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Neuroscience

और वयस्क hippocampal आर्कटिक ग्राउंड गिलहरी तंत्रिका स्टेम सेल के विकास और भेदभाव

Published: January 7, 2011 doi: 10.3791/2199
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Alaska Basic Neuroscience Program, Institute of Arctic Biology, University of Alaska at Fairbanks, 2Department Biochemistry, Hood College, 3Department of Cell Biology, Neuronascent, Inc., 4Research and Development, Neuronascent, Inc.

Summary

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं वयस्क गैर सुप्तावस्था एक बरस आर्कटिक जमीन गिलहरी (AGS) के हिप्पोकैम्पस से तैयार थे. इन तंत्रिका स्टेम सेल कई मार्ग के माध्यम से विस्तार किया जा सकता है है, भेदभाव और glial संस्कृति के लिए एक लगभग 50:50 न्यूरॉन के रूप में बनाए रखा.

Abstract

आर्कटिक जमीन गिलहरी (Urocitellus parryii, AGS) उनके पास या नीचे एक ठंड एक मुख्य शरीर के तापमान के साथ सीतनिद्रा में होना करने की क्षमता में अद्वितीय हैं. इन जानवरों को भी vivo 2,3 और ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव में 4,5 इन विट्रो में मस्तिष्क में इस्कीमिक चोट का विरोध . इन अद्वितीय गुण प्रोत्साहन प्रदान AGS के न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए अंतर्निहित neuronal विशेषताओं है कि AGS के न्यूरॉन्स की क्षमता चोट और सेल ischemia के कारण मौत और बेहद ठंडे तापमान का विरोध करने के लिए खाते सकता है की जांच. पहचान प्रोटीन या जीन लक्ष्य है कि इन कोशिकाओं के विशिष्ट गुणों के लिए अनुमति देते हैं इस्कीमिक संकेत के एक नंबर के लिए और ठंडे सहिष्णुता के अध्ययन के लिए प्रभावी उपचार की खोज में सहायता कर सकते हैं. प्रौढ़ AGS हिप्पोकैम्पस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं है कि पैदा करना जारी रखने के होते हैं, इन स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति में आसान विस्तार के लिए अनुमति देता है. हम यहाँ जिसके द्वारा शोधकर्ताओं प्रयोजनों के किसी भी संख्या के लिए इन स्टेम कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन्स का उपयोग कर सकते हैं तरीकों का वर्णन. बारीकी से इन चरणों का पालन करके AGS तंत्रिका स्टेम सेल दो या अधिक मार्ग के माध्यम से विस्तार किया जा सकता है और फिर एक विभाजित कोशिकाओं की संख्या कम से कम जहरीले रसायनों का उपयोग करने के लिए बिना TUJ1 पॉजिटिव न्यूरॉन्स (~ 50%) में उच्च संस्कृति के लिए विभेदित. Ischemia neurogenesis के 6 और neurogenesis जो MEK / ERK और PI3K/Akt अस्तित्व संकेत रास्ते vivo में 7 और 8 इन विट्रो (Kelleher एंडरसन, आकर्षित एट अल. तैयारी में) में ischemia के प्रतिरोध के लिए योगदान देता है के माध्यम से आय लाती है. इसके अलावा इन अद्वितीय तंत्रिका कोशिकाओं के लक्षण वर्णन कई मोर्चों पर अग्रिम, कुछ या सभी इन तरीकों के उपयोग कर सकते हैं.

Protocol

1. AGS तंत्रिका स्टेम सेल और मीडिया तैयार

  1. वयस्क hippocampal आर्कटिक जमीन गिलहरी (AGS) तंत्रिका स्टेम तरीके से अलग कोशिकाओं पहले 9 वर्णित अब cryopreserved शीशियों के रूप में व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है. कक्ष रातोंरात अछूता सूखी करने के लिए सुनिश्चित है कि कोशिकाओं को एक cryopreserved राज्य में रहते हैं बर्फ युक्त संकुल में भेज रहे हैं. अखंडता बनाए रखने के लिए, खोलना -150 की तुलना में कम पर रसीद और दुकान पर तुरंत कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, या एक तरल नाइट्रोजन देवर की भाप चरण में है.
  2. AgsNSC बेसल मध्यम तैयार + 95 एमएल agsNSC बेसल मध्यम 5 एमएल FBS (LS-1012) जोड़ने के द्वारा 5% FBS
  3. 500 μL बी 27 अनुपूरक (Invitrogen) 50 एमएल agsNSC बेसल मध्यम जोड़कर agsNSC विस्तार मध्यम तैयार. 1ml aliquots उपयोग करें जब तक और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान में B27 के शेष फूट डालो.
  4. AgsNSC बेसल मध्यम के गर्म 25 एमएल + 5% FBS और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में agsNSC विस्तार मध्यम के 20 एमएल.
  5. पाली एल ओर्निथिन के साथ विस्तार के लिए इस्तेमाल किया कोट बोतल
    1. पाली एल ओर्निथिन (10 μg / एमएल) काम कर समाधान पहले गला लें. 2-8 के बीच समाधान स्टोर डिग्री सेल्सियस के लिए एक एक बार thawed महीने.
    2. एक दिए फ्लास्क टी 75 के लिए 8 एमएल पाली एल ओर्निथिन काम कर समाधान जोड़ें और कुप्पी की संपूर्ण संस्कृति की सतह पर समान रूप से समाधान वितरित. (अन्य संस्कृति वाहिकाओं है कि 0.5 का प्रयोग करें इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए काम कर समाधान की राशि को समायोजित करें. 1.0 एमएल पाली एल ओर्निथिन 10 सेमी 2 संस्कृति की सतह के प्रति काम कर समाधान)
    3. 37 ° C पर 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए बोतल का सेते हैं. (जोडी सीओ 2 के बिना एक मशीन का प्रयोग पाली एल ओर्निथिन लेपित संस्कृति वाहिकाओं के ऊष्मायन के लिए पसंद है.) लेपित बोतल इनक्यूबेटर में दो सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है है अप करने के लिए.
    4. पहले का उपयोग करने के लिए, कुप्पी से पाली - एल - ओर्निथिन काम समाधान aspirate और बाँझ टिशू कल्चर ग्रेड पानी के साथ दो बार धोने. Aspirate तरल जब तक फ्लास्क उपयोग करने से पहले लगभग सूखी है.
  6. देवर से एक शीशी निकालें और जाँच करें कि शीशी टोपी सील सुरक्षित है. एक 37 लगभग 60-90 सेकंड के लिए या डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी के नीचे आधा छोड़ने शीशी के ऊपर पकड़ो जब तक शीशी लगभग पूरी तरह thawed है, बर्फ की एक छोटी राशि अभी भी दिखाई जानी चाहिए. संभावित संक्रमण से बचने के लिए, पानी की शीशी टोपी बाहर रखने. पिघलना से अधिक मत करो, के रूप में ऐसा करने की कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है.
  7. 70% इथेनॉल या isopropanol के साथ शीशी के बाहरी स्प्रे, तो एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में शीशी जगह है. संदूषण या छींटे से बचने टोपी ध्यान से निकालें.
  8. धीरे शीशी में agsNSC बेसल मीडिया के 1 एमएल + 5% FBS जोड़ने एक बाँझ पिपेट का उपयोग करके कक्षों फिर से निलंबित. गर्म agsNSC बेसल मध्यम के 25 एमएल फिर से निलंबित कर दिया कोशिकाओं स्थानांतरण में 5% + 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब FBS.
  9. पतला सेल निलंबन के साथ क्रायो शीशी एक बार कुल्ला. 6 मिनट के लिए 150 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रत्येक व्यक्ति अपकेंद्रित्र प्रकार के लिए गति की गणना.
  10. जबकि कोशिकाओं नीचे कताई रहे हैं, सूखी पाली एल ओर्निथिन लेपित टी 75 फ्लास्क agsNSC विस्तार मध्यम की 10 एमएल जोड़ने और FGF-बुनियादी आरएच (40ng/mL) के 40 μL जोड़ें. Centrifugation के बाद, aspirate सतह पर तैरनेवाला ख्याल रख रही करने के लिए गोली aspirate नहीं द्रव. AgsNSC विस्तार मध्यम की 10 एमएल में कोशिकाओं पुनः निलंबित. AgsNSC विस्तार मध्यम में T-75 फ्लास्क में मीडिया में फिर से निलंबित कर दिया कोशिकाओं स्थानांतरण.
  11. धीरे संस्कृति पोत पक्ष साइड चट्टान के समान रूप से पोत के भीतर कोशिकाओं वितरित.
  12. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में स्थान वरीयता प्राप्त संस्कृति पोत. कक्ष फ्लास्क के लिए देते हैं और बोने के दो घंटे के भीतर प्रक्रियाओं फार्म शुरू करना चाहिए. यदि कोशिकाओं को अस्थायी रहना और मध्यम भीतर balled, तो 5% FBS में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और ताजा मध्यम और कुप्पी के साथ 1.8-1.10 कदम चला.

2. AgsNSC का विस्तार

  1. विगलन और कोशिकाओं बोने के बाद दो दिनों (~ 48 घंटे), एक पूर्ण माध्यम प्रतिस्थापन agsNSC विस्तार मध्यम के 20 एमएल प्लस FGF बुनियादी आरएच के एक 40 μL स्पाइक का उपयोग किया जाना चाहिए.
  2. अगले दिन टीका पर FGF बुनियादी आरएच 40 μL के साथ स्पाईक बोतल. कोशिकाओं के लिए जब वे टीका के बाद तीसरे या चौथे दिन के 75-80% संगम तक पहुँच चुके हैं trypsinize के लिए तैयार हो जाएगा. टीकाकरण के बाद चार दिनों से अधिक समय के लिए संवर्धन undifferentiated स्टेम कोशिकाओं क्योंकि अब ऊष्मायन कोशिकाओं को न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स के लिए अंतर trypsinization द्वारा चरण 3 के दौरान घायल हो सकता है शुरू करने के लिए अनुमति देगा करने के लिए अनुशंसित नहीं है. FGF-बुनियादी आरएच 4 ° C पर भंडारित किया जा सकता है और एक सप्ताह के लिए अभी भी गतिविधि को बनाए रखने. आरएच FGF-बुनियादी भी एक अतिरिक्त / -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज पिघलना के माध्यम से जाने के लिए अगर और अधिक समय की जरूरत है सकते हैं.

3. कक्षों की Trypsinization

  1. agsNSC टीका के बाद 3 से 4 दिनों के passaged होना चाहिए. Passaging अगर agsNSC फिर से विस्तार किया जाएगा से पहले 24 घंटे और एक सप्ताह के बीच एक पाली एल ओर्निथिन लेपित फ्लास्क तैयार.
  2. Aspirateसंस्कृति पोत से मध्यम. 0.05% की 2.5 एमएल जोड़ें Trypsin/0.02% सतह क्षेत्र के प्रत्येक 75 2 सेमी के लिए जहाज के लिए EDTA (मुख्यमंत्री 0017) . धीरे भंवर सभी कक्षों को सुनिश्चित करने trypsin / EDTA के साथ लेपित हैं. कक्ष आम तौर पर 60 सेकंड के भीतर की सतह से अलग शुरू हो, कोशिकाओं के संगम पर निर्भर करता है. Trypsinize अधिक मत करो, के रूप में ऐसा करने की कोशिकाओं को नुकसान होगा. धीरे कई पक्षों से संस्कृति पोत दोहन टुकड़ी को प्रोत्साहित करेंगे.
  3. एक बार कोशिकाओं अलग हो, agsNSC बेसल मध्यम की 10 एमएल जोड़ + फ्लास्क के लिए 5% FBS. धीरे trypsin समाधान के सभी सुनिश्चित ज़ुल्फ़ निष्प्रभावी है. सड़न रोकनेवाला प्रयोगशाला तकनीकों का प्रयोग, एक बाँझ अपकेंद्रित्र agsNSC बेसल मध्यम 5% FBS के 10 एमएल युक्त ट्यूब में कोशिकाओं विंदुक. फ्लास्क agsNSC बेसल मध्यम के एक अतिरिक्त 10 एमएल के साथ फिर से धोने से दोहराएँ + 5% FBS और पहली धोने के साथ गठबंधन.
  4. 150 XG में 6 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के रूप में ऊपर वर्णित है. Centrifugation के बाद, कोशिकाओं को एक स्वच्छ ढीले गोली फार्म चाहिए. निष्प्रभावी और अपकेंद्रित्र ट्यूब से trypsin मध्यम Aspirate और धीरे से ऊपर pipetting और नीचे एक 10 एमएल विंदुक के साथ 2X द्वारा 10 एमएल में फिर से निलंबित सेल गोली (प्रति फ्लास्क टी -75) पूर्व गर्म agsNSC बेसल मध्यम + 5% FBS. एक सेल गिनती के रूप में नीचे वर्णित प्रदर्शन.

4. प्रकोष्ठों के चढ़ाना के लिए मानक गणना

  1. सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग, भंवर सेल निलंबन और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण सेल निलंबन के 15 μL. 0.4% Trypan ब्लू के 15 μL जोड़ें. धीरे मिश्रण और एक उज्ज्वल रेखा गिनती चैंबर (# 1490 सूची: Hausser वैज्ञानिक के रूप में एक स्वच्छ hemacytometer के कक्षों में से प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 10 μL लोड http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
  2. Hemacytometer पर 4 quadrants की एक न्यूनतम की गणना. नीले रंग की कोशिकाओं है कि Trypan ब्लू के लिए सकारात्मक रहे हैं मर चुके हैं और नहीं गिना जाना चाहिए. सही कोशिकाओं की गिनती के लिए, वृत्त का चतुर्थ भाग प्रति कोशिकाओं के इष्टतम संख्या 25-75 कोशिकाओं किया जाना चाहिए.
  3. कोशिकाओं की गिनती करने के बाद, 4 quadrants के औसत की गणना. 10,000 और कमजोर पड़ने कारक द्वारा कोशिका गिनती औसत गुणा (2 अगर सिफारिश की मात्रा का उपयोग) एमएल प्रति कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए. ध्यान दें कि अगर कुल प्रतिशत व्यवहार्यता कम से कम 92% है वहाँ कारणों की एक संख्या हो सकता है. कम व्यवहार्यता के लिए एक कारण trypsinization से अधिक हो सकता है, पहले FBS साथ बेअसर trypsin सकता है. एक अन्य कारण हो सकता है कि सीरम एकाग्रता trypsin (FBS) बहुत कम है और कोशिकाओं को trypsinized होना जारी है. तीसरा, कोशिकाओं को भी मिला हुआ किया गया है सकते हैं, जिससे स्टेम सेल सेल सेल से संपर्क की वजह से अंतर करने के लिए, trypsinization के दौरान चोट करने के लिए अग्रणी. यदि इस विधि को बारीकी से पीछा किया है 3 या उससे अधिक दोहरीकरण की उपज है, उम्मीद की जा सकती है> ५,००,००० ~ के एक प्रारंभिक संख्या से 4,000,000 कोशिकाओं की आबादी दे.

5. एक और विस्तार फ्लास्क का टीका

  1. एक पोत को टीका लगाना करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए, inoculated हो पोत की सतह क्षेत्र (2 सेमी में) द्वारा वांछित बोने घनत्व (2 सेमी प्रति ६६०० कोशिकाओं या T- 75 फ्लास्क प्रति 500,000 कोशिकाओं) गुणा. यदि एक से अधिक पोत inoculating जहाजों की कुल संख्या से पोत प्रति कोशिकाओं की संख्या गुणा. सेल करने के लिए प्रत्येक पोत की टीका लगाना आवश्यक निलंबन की मात्रा (एमएल) का निर्धारण करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन में की संख्या के द्वारा एक पोत टीका लगाना आवश्यक कोशिकाओं की संख्या में विभाजित. यदि एक से अधिक पोत inoculating inoculated हो वाहिकाओं की कुल संख्या से एक पोत के लिए आवश्यक मात्रा से गुणा करके की जरूरत सेल निलंबन की कुल मात्रा की गणना.
  2. AgsNSC बेसल मध्यम में कक्षों की वांछित मात्रा + 5% FBS अपकेंद्रित्र, एक ढीला गोली छोड़ने. आम तौर पर 500.000 कोशिकाओं agsNSC बेसल मध्यम 5% FBS के रूप में पहले वर्णित में 25 एमएल की कुल मात्रा के लिए लाया जाता है. तरल Aspirate और agsNSC विस्तार मध्यम यह अतिरिक्त centrifugation कदम टीका पहले FBS हटायें आवश्यक है के 10 एमएल में ढीली गोली फिर से निलंबित. फ्लास्क टी-75 के लिए पूर्व गर्म agsNSC विस्तार मध्यम के 10 एमएल जोड़ें. फ्लास्क टी-75 resuspended सेल निलंबन के 10 एमएल जोड़ें तो फ्लास्क FGF-बुनियादी आरएच के 40 μL जोड़ें. विचार है कि trypsinization और टीका 1.5 घंटे से कोई अब ले जब बोतल की अधिकतम संख्या तय करने के लिए किसी एक समय में साथ काम करना चाहिए. एक भी पूरा मीडिया परिवर्तन के लिए पर्याप्त मीडिया अगर कई बोतल का उपयोग करना चाहिए.
  3. धीरे पक्ष की ओर से फ्लास्क रॉक करने के लिए समान रूप से वितरित कोशिकाओं और एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 मशीन, के रूप में पहले वर्णित संस्कृति वाहिकाओं में जगह.

6. प्रकोष्ठों के भेदभाव के लिए खैर प्लेट्स की टीका के लिए कमजोर पड़ने

  1. बहु अच्छी तरह से किसी भी प्रारूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन बी.डी. Biocoat पाली एल lysine लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें में टीका डेस हैयहाँ cribed. सेल कुओं की संख्या गुणा अच्छी तरह से प्रति 0.2 एमएल द्वारा एक 96 बहु - अच्छी तरह से थाली के लिए inoculated द्वारा अपने प्रयोग के लिए आवश्यक निलंबन की मात्रा का निर्धारण और लगभग 10% जोड़ने के लिए टीका के दौरान मात्रा में किसी भी नुकसान को कवर. 75,000 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व के कमजोर पड़ने की गणना. भेदभाव को मध्यम पर जोड़ा जा करने के लिए 2% FBS की अंतिम एकाग्रता (तालिका 1) प्राप्त करने के FBS की राशि का निर्धारण करते हैं. FBS और भेदभाव मध्यम मिक्स. ध्यान से FBS के साथ भेदभाव मध्यम की गणना की मात्रा के साथ कोशिकाओं मिश्रण. (ध्यान दें: centrifugation के दौरान कोशिकाओं agsNSC बेसल मध्यम में रहे हैं + 5% FBS जबकि FBS centrifugation के दौरान कोशिकाओं की रक्षा और कोशिका आसंजन FBS रोकता differention सुविधा 2% FBS गिराए बहु - अच्छी तरह से सतह पर कोशिकाओं के आसंजन की अनुमति देगा.. 2% FBS तो आगे पतला है भेदभाव को बढ़ावा देने के इंसुलिन transferrin - सेलेनियम (इसके ई) भी भेदभाव भेदभाव को बढ़ावा देने के मध्यम में शामिल है.
  2. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एक बाँझ combitip जलाशय से एक पाली - एल lysine लेपित 96 अच्छी तरह से एक विंदुक मल्टी चैनल और बड़े छिद्र सुझावों का उपयोग कर प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह पतला सेल निलंबन के 200 उल बग़ैर. 37 में 1.5-2 घंटे के लिए प्लेटें सेते ° सी, 5% सीओ 2. बाद कोशिकाओं संलग्न है, के बारे में 90 से 120 मिनट के बाद, ध्यान से 50% को दूर (96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए μL 100) मध्यम के प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग बड़े छिद्र विंदुक युक्तियाँ से. ध्यान से गर्म agsNSC भेदभाव मध्यम के साथ हटाया मात्रा की जगह फिर से बड़े छिद्र विंदुक युक्तियाँ का उपयोग कर. (मानक छिद्र सुझावों का प्रयोग कोशिकाओं को घायल कर सकते हैं).
  3. टीका के दो दिन बाद (~ 48 घंटे), 50% मध्यम agsNSC भेदभाव मध्यम और बड़े छिद्र विंदुक युक्तियाँ का उपयोग परिवर्तन करने.

7. न्यूरॉन्स का रखरखाव

  1. Neuronal रखरखाव निर्देशों के अनुसार NeuraLife glutamine, और B27 का उपयोग मध्यम तैयार. Neuronal रखरखाव मध्यम साप्ताहिक तैयार रहना चाहिए.
  2. पिछले agsNSC भेदभाव मध्यम बदलने के लिए, सामान्य दिवस 4 पोस्ट टीका के दो दिन बाद, 50% मध्यम प्रतिस्थापन Neuronal रखरखाव मध्यम का उपयोग करते हैं.
  3. 50% मध्यम Neuronal रखरखाव मध्यम का उपयोग कर हर 2 से 3 दिनों के प्रतिस्थापन प्रदर्शन जारी रखें. Neuronal प्रक्रियाओं Neuronal रखरखाव मध्यम करने के लिए बदलने के कुछ दिनों के भीतर प्रकट करना चाहिए. कोशिकाओं Neuronal रखरखाव मध्यम करने के लिए हस्तांतरित किया जा रहा 3 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए. न्यूरॉन्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध neuronal मार्करों के एक नंबर का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. Astrocytes भी हमेशा मनाया जाएगा.
  4. संस्कृति आबादी आम तौर पर कुल सेल नंबर के लिए न्यूरॉन्स की एक 40% से अधिक अनुपात व्यक्त करते हैं. न्यूरॉन रखरखाव NeuraLife की तुलना में अन्य मीडिया के उपयोग के अवर कोशिकाओं है कि आकृति विज्ञान के परिपक्व नहीं लग रही है और जीवित रहने के रूप में लंबे समय के रूप में संस्कृति में नहीं हो सकता है प्रदान कर सकता है.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

आर्कटिक जमीन गिलहरी वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के कम से कम दो मार्ग के लिए 3 से 5 दिनों के लिए हर 24 बजे जब 500,000-600,000 cells/75mm फ्लास्क पर वरीयता प्राप्त डबल करने के लिए जारी रहेगा. इन कोशिकाओं को basicFGF और B27 के हटाने और 1-2% FBS की उपस्थिति और 1% इंसुलिन / / transferrin सेलेनियम के साथ आसानी से अंतर जाएगा और TUJ1 14-21 दिनों के भीतर (Covance) सकारात्मक न्यूरॉन्स (देखें चित्र 2) हो जाएगा. कुल कोशिकाओं को न्यूरॉन्स के अनुपात 40-60%, संस्कृति की उम्र पर निर्भर (चित्रा 3) के बीच लेकर जाएगा. न्यूरॉन्स - बोने के बाद कम से कम 21 दिनों के माध्यम से 12 के बाद बोने दिनों से प्रयोग के लिए उपयोग किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. AGS वयस्क hippocampal तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के photomicrograph.
AGS वयस्क hippocampal तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पाली एल ओर्निथिन लेपित बोतल में agsNSC बेसल मीडिया में विकास के 3 दिनों के बाद के चरण photomicrograph. दोहरीकरण लगभग हर 24hrs होता है. 100X बढ़ाई फोटो.

चित्रा 2
चित्रा 2. विभेदित AGS वयस्क hippocampal तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रतिदीप्त माइक्रोग्राफ
AGS तंत्रिका स्टेम सेल 4 दिन, फिर फिक्सिंग के पहले 17 अधिक दिनों के लिए Neuralife में बनाए रखा के लिए भेदभाव मीडिया के अधीन थे. कक्ष में 4% paraformaldehyde और Invitrogen से TUJ1 प्राथमिक एंटीबॉडी (Covance) और एलेक्सा Fluor 568 माध्यमिक एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग पहचान की न्यूरॉन्स के साथ तय किया गया. Hoechst 33343 डाई सभी नाभिक (नीला) दाग जोड़ा गया है. सेल नंबर, न्यूरॉन संख्या और न्यूरॉन अनुपात neurite परिणाम सॉफ्टवेयर और Cellomics से Arrayscan साधन का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. इस तस्वीर में लगभग 57% न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करता है. 10X बढ़ाई

चित्रा 3
चित्रा 3. न्यूरॉन संख्या और विभेदित AGS तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के तीन न्यूरॉन अनुपातसंस्कृति उम्र
AGS तंत्रिका स्टेम सेल 4 दिनों के लिए भेदभाव मीडिया के अधीन थे, तब फिक्सिंग के पहले 12, 15 और 17 दिनों के लिए Neuralife में बनाए रखा. कक्ष तय थे और न्यूरॉन्स TUJ1 प्राथमिक एंटीबॉडी (Covance) के साथ की पहचान की. Hoechst डाई कुल सेल की पहचान के लिए सभी नाभिक दाग जोड़ा गया है. सेल नंबर, न्यूरॉन संख्या और प्रतिशत न्यूरॉन अनुपात neurite परिणाम सॉफ्टवेयर और Cellomics से Arrayscan साधन का उपयोग कर निर्धारित किया गया है. मान हालत प्रति 15 कुओं + एसडी के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं.

टेबल 1 नमूना passaging और बोने में प्रयुक्त गणना

  1. 700.000 कोशिकाओं / एमएल सेल निलंबन का प्रयोग
  2. 75,000 कोशिकाओं / एमएल या +१५,००० कोशिकाओं का एक सेल घनत्व प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक कुएं में 0.2 एमएल मात्रा का उपयोग करना.
  3. अच्छी तरह = 19.2 एमएल या इच्छित अंतिम मात्रा 21 एमएल प्रति 0.2 एमएल में 96 कुओं inoculating.
  4. (अंतिम एकाग्रता एक्स अंतिम वॉल्यूम) ÷ प्रारंभिक एकाग्रता = प्रारंभिक वॉल्यूम
    (21 एमएल x 75,000 कोशिकाओं / एमएल) ÷ सात लाख = 2.25 एमएल
  5. FBS की सेल निलंबन में वॉल्यूम. एमएल 2.25 = 2.25 एमएल एक्स = 0.1125 एमएल 0.05
  6. FBS के वॉल्यूम में 21 एमएल = 21 एमएल 0.02 x = 0.42 एमएल की जरूरत
  7. FBS की मात्रा भेदभाव मध्यम जोड़ने = 0.42 एमएल - ०.१,१२५ एमएल = ०.३०७५ एमएल
  8. 2.25 एमएल सेल निलंबन - .३०७५ एमएल 5% FBS = 18.44 एमएल भेदभाव मध्यम = 21 एमएल के वॉल्यूम.
  9. 0.308 एमएल FBS के साथ 18.44 एमएल भेदभाव मध्यम मिश्रण है और सेल निलंबन के 2.25 एमएल जोड़ें.

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Discussion

AGS वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को मजबूत कर रहे हैं और कई मार्ग उन्हें बुनियादी तंत्रिका स्टेम सेल गुणों के अध्ययन के लिए एक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के उत्कृष्ट स्रोत बनाने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. विस्तार की दर लगभग एक दोहरीकरण हर घंटे चौबीस है, लेकिन इन कोशिकाओं तक पहुँचने के संगम से पहले passaged होना चाहिए क्योंकि कोशिकाओं के बीच संपर्क भेदभाव astrocytes के लिए एहसान होगा. संपर्क की मध्यस्थता भेदभाव इसलिए न्यूरॉन्स की कुल सेल नंबर अनुपात नाटकीय रूप से ड्रॉप करने के लिए, यदि भेदभाव trypsinization और बीतने से पहले शुरू होता है कारण होगा. चित्रा 1 AGS तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति है कि 24 घंटे के भीतर passaged होना चाहिए दिखाता है.

