.000 hücre hücre yoğunluğu başına her kuyuda 0.2 mL hacimde kullanma.
  3. Iyi = 19.2 mL veya istenilen son hacim 21 ml başına 0.2 ml 96 kuyu aşılamak.
  4. ÷ İlk Konsantrasyon (Final Konsantrasyon x Final Cilt) = Başlangıç ​​Cilt
    (21 ml x 75.000 hücre / ml) ÷ 700.000 = 2.25 mL
  5. Cilt hücre süspansiyonu FBS. 2.25 ml = 2.25 ml x 0.05 = 0,1125 ml
  6. FBS hacmi, 21 ml = 21 ml x 0.02 = 0.42 mL gerekli
  7. FBS Farklılaşma Orta eklemek hacmi = 0.42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 ml
  8. Hacmi 2.25 ml hücre süspansiyonu - 0,3075 ml% 5 FBS = 18,44 mL Farklılaşma Orta = 21 mL.
  9. 18,44 mL Farklılaşma Orta 0,308 mL FBS ile birleştirin ve 2.25 ml hücre süspansiyonu ekleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AGS yetişkin sinir kök hücreleri sağlam ve nöral kök hücrelerin çalışması için temel nöral kök hücre özelliklerini mükemmel bir kaynak haline çok sayıda geçişleri için açılabilir. Genişleme oranını yaklaşık iki katına biri her yirmi dört saatte, ancak hücreleri arasındaki temas astrositler farklılaşma lehine olacaktır, çünkü bu hücreler ulaşan izdiham önce geçişli olmalıdır. Bu nedenle, İletişim-aracılı farklılaşma farklılaşma trypsinization ve geçiş öncesinde başlar nöronların toplam hücre sayısı oranının önemli ölçüde düşmesi neden olacaktır. Şekil 1, 24 saat içinde geçişli olması gereken bir AGS nöral kök hücre kültürü göstermektedir.

AGS nöral kök hücrelerinin, poli-L-lisin kaplı Biocoat plakaları kuvvetle yapışır ve FBS hücreleri kaldırma olmadan 90 dakika içinde% 1 oranında azaltılabilir. FBS ve rhFGFbasic kaldırılmış olduğundan, hücreler, yarım nöronlar ve yarım astrositler hakkında ayırt edecektir. Nöronlar TUJ1 pozitif iki hafta içinde (Şekil 2) ve map2-indüksiyon sonrası (NeuraLife Orta kullanıldığı takdirde) üç hafta içinde olumlu. Reseptör ekspresyonu ve olgun nöronların fonksiyonu daha tam karakterizasyonu bekliyor. TUJ1 ve map2 ifade nöronal kaderi taahhüt ama mitotik aktivite 10 korumak nöronal atalarıdır karakteristik.

Hipoksi veya oksijen glikoz mahrumiyet (OGD) 2 ve 3 hafta kültür arasındaki değişiklikleri cevabı. Iken, nöron sayısı, toplam hücrelerine nöron yüzdesi% 50 (Şekil 3) yakın kalır kültür (4 gün farklılaşma ve bakım 12 gün) 16 gün sonra azalabilir. 12 ila 19 gün tohumlama uygulanan Bununla birlikte, hipoksi veya OGD TUJ1 ifade nöronların bu kültürlerde nöron neden olabilir. İndüklenmiş nöron bu hücreler (hazırlık) eşdeğer hakaretlere maruz farklılaştırılmış insan sinir kök hücreleri gözlenen yaralanmaya karşı hangi bir mekanizma gibi görünüyor. AGS nöronal kültürlerin hipoksi ve OGD indüklenen nöron mekanizmalarının daha iyi anlaşılması sınırlı kan dolaşımı ile ilişkili inme, kalp durması ve demans tedavisi için yeni tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JA Kelleher-Andersson Neuronascent kurucusu ve Arktik kara sincap patent başvuruları mucididir. Neuronascent AGS medya ve kök hücreleri satışı üzerinde telif alır. RC McGee, medya ve AGS sinir kök hücrelerinin dağıtır Lifeline, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materyal Komutanlığı hibe # 05178001 ve Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü NS041069-06 tarafından desteklenmiştir. Biz Joel Vonnahme protokol yararlı yorumlar için teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
agsNSC Lifeline Cell Technology FC-0004
agsNSC Expansion kit Lifeline Cell Technology LL-0008 Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com)
agsNSC differentiation kit Lifeline Cell Technology LL-0009 Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com)
NeuraLife maintenance media kit Lifeline Cell Technology LL-0012 Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com)
Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) Hausser Scientific 1490 http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates BD Biosciences 356516 www.bdbiosciences.com
Large orifice pipette tips Fisher Scientific 02-707-141 Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
  2. Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
  3. Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
  4. Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
  5. Christian, S. L. Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).
  6. Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
  7. Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
  8. Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
  9. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
  10. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).

Tags

Nörobilim Sayı 47 Arctic zemin sincap iskemi nöron kış uykusu hoşgörü nöron
Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drew, K. L., McGee, R. C., Wells, M. … More

Drew, K. L., McGee, R. C., Wells, M. S., Kelleher-Andersson, J. A. Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (47), e2199, doi:10.3791/2199 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter