Summary
Neurala stamceller var beredda från hippocampus hos vuxna icke-ide ettåring arktiska marken ekorrar (AGS). Dessa neurala stamceller kan utökas genom många passager, differentierade och bevaras som ett nästan 50:50 neuron till gliaceller kultur.
Abstract
Arctic marken ekorrar (Urocitellus parryii, AGS) är unika i sin förmåga att övervintra med en kroppstemperaturen nära eller under fryspunkten 1. Dessa djur motstå även ischemisk skada i hjärnan in vivo 2,3 och syre-glukos deprivation in vitro 4,5. Dessa unika egenskaper som en impuls att isolera AGS nervceller att undersöka inneboende neuronala egenskaper som skulle kunna förklara förmåga AGS nervceller att motstå skador och celldöd som orsakas av ischemi och extremt låga temperaturer. Identifiera proteiner eller mål gen som gör det möjligt att särskiljande egenskaper av dessa celler skulle kunna stöd i upptäckten av effektiva behandlingar för ett antal ischemisk indikationer och för studiet av köld tolerans. Vuxen AGS hippocampus innehåller neurala stamceller som fortsätter att föröka sig, vilket möjliggör enkel expansion av dessa stamceller i kultur. Vi beskriver här metoder som forskare kan använda dessa stamceller och differentierade nervceller för många ändamål. Genom att noga följa dessa steg AGS neurala stamceller kan utökas genom två passager eller mer och sedan differentieras till en kultur hög TUJ1-positiva nervceller (~ 50%) utan att använda giftiga kemikalier för att minimera antalet delande celler. Ischemi inducerar neurogenes 6 och neurogenes som utgår via MEK / ERK och PI3K/Akt överlevnad signalvägar bidrar till ischemi motstånd in vivo 7 och in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al. Under utarbetande). Ytterligare karakterisering av dessa unika neurala celler kan utvecklas på många fronter, med hjälp av några eller alla av dessa metoder.
Protocol
1. AGS Neurala stamceller och media förberedelse
- Vuxen hippocampus Arctic jordekorre (AGS) neurala stamceller isoleras på ett sätt som tidigare beskrivits 9 kan nu erhållas kommersiellt frysförvarade injektionsflaskor. Cellerna levereras över natten i isolerade förpackningar som innehåller torris för att säkerställa att cellerna kvar i en frysförvarade tillstånd. För att behålla integritet, packa upp cellerna omedelbart efter mottagandet och förvara vid lägre än -150 ° C, eller i gasfasen av en flytande kväve Dewar.
- Förbered agsNSC bassubstratets + 5% FBS genom att tillsätta 5 ml FBS (LS-1012) till 95 ml agsNSC bassubstratets
- Förbered agsNSC Expansion medium genom att tillsätta 500 mikroliter B-27 Supplement (Invitrogen) till 50 ml agsNSC bassubstratets. Fördela resten av B27 i 1 mL alikvoter och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Värm 25 ml agsNSC bassubstratets + 5% FBS och 20 ml agsNSC Expansion Medium i ett 37 ° C vattenbad.
- Coat flaskor används för expansion med poly-L-Ornithine
- Tina poly-L-Ornithine (10 mikrogram / ml) arbetar lösning. Förvara lösningen mellan 2-8 ° C i upp till en månad efter tinats.
- Lägg till 8 ml poly-L-Ornithine fungerande lösning till en portad T-75 kolv och jämnt fördela lösningen över hela kulturen yta i kolven. (Justera mängden fungerande lösning för andra odlingskärl som kan användas Använd 0,5 -.. 1,0 mL poly-L-Ornithine brukslösning per 10 cm 2 kulturen yta)
- Inkubera flaskor vid 37 ° C under minst 24 timmar. (Användning av en inkubator utan tillsats av CO 2 är att föredra för inkubation av poly-L-Ornithine belagda odlingskärl.) Bestruket kolvar kan lagras i upp till två veckor i kuvös.
- Före användning, aspirera poly-L-Ornithine fungerande lösning från kolven och tvätta två gånger med sterilt kultur årskurs vatten. Aspirera vätska tills kolven är nästan torrt före användning.
- Ta en flaska från Dewar och kontrollera att flaskans lock är ordentligt förseglad. Håll i toppen av flaskan lämnar nedre halvan av flaskan i en 37 ° C vattenbad i ca 60-90 sekunder eller tills flaskan är nästan helt tinade, en liten mängd is fortfarande bör vara synliga. För att undvika eventuella föroreningar, hålla flaskan locket ur vattnet. Inte över tö, eftersom detta kan skada cellerna.
- Spraya utsidan av flaskan med 70% etanol eller isopropanol, placera flaskan i ett biologiskt säkerhetsskåp. Ta bort locket försiktigt för att undvika föroreningar eller splatter.
- Försiktigt återsuspendera cellerna i flaskan genom att tillsätta 1 mL av agsNSC Basal medier + 5% FBS hjälp av en steril pipett. Överför resuspenderas celler till 25 ml varmt agsNSC bassubstratets + 5% FBS i en 50 ml centrifugrör.
- Skölj Cryo-flaskan en gång med utspädd cellsuspension. Centrifugera cellerna vid 150 xgi 6 minuter. För bästa resultat, beräkna hastigheten för varje enskild centrifug typ.
- Medan cellerna snurrar ner, tillsätt 10 ml agsNSC Expansion Medium till den torra poly-L-Ornithine belagda T-75 och tillsätt 40 mikroliter av RH FGF-basic (40ng/mL). Efter centrifugering, aspirera supernatanten noga med att inte aspirera pelleten. Återsuspendera cellerna i 10 ml agsNSC Expansion Medium. Överför resuspenderas celler i agsNSC Expansion Medium i medierna i T-75 kolven.
- Skaka kultur fartygets sida till sida för att fördela celler i kärlet.
- Placera seedad kultur fartyget i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator. Celler bör fästa till kolven och börja bilda processer inom två timmar efter sådd. Om cellerna förblir flytande och balled upp inom mediet, centrifugera celler i 5% FBS och kör steg från 1,8 till 1,10 med nya medium och kolv.
2. Utbyggnad av AgsNSC
- Två dagar (~ 48 timmar) efter upptining och sådd cellerna bör en fullständig medelstora ersättare utföras med 20 mL agsNSC Expansion Medium plus en 40 mikroliter spik av RH FGF-basic.
- Spike kolvar med 40 mikroliter av RH FGF-basic dagen efter ympningen. Cellerna kommer att vara redo att trypsinize när de har nått 75-80% sammanflödet av den tredje eller fjärde dagen efter ympningen. Odling den odifferentierade stamceller under längre tid än fyra dagar efter inokulationen rekommenderas inte eftersom längre inkubationstid kommer att tillåta celler att börja differentiera till nervceller och nervceller kan skadas av trypsinization under steg 3. RH FGF-basic kan lagras vid 4 ° C i upp till en vecka och ändå bibehålla aktivitet. RH FGF-basic kan också gå igenom en extra frys / tö vid -20 ° C om det behövs mer tid.
3. Trypsinization Celler
- agsNSC bör passerats 3 till 4 dagar efter ympning. Förbered en poly-L-Ornithine belagd kolv mellan 24 timmar och en vecka före passaging om agsNSC kommer att byggas ut igen.
- Aspireramedium från den kultur fartyget. Tillsätt 2,5 mL 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) till fartyget för varje 75 cm 2 yta. Rotera flaskan försiktigt för att se alla celler är belagda med Trypsin / EDTA. Celler börjar normalt att lossna från ytan inom 60 sekunder, beroende på sammanflödet av celler. Inte över trypsinize kommer eftersom detta skadar cellerna. Knacka försiktigt på kulturen fartyget från flera sidor kommer att uppmuntra avskildhet.
- När cellerna lossnat, tillsätt 10 ml agsNSC bassubstratets + 5% FBS till kolven. Snurra försiktigt för att se alla trypsin lösningen neutraliseras. Med aseptisk laboratorietekniker, pipett cellerna i en steril centrifugrör innehållande 10 ml agsNSC bassubstratets 5% FBS. Upprepa genom att tvätta kolven igen med ytterligare 10 ml agsNSC bassubstratets + 5% FBS och kombinera med första tvätten.
- Centrifugera cellerna vid 150 xgi 6 minuter som beskrivs ovan. Efter centrifugeringen bör cellerna bildar en ren lös pellet. Aspirera neutraliseras trypsin och medium från centrifugröret och återsuspendera cellpelleten i 10 ml (per T-75 kolv) av förvärmda agsNSC bassubstratets + 5% FBS genom att försiktigt pipettera upp och ned 2X med en 10 ml pipett. Utför ett celltal som beskrivs nedan.
4. Standard Beräkning för plätering av celler
- Använd aseptisk teknik, snurra cellsuspension och överföra 15 mikroliter av cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 15 mikroliter av 0,4% Trypan Blue. Blanda försiktigt och belastning 10 mikroliter cellsuspension till var och en av kamrarna i ett rent hemacytometer som en klar linje räknekammare (katalog # 1490: Hausser Scientific http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm ).
- Räkna minst 4 kvadranter på hemacytometer. De blå celler som är positiva för Trypan Blå är döda och ska inte räknas. För exakt blodkroppar, bör det optimala antalet celler per kvadrant vara 25-75 celler.
- Efter att ha räknat cellerna, beräkna genomsnittet av de fyra kvadranter. Multiplicera det genomsnittliga celltal med 10.000 och med utspädningsfaktorn (2 om du använder de rekommenderade volymer) för att fastställa antalet celler per ml. Observera att om totala andelen lönsamheten är lägre än 92% kan det finnas flera orsaker. En orsak till låga lönsamheten kan vara över trypsinization innan trypsin neutralisering med FBS. En annan orsak kan vara att koncentrationen av serum (FBS) till trypsin är för lågt och cellerna fortsätter att vara trypsinized. För det tredje kan cellerna har varit för konfluenta, vilket stamceller att differentiera beroende på cell-cell kontakt, vilket leder till skada under trypsinization. Om denna metod är noga följt en avkastning på 3 eller fler dubbleringar kan förväntas, vilket ger en befolkning på> 4 miljoner celler från en första grupp av ~ 500 tusen.
5. Inympning av annan Expansion kolv
- Att fastställa det totala antalet celler som krävs för att inympa ett fartyg, multiplicera den önskade sådd densitet (6600 celler per cm 2 eller 500 tusen celler per T-75 kolv) av ytan (i cm 2) av det fartyg som skall inokuleras. Om ympa fler än ett fartyg multiplicera antalet celler per fartyg med det totala antalet fartyg. För att bestämma volymen (ml) cellsuspension som behövs för att ympa varje fartyg, dividera antalet celler som krävs för att inympa ett fartyg med antalet livskraftiga celler / ml i cellsuspension. Om ympa fler än ett fartyg beräkna den totala volymen av cellsuspension behövs genom att multiplicera volymen som behövs för ett fartyg med det totala antalet fartyg som skall inokuleras.