AGS तंत्रिका स्टेम सेल पाली एल Lysine लेपित Biocoat प्लेटों के लिए दृढ़ता से पालन और FBS 1% के लिए 90 मिनट के भीतर कोशिकाओं उठाने के बिना कम किया जा सकता है. के रूप में FBS और rhFGFbasic हटा रहे हैं, कोशिकाओं को आधा न्यूरॉन्स और आधा astrocytes के बारे में अंतर होगा. न्यूरॉन्स (चित्रा 2) दो सप्ताह के भीतर TUJ1 सकारात्मक हो, और MAP2 बाद प्रेरण (अगर NeuraLife मध्यम प्रयोग किया जाता है) में तीन सप्ताह के भीतर सकारात्मक. रिसेप्टर अभिव्यक्ति और परिपक्व न्यूरॉन्स के समारोह के एक अधिक संपूर्ण लक्षण वर्णन लंबित है. TUJ1 और MAP2 अभिव्यक्ति neuronal progenitors कि एक neuronal भाग्य के लिए प्रतिबद्ध हैं, लेकिन बनाए रखने mitotic गतिविधि 10 की विशेषता है.

Hypoxia या ऑक्सीजन ग्लूकोज (OGD) अभाव संस्कृति में 2 और 3 सप्ताह के बीच परिवर्तन के लिए उत्तर. हालांकि, न्यूरॉन्स की संख्या संवर्धन (भेदभाव के 4 दिन और रखरखाव के 12 दिनों) के 16 दिनों के कुल कोशिकाओं को न्यूरॉन्स की प्रतिशतता 50% (चित्रा 3) के पास रहता है के बाद कम हो सकती है. बहरहाल hypoxia, या OGD 12 से 19 दिनों के बाद बोने पर लागू TUJ1 व्यक्त न्यूरॉन्स की इन संस्कृतियों में neurogenesis पैदा कर सकते हैं. प्रेरित neurogenesis के लिए एक व्यवस्था है जिसके द्वारा इन कोशिकाओं विभेदित मानव तंत्रिका स्टेम बराबर अपमान (तैयारी में) को उजागर कोशिकाओं में मनाया चोट विरोध प्रतीत होता है. AGS neuronal संस्कृतियों में hypoxia और OGD प्रेरित neurogenesis के तंत्र की बेहतर समझ स्ट्रोक, हृदय की गिरफ्तारी और पागलपन सीमित रक्त की आपूर्ति के साथ जुड़े इलाज के लिए उपन्यास के उपचारों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

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Disclosures

जावेद Kelleher - Andersson Neuronascent के संस्थापक है और आर्कटिक जमीन गिलहरी पेटेंट आवेदनों पर आविष्कारक है. Neuronascent AGS मीडिया और स्टेम सेल की बिक्री पर रॉयल्टी प्राप्त है. आर.सी. McGee लाइफलाइन इंक है, जो मीडिया और AGS तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को वितरित द्वारा नियोजित है.

Acknowledgments

यह काम अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान # अनुदान 05178001 और स्नायविक विकारों और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान से NS041069-06 द्वारा समर्थित किया गया. हम प्रोटोकॉल पर उपयोगी टिप्पणी के लिए योएल Vonnahme धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
agsNSC Lifeline Cell Technology FC-0004
agsNSC Expansion kit Lifeline Cell Technology LL-0008 Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com)
agsNSC differentiation kit Lifeline Cell Technology LL-0009 Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com)
NeuraLife maintenance media kit Lifeline Cell Technology LL-0012 Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com)
Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) Hausser Scientific 1490 http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates BD Biosciences 356516 www.bdbiosciences.com
Large orifice pipette tips Fisher Scientific 02-707-141 Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com

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References

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तंत्रिका विज्ञान 47 अंक आर्कटिक जमीन गिलहरी ischemia neurogenesis सीतनिद्रा सहिष्णुता न्यूरॉन
और वयस्क hippocampal आर्कटिक ग्राउंड गिलहरी तंत्रिका स्टेम सेल के विकास और भेदभाव
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Drew, K. L., McGee, R. C., Wells, M. … More

Drew, K. L., McGee, R. C., Wells, M. S., Kelleher-Andersson, J. A. Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (47), e2199, doi:10.3791/2199 (2011).

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