- Centrifugera önskad volym av celler i agsNSC bassubstratets + 5% FBS och lämnar en lös pellet. Normalt 500.000 celler förs till en total volym på 25 ml i agsNSC bassubstratets 5% FBS som beskrivits tidigare. Aspirera vätska och återsuspendera lös pelleten i 10 ml agsNSC Expansion Medium Denna extra centrifugering steg krävs för att ta bort FBS före inokuleringen. Tillsätt 10 ml av förvärmda agsNSC Expansion Medel till T-75 kolven. Tillsätt 10 ml återsuspenderad cellsuspension till T-75-kolv tillsätt sedan 40 mikroliter av RH FGF-basic till kolven. Anser att trypsinization och ympning bör ta längre tid än 1,5 timmar när man beslutar det maximala antalet flaskor att arbeta med samtidigt. Man bör också ha tillräckligt med material för fullständig media ändringar om du använder flera flaskor.
- Skaka kolven från sida till sida att fördela cellerna och placera odlingskärl i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator, som beskrivits tidigare.
6. Spädning av celler för Inokulering av brunnar för differentiering
- Eventuella flera väl formatet kan användas, men ympning på BD Biocoat poly-L-lysin belagda 96 brunnar är described här. Bestäm volymen av cellsuspensionen behövs för experimentet genom att multiplicera antalet brunnar som skall inokuleras med 0,2 ml per brunn för en 96 med flera brunnar och lägga ca 10% för att täcka eventuella förluster i volym under inokulationen. Beräkna utspädning till en cell densitet på 75.000 celler / ml. Fastställa beloppet för FBS som ska läggas till differentieringen Medel för att nå en slutlig koncentration på 2% FBS (tabell 1). Blanda FBS och-differentiering Medium. Blanda försiktigt cellerna med den beräknade volymen Differentiering Medium med FBS. (Notera: Under centrifugeringen cellerna är i agsNSC bassubstratets + 5% FBS Medan FBS skyddar celler under centrifugeringen och underlättar celladhesion FBS hämmar differention späda FBS till 2% kommer att möjliggöra vidhäftning av celler till flera bra yta... Den 2% FBS är sedan spädas ytterligare främja differentiering. ingår också i Differentiering Medium för att främja differentiering Insulin-Transferrin-selen (ITS-E).
- I en biosäkerhet skåp och dispensera 200 uL av utspädd cellsuspension från en steril Combitip reservoar i varje brunn på en poly-L-lysin belagda 96-brunnar med hjälp av en flerkanals pipett och stora tips öppning. Inkubera plattorna i 1,5-2 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2. När cellerna har bifogat, efter cirka 90 till 120 minuter, försiktigt bort 50% (100 mikroliter till 96-brunnar) av mediet från varje brunn med hjälp av stora tips öppning pipett. Sätt på volymen tas bort med varmt agsNSC Differentiering Medium, igen med stora tips öppning pipett. (Användning av standard öppning tips kan skada celler).
- Två dagar efter inokulering (~ 48 timmar), utför en 50% medelstora förändring med agsNSC Differentiering Medelstora och stora munstycken pipettspetsar.
7. Underhåll av nervceller
- Förbered Neuronal Underhåll Medium med NeuraLife, glutamin och B27 enligt anvisningarna. Neuronal Underhåll Medium bör vara beredd vecka.
- Två dagar efter den sista agsNSC Differentiering Medium förändring, normalt Dag 4 inlägg ympning, gör en 50% medelstora utbyte med Neuronal Underhåll Medium.
- Fortsätta att utföra 50% medelstora ersättare med Neuronal Underhåll Medium var 2 till 3 dagar. Neuronala processer bör visas inom några dagar att byta till neuronal Underhåll Medium. Cellerna bör användas inom 3 veckor efter att överföras till Neuronal Underhåll Medium. Nervceller kan identifieras med hjälp av ett antal kommersiellt tillgängliga neuronala markörer. Astrocyter kommer också alltid iakttas.
- Kultur populationer uttrycka vanligtvis en mer än 40% andel av nervceller till det totala antalet celler. Användningen av neuron underhåll andra medier än NeuraLife kan ge sämre celler som inte ser morfologiskt mogna och kan inte överleva så länge i kulturen.
8. Representativa resultat:
Det arktiska jordekorre vuxna neurala stamceller kommer att fortsätta att fördubblas var 24 timmar för 3 till 5 dagar i minst två passager när seedade på 500,000-600,000 cells/75mm kolv. Dessa celler kan lätt skilja med avskaffandet av basicFGF och B27 samt närvaron av 1-2% FBS och 1% insulin / Transferrin / Selen, och blir TUJ1 (Covance) positiva nervceller inom 14-21 dagar (se figur 2). Förhållandet mellan nervceller till totalt celler kommer att variera mellan 40-60%, beroende på ålder kultur (Figur 3). Nervceller kan utnyttjas för experiment från 12 dagar efter sådd genom minst 21 dagar efter sådd.
Figur 1. Photomicrograph av AGS vuxna hippocampus neurala stamceller.
Fas photomicrograph av AGS vuxna hippocampus neurala stamceller efter 3 dagar på tillväxten i agsNSC basala media i poly-L-Ornithine belagda kolvar. Fördubbling inträffar ungefär var 24 timmar. Foto vid 100X förstoring.
Figur 2. Fluorescerande mikroskop av differentierade AGS vuxna hippocampus neurala stamceller
AGS neurala stamceller utsattes för differentiering media för 4 dagar, sedan hållas i Neuralife för ytterligare 17 dagar före fastställande. Celler har fastställts med 4% paraformaldehyd och nervceller identifieras med hjälp TUJ1 primära antikroppen (Covance) och Alexa Fluor 568 sekundär antikropp (grön) från Invitrogen. Hoechst färg 33.343 inkom färga alla kärnor (blå). Mobilnummer, neuron nummer och neuron kvoten bestämdes med neurite utväxt programvara och Arrayscan instrumentet från Cellomics. Detta foto representerar cirka 57% neuroner. 10x förstoring
Figur 3. Neuron siffror och Neuron Förhållandet Differentierade AGS neurala stamceller vid trekultur åldrar
AGS neurala stamceller utsattes för differentiering media för 4 dagar, sedan hållas i Neuralife för 12, 15 och 17 dagar före fastställande. Celler var fasta och nervceller identifieras med TUJ1 primära antikroppen (Covance). Hoechst färgen lades till färga alla kärnor för total cell identifiering. Mobilnummer, neuron antal och procent neuron kvoten bestämdes med hjälp av neurite utväxt programvara och Arrayscan instrumentet från Cellomics. Värden representerar medelvärdet av 15 brunnar per skick + SD.
Tabell 1. Prov beräkningar används i passaging och sådd
- Använda 700.000 celler / ml cellsuspensionen
- Med hjälp av en celltäthet på 75.000 celler / mL eller 15 tusen celler per brunn 0,2 ml volym i varje brunn.
- Ympa 96 brunnar på 0,2 ml per brunn = 19,2 mL eller önskad slutlig volym 21 ml.
- (Slutlig koncentration x slutlig Volym) ÷ ursprungliga koncentrationen = ursprunglig volym
(21 ml x 75 tusen celler / ml) ÷ 700 tusen = 2,25 ml - Volym av FBS i cellsuspension. 2,25 ml = 2,25 ml x 0,05 = 0,1125 ml
- Volym av FBS behövs i 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml
- Volym av FBS att lägga till en differentiering Medium = 0,42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 ml
- Volym av Differentiering Medium = 21 ml - 2,25 ml cellsuspension - 0,3075 ml 5% FBS = 18,44 ml.
- Kombinera 18,44 Medium mL Differentiering med 0,308 mL FBS och tillsätt 2,25 ml cellsuspension.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AGS vuxna neurala stamceller är robusta och kan byggas ut för många ställen vilket gör dem ett utmärkt källa av neurala stamceller för studier av grundläggande neurala egenskaper stamceller. Utbyggnaden är cirka en fördubbling varje dygn, men dessa celler måste passerats innan det når sammanflödet eftersom kontakt mellan cellerna kommer att främja differentiering till astrocyter. Kontakt-medierad differentiering kommer därför att leda till att förhållandet mellan nervceller till total mobilnummer sjunka drastiskt, om differentiering börjar före trypsinization och passage. Figur 1 visar en AGS neurala kultur stamceller som bör passerats inom 24 timmar.
AGS neurala stamceller följa starkt till poly-L-lysin belagda Biocoat tallrikar och FBS kan reduceras till 1% inom 90 minuter utan att cellerna lyft. Eftersom FBS och rhFGFbasic tas bort, kommer cellerna differentiera till ungefär halv neuroner och astrocyter halv. Nervceller kommer att TUJ1 positivt inom två veckor (Figur 2) och MAP2 positiva inom tre veckor efter induktion (om NeuraLife Medium används). En mer fullständig karakterisering av receptorer uttryck och funktion mogna nervceller pågår. TUJ1 och MAP2 uttryck är kännetecknande för neuronala stamceller som är engagerade i en neuronal öde men behåller mitotiska aktivitet 10.
Svar på hypoxi eller syrgas glukos deprivation (OGD) förändringar mellan 2 och 3 veckor i kulturen. Samtidigt kan antalet av nervceller minskar efter 16 dagars odling (4 dagar av differentiering och 12 dagar av underhåll) den andel av nervceller till total celler kvar nära 50% (Figur 3). Icke desto mindre, hypoxi eller OGD tillämpas vid 12 till 19 dagar efter sådd kan inducera neurogenes i dessa kulturer av TUJ1 uttrycka nervceller. Inducerad neurogenes verkar vara en mekanism genom vilken dessa celler motstå skador observerades i differentierade mänskliga neurala stamceller som utsätts för liknande förolämpningar (under utarbetande). Bättre förståelse av mekanismerna bakom hypoxi och OGD-inducerad neurogenes i AGS neuronala kulturer kan leda till utveckling av nya terapier för behandling av stroke, hjärtstillestånd och demens med begränsad blodtillförsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JA Kelleher-Andersson är grundare av Neuronascent och är uppfinnaren om Arktis patentansökningar jordekorre applikationer. Neuronascent erhåller royalties på försäljning av AGS medier och stamceller. RC McGee är anställd av Lifeline, Inc. som distribuerar media och AGS neurala stamceller.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av US Army Medical Research och Materielverk bevilja # 05178001 och NS041069-06 från The National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke. Vi tackar Joel Vonnahme för värdefulla synpunkter på protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agsNSC | Lifeline Cell Technology | FC-0004 | |
| agsNSC Expansion kit | Lifeline Cell Technology | LL-0008 | Alternative source for DMEM/F12, B27 and rhFGFb (www.invitrogen.com) |
| agsNSC differentiation kit | Lifeline Cell Technology | LL-0009 | Alternative source for DMEM/F12 and ITS-x (www.invitrogen.com) |
| NeuraLife maintenance media kit | Lifeline Cell Technology | LL-0012 | Alternative sources are NeuraBasal (LifeLine) or Neurobasal (in vitrogen), glutamine and B27 (www.invitrogen.com)Differentiated cells are maintained for up to 3 weeks in NeuroLife, but no more than 2 weeks in Neurobasal (www.invitrogen.com) |
| Micrometer (such as a Bright Line Counting Chamber) | Hausser Scientific | 1490 | http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm |
| Biocoat Poly-L-Lysine coated 96 well plates | BD Biosciences | 356516 | www.bdbiosciences.com |
| Large orifice pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-141 | Avoids neuronal cell damage when pippetting. http://www.fishersci.com |
References
- Barnes, B. M. Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator. Science. 244, 1593-1595 (1989).
- Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37, 1261-1265 (2006).
- Dave, K. R. Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel. J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).
- Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).
- Christian, S. L. Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).
- Jin, K. Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).
- Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).
- Sung, S. M. Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells. Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).
- Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).
